UNIVERSIDADE
ESTADUAL
DE
CAMPINAS
FACULDADE
DE
ENGENHARIA
QUÍMICA
ÁREADECONCENTRAÇÃO
DESENVOLVIMENTODEPROCESSOSBIOTECNOLÓGICOS
D
ESENVOLVIMENTO
T
ECNOLÓGICO
D
A
E
XTRAÇÃO
D
A
S
ERICINA
E
P
REPARAÇÃO
D
E
N
ANOPARTÍCULAS
P
ARA
A
PLICAÇÃO
E
M
C
OSMÉTICOS
FARM.AMANDA GOMES MARCELINO
AUTORA
PROFA DRA MARIA HELENA ANDRADE SANTANA
ORIENTADORA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA À FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM ENGENHARIA QUÍMICA
CAMPINAS -SÃO PAULO
A
GRADECIMENTOSEsse trabalho contou com a colaboração de muitas pessoas com as quais tive o prazer de conviver e aprender muito durante esses anos.
Agradeço principalmente à professora Maria Helena, pela sua orientação, apoio, incentivo e dedicação.
Agradeço à equipe da empresa Chemyunion, especialmente à Carmen, Cecília, Marcos e Márcio, pelas discussões que contribuíram com o desenvolvimento deste trabalho.
Agradeço ao Prof. Dr. César Costapinto Santana por ter disponibilizado o uso do equipamento Autosizer® 4700 em seu laboratório.
Agradeço ao professor Prof. Dr. Nelson Durán, por ter disponibilizado o ZetaSizer Nano® em seu laboratório.
Agradeço à empresa Evic Brasil pela utilização do Glossmetter e do Colorímetro nos ensaios em mechas de cabelos.
Agradeço ao Laboratório de Recursos Analíticos e de Calibração da Faculdade de Engenharia Química.
Agradeço à Profa. Dra. Marisa Beppu por ceder os fios de seda no início deste trabalho.
Agradeço aos meus colegas da Unicamp: Aline, Amós, André, Andréa, Beatriz, Carla, Danilo, Luciana, Lucimara Lopes, Lucimara Torre, Pablo, Patrícia, Reinaldo, Silas, Sônia, Thaís e Viviane pela amizade e pelos bons momentos que passamos. Agradeço especialmente ao Gilson pela pronta disposição em nos auxiliar no dia-a-dia do laboratório.
Agradeço à Deus por me conceder a oportunidade de realizar esse trabalho, à minha família por sempre me apoiar em todas as minhas escolhas e ao Ivan, por me incentivar a seguir este caminho e me apoiar durante todo ele.
Agradeço à Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e à Chemyunion Química Ltda. pelo apoio financeiro.
R
ESUMOEste trabalho apresenta o desenvolvimento de nanopartículas de sericina para aplicação no tratamento cosmético dos cabelos. As nanopartículas foram obtidas a partir de soluções de sericina previamente extraídas de casulos ou fios de seda e formadas através de complexação eletrostática com goma guar. A superfície das nanopartículas foi modificada através da incorporação de agentes tensoativos catiônicos, com a finalidade de conferir-lhe densidade de carga positiva adequada para a adsorção aos fios de cabelo. O processo de produção envolveu as etapas de extração da sericina dos casulos ou fios de seda, reticulação, e modificação da superfície das nanopartículas. A extração foi realizada em autoclave ou a pressão atmosférica, utilizando água ou solução de carbonato de sódio como solventes. Durante a complexação foi estudada a influência da utilização de diferentes concentrações goma guar quaternizada, assim como a forma de adição desse agente, que foi feita em pó e em solução aquosa. A modificação na superfície das partículas foi feita com os tensoativos catiônicos cloreto de cetiltrimetil amônio (CTAC) e cloreto de behenyltrimetil amônio (BTAC), isoladamente e em mistura a diferentes proporções. A incorporação dos tensoativos catiônicos foi feita na presença dos eletrólitos resultantes da extração ou após separação das nanopartículas através de precipitação com etanol e posterior ressuspensão em água. Os efeitos foram analisados em termos de rendimento dos processos, tamanho das nanopartículas e potencial zeta. O poliquaternium 7, um derivado de amônia quaternária, foi adicionado à suspensão de nanopartículas como agente de viscosidade. Os resultados obtidos mostram a factibilidade da produção de nanopartículas de sericina com propriedades sensoriais promissoras para o condicionamento de cabelo danificado. O processo de produção é simples, escalonável e de fácil transferência para o setor industrial.
