C ARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA S ERICINA OBTIDAS NAS EXTRAÇÕES As soluções de sericina (SS), obtidas pelos diferentes métodos de

extração, foram caracterizadas quanto ao teor de proteína pela metodologia de Bradford ou pela metodologia de Kjedahl. A massa molecular dos peptídeos formados, em alguns casos, foi determinado por eletroforese SDS-PAGE. As sub-Seções a seguir descrevem as metodologias e os fundamentos dessas técnicas.

Essas soluções também foram caracterizadas quanto diâmetro hidrodinâmico dos agregados protéicos presentes em solução, antes da reticulação da proteína. A técnica utilizada nesse caso foi a Espectroscopia de Correlação de Fótons (PCS), descrita na Seção 4.2.9.1.

4.2.6.1.DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DA SERICINA EM SOLUÇÃO Foi determinada a massa molecular das soluções de sericina obtidas da extração dos fios: (i) com carbonato de sódio em banho termostático à 900C; (ii) a 350C, ambas armazenadas em pH básico durante 30 dias; (iii) com água a 1200C (iv) com carbonato de sódio a 900C, e pH ajustado para a neutralidade logo após a extração.

As placas para eletroforese foram preparadas com géis de acrilamida nas concentrações 7,5 e 10%. As amostras foram diluídas com tampão de desnaturação até concentração entre 0,1-1,0mg;/mL, e em seguida foram adicionadas duas gotas de glicerol. A mistura foi agitada e aquecida por 5-7 minutos à 1000C. Os marcadores foram preparados da mesma forma.

As placas foram preenchidas com os géis de separação e de concentração. Colocou-se o tampão de corrida nas cubas e injetou-se 5- 12mL de amostra em cada poço. A corrida eletroforética foi realizada sob

tensão de 180 V, durante aproximadamente 60 minutos e a revelação dos géis foi feita através de coloração com nitrato de prata/ditiltrietol.

A eletroforese é um método relacionado com a migração de partículas carregadas em um determinado meio, sob a influência de uma diferença de potencial. Nos dias atuais, a eletroforese de proteínas e peptídeos é muito desenvolvida em meios gelatinosos como gel de poliacrilamida e gel de agarose (Junior, 2001). A eletroforese permite a determinação de propriedades cruciais de uma proteína como seu ponto isoelétrico e massa molecular aproximada.

Na eletroforese, a força que move a macromolécula é o potencial elétrico (E). A mobilidade eletroforética da molécula (µ) é a relação entre a velocidade da partícula (V) e o potencial elétrico. A mobilidade eletroforética é também, igual à carga líquida da molécula (Z) dividida pelo coeficiente de fricção (f). Assim:

µ = V/E = Z/f

A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida funciona como uma peneira molecular, reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporção aproximada à massa molecular.

O SDS (dodecilsulfato de sódio) é um detergente que se liga à maioria das proteínas, adicionando grande quantidade de carga negativa e tornando insignificantes as cargas intrínsecas da proteína. A conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioria adquire a mesma forma geométrica, tornando-se muito semelhantes entre si e, por essa razão, passam a ter a mesma relação entre a carga elétrica e a massa. Assim, a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente pela massa molecular, com os peptídeos menores migrando mais rapidamente. Depois de realizada a eletroforese as proteínas são visualizadas pela adição de um corante, como o Coomassie Blue (Lehninger, 2003).

4.2.6.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA NA SS PELA METODOLOGIA DE

BRADFORD

A determinação do teor de proteína por essa metodologia envolveu inicialmente a preparação do Reagente de Bardford e da curva de calibração para o microensaio foi feita com a proteína BSA (Bovine Serum Albumin).

As amostras de sericina extraídas da seda foram adequadamente diluídas (concentração máxima 0,1 mg/mL) e em seguida cerca de 1000 µL do reagente de Bradfoord foram adicionados a 100 µL dessa amostra. Após homogeneização, aguardou-se aproximadamente 10 minutos e foi feita a leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 595 nm. As concentrações foram determinados através da curva de calibração da proteína BSA e os resultados expressos em mg/mL, em relação à proteína BSA. Todas as amostras foram analisadas em triplicata.

Esse método trata-se uma técnica espectrofotométrica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” BG-250. A ligação do corante com a proteína causa uma mudança na absorção máxima do corante de 365 para 595 nm. Baseia-se na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alta massa molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.

A falta de linearidade na lei de Beer-Lambert tem sido observada devido a uma variação do pH quando da adição da amostra ao reagente BG-250. Existem poucas substâncias, citadas na literatura, que são interferentes no método de Bradford. Estes interferentes normalmente reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbância. (Zaia, 1998)

4.2.6.3. DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO TOTAL NA SS PELA METODOLOGIA DE

KJEDAHL

Para determinação do teor de nitrogênio pela metodologia de Kjedahl utilizou-se Unidade de Digestão K-424 na fase de digestão, Scrubber B- 414: para captação os gases liberados no processo de digestão e Unidade de destilação B-324 na fase de destilação, todos da marca BUCHÜ

A cada tubo digestor foram adicionados 0,5 g de amostra, 10 g de mistura catalítica (sulfato de potássio e sulfato de cobre) e 20 mL de ácido sulfúrico concentrado. O tubo foi então colocado na Unidade Digestora à 4500C, por cerca de 1 hora, até a solução tornar-se clara. Durante a digestão os vapores de ácido sulfúrico são neutralizados na unidade Scrubber. Após resfriamento à temperatura ambiente, conectou-se o tubo digestor com a amostra na Unidade de Destilação.

Em um erlenmeyer de 500 mL adicionou-se 30 mL de solução receptora de N (ácido bórico + azul de metileno + vermelho de metila), onde foi mergulhada a extremidade afilada do condensador.

Procedeu-se então o programa de destilação: o equipamento adicionou 60 ml de solução aquosa de ácido bórico 20% (m/v) no erlenmeyer contendo a solução receptora, em seguida adicionou 60 mL de água destilada e 80 mL de solução aquosa de NaOH 32% (m/m), no tubo digestor contendo a amostra. O equipamento realizou um pré- aquecimento do sistema e iniciou a destilação, conforme programação.

Retirou-se o erlenmeyer da unidade de destilação e titulou-se a amostra com solução de ácido sulfúrico 0,1 N, até ocorrer mudança da coloração de verde para rosa.

Os cálculos para se encontrar o teor de nitrogênio e proteína foram feitos através das equações 05 e 06, respectivamente:

(

)

(

)

V= Volume da solução de ácido sulfúrico 0,1 N gasta na Titulação fc = fator de correção da solução de ácido sulfúrico 0,1 N

F= Fator de conversão de Nitrogênio para proteína, (para a sericina = 6,5) m= massa da amostra (g).

Na presença de H2SO4 e dos catalisadores (K2SO4 e CuSO4), os

nitrogênios de aminas presentes na maioria sos materiais orgânicos são convertidos em sulfato de amônia [(NH4)2SO4]. Amônia livre e amônica

ligada ao nitrogênio são também convertidas a (NH4)2SO4 . A amônia é

destilada a partir de um meio alcalino, fixada em solução de ácido bórico e titulada com ácido sulfúrico 0,1N.