Avaliação do potencial antioxidante da couve tronchuda em culturas de hepatócitos primários de rato

Os ensaios de avaliação de actividade antioxidante realizados em sistemas químicos não reflectem as condições fisiológicas celulares e não têm em linha de conta a bio-disponibilidade e metabolismo dos extractos estudados.

Além disso, os mecanismos de acção dos antioxidantes nas células não se limitam à captação de espécies reactivas, ao contrário dos ensaios químicos (186, 187). Algumas das consequências do stress oxidativo nas células encontram-se esquematizadas na Figura 35 (188). H2O2 _O 2 . - ._OH ._NO Stress oxidativo

Modificação oxidativa de macromoléculas

ADN Lipídos Proteínas

Mutação Sensores Redox

Necrose Apoptose Proliferação Adaptação (indução de antioxidantes e de enzimas de stress)

Perda ou diminuição de funções

Activação de factores de transcrição Activação de cinases ONOO- Peroxidação lipídica H2O2 _O 2 . - ._OH ._NO Stress oxidativo

Modificação oxidativa de macromoléculas

ADN Lipídos Proteínas

Mutação Sensores Redox

Necrose Apoptose Proliferação Adaptação (indução de antioxidantes e de enzimas de stress)

Perda ou diminuição de funções

Activação de factores de transcrição Activação de cinases

ONOO-

Peroxidação lipídica

Figura 35. Consequências do stress oxidativo numa célula [adaptada de (188)].

Dada a importância do fígado nos processos de biotransformação de xenobióticos, e os elevados níveis de stress oxidativo a que as suas células podem estar sujeitas, os hepatócitos, em suspensão ou em cultura, são um modelo relevante para a avaliação do potencial antioxidante de extractos em sistemas celulares. A cultura celular tem algumas vantagens relativamente às suspensões, uma vez que os hepatócitos têm tempo de recuperar do stress induzido durante o isolamento, podem ser mantidos por períodos mais longos e podem estudar-se efeitos de compostos que requerem a

_______________________________________________________________ Introdução

85 organização das células (187, 188). Tipicamente, os ensaios in vitro permitem responder a questões ao nível celular e molecular (toxicologia mecanística) (189).

O modelo de cultura de hepatócitos primários de rato tem sido usado por muitos autores para avaliar a hepatoprotecção de extractos de plantas, usando substâncias modelo para induzir stress oxidativo entre as quais o t-butilidroperóxido (t-BOOH), etanol, tetracloreto de carbono (CCl4) e o H2O2 (190-194). O paraquato (PQ) também é um modelo comum usado em culturas celulares (195). Estes compostos têm diferentes mecanismos de toxicidade, mas pensa-se que todos exercem os seus efeitos induzindo stress oxidativo.

Tem-se verificado que os extractos vegetais ou alguns dos seus componentes podem ser protectores ou tóxicos, dependendo das concentrações de extracto utilizadas, das células estarem ou não sujeitas a stress e do tipo de stress induzido (196). Os extractos de plantas ricos em compostos polifenólicos demonstram quase sempre ser hepatoprotectores. Por exemplo, o extracto de alcachofra (Cynara scolymus), rico em ácido cafeico, ácido clorogénico, cinarina e cinarósido reduz a peroxidação lipídica, a perda de GSH e morte celular em hepatócitos expostos ao t-BOOH e ao H2O2, o mesmo se verificando para cada um dos constituintes atrás mencionados (190, 197). Os extractos aquosos de Euonymus alatus protegem os hepatócitos contra os danos induzidos pelo H2O2 (192), os extractos da pele de ameixa preta indiana (Syzygium

cumini), ricos em antocianinas, protegem os hepatócitos contra o CCl4 e aumentam a actividade da GPx (194) e os extractos de avelãs e nozes (aquosos, metanólicos e lipofílicos, usando o etilacetato como solvente) protegem os hepatócitos contra a toxicidade do H2O2, (com excepção do extracto lipofílico de avelã) (191).