A
BSTRACTThis work presents the development of sericin nanoparticles applied to the cosmetic treatment of hair. The nanoparticles were obtained from sericin solutions, previously extracted from cocoons or silk yarn, and formed through electrostatic complexation with guar gum. The surface of the nanoparticles was modified through the incorporation of cationic surfactant agents, in order to obtain positive charge density, suitable for the adsorption on the hair surface. The production process involved the steps of sericin extraction from the cocoons or silk yarn, complexation and modification of the nanoparticles surface. The extraction was performed in autoclave and atmospheric pressure, using water or an aqueous solution of sodium carbonate as solvents. During the complexation was studied the effect of different concentrations of guar gum, as well as how to add this agent, which was made in powder and in an aqueous solution. The surface modification of particles was made with the cationic surfactant cetiltrimetil ammonium chloride (CTAC) and behenyltrimetil ammonium chloride (BTAC), alone and in combination with different proportions. The incorporation of cationic surfactant was made in the presence of electrolytes, resulting from the extraction, or after separation of the nanoparticles by precipitation with ethanol and resuspended in water later.
The effects were analyzed in terms of efficiency of processes, nanoparticle size and zeta potential. The poliquaternium 7, a quaternary ammonium derivative, was added to the nanoparticles suspension as a viscosity agent. The results show the feasibility of output of sericin nanoparticles with promising sensory properties for the conditioning of damaged hair. The production process is simple, scalable and easy to transfer to the industrial sector.
S
UMÁRIO
1. Introdução ... 1
2. Objetivos ... 4
3. Revisão Bibliográfica ... 5
3.1. A Seda ... 5
3.1.1. Origem e disseminação da sericicultura ... 5
3.1.2. Composição da seda ... 7
3.1.3. Aplicação na Indústria de Fiação ... 9
3.2. A sericina ... 10
3.2.1. Extração e Separação... 10
3.2.2. Propriedades Físico-Químicas... 16
3.2.3. Aplicações... 18
3.3. Nanopartículas... 20
3.4. Nanopartículas para aplicação em cosméticos... 22
3.5. Preparação de partículas de proteína através da formação de Complexos de Polieletrólitos (PECs) ... 25
3.6. Estabilidade das nanopartículas ... 30
3.6.1. Secagem por atomização ... 31
3.6.2. Liofilização ... 32
3.7. O Cabelo Humano ... 33
3.8. Condicionamento dos cabelos ... 35
3.8.1. Agentes Condicionantes dos Cabelos ... 36
3.8.1.1. Goma Guar Quaternizada (JaguarC13 ®) ... 36
3.8.1.2. Cloreto de Cetiltrimetil amônio e Cloreto de Behenyltrimetil amônio ... 38
3.8.1.3. Poliquaternium 07 ... 39 4. Materiais e Métodos... 40 4.1. Materiais ... 40 4.2. Métodos ... 40 4.2.1. Extração da Sericina ... 40 4.2.1.1. Matéria-prima ... 42 4.2.1.2. Extração em autoclave... 43
4.2.1.3. Extrações sob pressão atmosférica ... 44
4.2.1.3.1. Extração em banho termostático... 44
4.2.1.3.2. Extração em Tanque agitado ... 45
4.2.1.3.3. Extração em coluna de recheio... 45
4.2.1.3.3.1. Escalonamento do processo de extração em coluna de recheio ... 46
4.2.2. Produção das nanopartículas de sericina ... 48
4.2.2.1. Reticulação na presença de conservantes. ... 51
4.2.2.2. Secagem das nanopartículas... 51
4.2.3. Precipitação das nanopartículas de sericina com etanol ... 52
4.2.4. Formação de nanopartículas de sericina recobertas (NR)... 52
4.2.4.1. Recobrimento com cloridrato de arginina... 53
4.2.4.2. Recobrimento com BTAC e CTAC... 53