Contudo, nem sempre os extractos têm o efeito protector esperado: um extracto de D. pinnatifida não demonstrou ter efeito protector em hepatócitos tratados com t- BOOH, etanol, CCl4 e lipopolissacarídeo (LPS) (193). No mesmo trabalho Rodeiro e os seus colaboradores testaram outros extractos (Mangifera indica, Erythroxylum minutifolium, Erythroxylum confusum, Thalassia testudinum e Dictyota pinnatifida) e também mangiferina, o fenol maioritário do extracto de M. indica, tendo verificado um efeito protector variável, dependendo do agente agressor e do extracto testado.

Nos ensaios realizados com compostos fenólicos, também se observa que estes, por si só, podem ser citotóxicos para as células, quando se utilizam concentrações elevadas. As catequinas presentes no chá preto podem ser citotóxicas, provavelmente por alterarem o potencial da membrana mitocondrial e por levarem à formação de ROS (198), a quercetina pode ligar-se ao ADN, (199) e o próprio campferol, em concentrações na ordem de 1 mM causa citotoxicidade aos hepatócitos ao fim de 2 horas de exposição (177).

Introdução _____________________________________________________________________________

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Para avaliar os efeitos protectores dos extractos de couve tronchuda nos hepatócitos, escolheu-se como agente indutor de stress oxidativo o PQ. Os ciclos de oxidação-redução do paraquato levam à produção de O2·- (Figura 36) que, se não for captado, pode originar danos celulares. Além disso, o consumo de NADPH pelas diaforases celulares na redução do catião PQ2+ ao catião radicalar PQ.+ pode impedir processos bioquímicos importantes dependentes deste redutor (200).

Figura 36. Ciclo Redox do Paraquato. A. Diaforases celulares

Os extractos com potencial antioxidante podem impedir os danos causados pelo PQ nas células. A avaliação de parâmetros de viabilidade celular, como a LDH (lactato desidrogenase), parâmetros dependentes do estado redox da célula como o ATP e a glutationa e a peroxidação lipídica e também a acção do extracto na via de sinalização do NFkB, permitirá avaliar a capacidade de protecção dos extractos de couve tronchuda.

________________________________________________________________ Objectivos

87 3. OBJECTIVOS DA DISSERTAÇÃO

1. Caracterização do perfil metabólico de B. oleracea var. costata (couve tronchuda) usando extractos aquosos obtidos por decocção. As partes da planta a caracterizar constituem as sementes, as plântulas (sementes germinadas), as folhas internas, as folhas externas e as inflorescências. As classes de compostos a caracterizar são:

1.1. Compostos polifenólicos 1.2. Ácidos orgânicos

Para além destas classes, nos extractos de folhas internas e de folhas externas, que são as partes da planta habitualmente consumidas, pretende-se ainda caracterizar:

1.3. Aminoácidos livres

1.4. Compostos voláteis (isotiocianatos, terpenóides, norisoprenóides e compostos derivados dos ácidos gordos)

2. Avaliação de variações no perfil de compostos atrás referidos dos extractos de folhas internas e de folhas externas de couve tronchuda com:

2.1. Regime de fertilização (sem fertilizantes, fertilização biológica, fertilização convencional)

2.2. Época de colheita

3. Caracterização do perfil polifenólico de rebentos caulinares de couve tronchuda obtidos por micropropagação, usando extractos aquosos. Avaliação do efeito da utilização de diferentes meios de cultura e fitoreguladores neste perfil.

4. Avaliação da capacidade de sequestração e de biotransformação de compostos polifenólicos pela larva de P. brassicae, alimentada com couve tronchuda, através da caracterização de extractos aquosos de larva, obtidos por decocção.

5. Avaliação do potencial antioxidante das matrizes atrás referidas, usando as espécies DPPH, superóxido, hidroxilo, ácido hipocloroso, óxido nítrico e peroxinitrito.

6. Avaliação da actividade antimicrobiana de um extracto aquoso de inflorescências de couve tronchuda.

Objectivos ________________________________________________________________

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7. Avaliação da hepatoprotecção de um extracto aquoso de folhas externas de couve tronchuda em hepatócitos primários de rato expostos ao paraquato.

PARTE II