4.2.5. Adição de agente de viscosidade às nanopartículas de sericina recobertas ... 54
4.2.6. Caracterização da proteína Sericina obtidas nas extrações ... 55
4.2.6.1. Determinação da Massa Molecular da Sericina em solução... 55
4.2.6.2. Determinação do teor de proteína na SS pela metodologia de Bradford ... 57
4.2.6.3. Determinação de nitrogênio total na SS pela metodologia de
Kjedahl ... 58
4.2.7. Caracterização de nanopartículas ... 59
4.2.7.1. Diâmetro hidrodinãmico ... 59
4.2.7.2. Potencial Zeta ... 61
4.2.7.3. Morfologia das nanopartículas em solução... 62
4.2.7.4. Morfologia das nanopartículas de sericinna secas ... 63
4.2.8. Avaliação do efeito das nanopartículas de sericina recobertas em mechas de cabelos. ... 63
4.2.8.1. Análise de Brilho em mechas de cabelos ... 63
4.2.8.2. Análise de volume das mechas ... 64
4.2.8.3. Geração de imagens por microscopia eletrônica de varredura.... 65
5. Resultados e Discussão... 66
5.1. Extração da Sericina ... 66
5.1.1. Matéria-Prima ... 66
5.1. 2. Extração em autoclave... 66
5.1.3. Extração sob pressão atmosférica ... 68
5.1.3.1. Extração em banho termostático ... 69
5.1.3.2. Extração em tanque agitado ... 69
5.1.3.3. Extração em coluna de recheio... 71
5.1.3.4. Extração em coluna-Planta Piloto ... 73
5.2. Distribuição de Massa Molecular ... 75
5.3. Formação das nanopartículas de sericina e determinação do diâmetro hidrodinâmico... 77
5.3.1. Agregados protéicos e nanopartículas de sericina formadas com solução obtida da extração em autoclave ... 78
5.3.2. Agregados proteicos - extração com carbonato de sódio ... 80 5.3.3. Nanopartículas preparadas a partir de solução de sericina obtidas por extração em autoclave... 81 5.3.4. Nanopartículas preparadas com a sericina extraída em carbonato de sódio ... 83 5.3.4.1. Influência da goma guar quaternizada na formação das nanopartículas de sericina ... 83 5.3.4.2. Nanopartículas obtidas utilizando-se goma guar quaternizada em pó... 86 5.4. Precipitação das partículas de sercina com etanol ... 88 5.5.Caracterização das nanopartículas de sericina após recobrimento com materiais catiônicos ... 89 5.5.1.Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas com cloridrato de arginina... 89 5.5.2. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas com CTAC ... 92 5.5.3. Potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas com BTAC ... 94 5.5.4. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina recobertas com mistura de CTAC e BTAC ... 94 5.5.4.1. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas de sericina precipitadas com etanol e recobertas com mistura de CTAC e BTAC... 95 5.5.4.2. Diâmetro e potencial zeta das nanopartículas obtidas na solução de extração e recobertas com mistura de CTAC e BTAC... 97 5.6. Influência dos conservantes na formação das nanopartículas de sericina ... 103 5.7. Análise das partículas de sericina secas por atomização e por liofilização ... 104
5.7.1. análise da morfologia das partículas de sercina secas por
atomização e por liofilização ... 104
5.7.2. Diâmetro das partículas de sercina formadas pela ressuspensão dos pós em água ... 107
5.8. Morfologia das nanopartículas de sericina recobertas com ctac... 108
5.9. Análise dos fios de cabelos – eficácia do tratamento ... 108
5.9.1. Efeito de brilho em mechas de cabelos ... 108
5.9.2. Efeito de diminuição de volume em mechas de cabelos... 110
5.9.3. Imagens das fibras capilares analisadas por Microscopia Eletrônica de Varredura ... 112
6. Conclusões ... 114
7. Sugestões para trabalhos futuros ... 116
L
ISTA DE
F
IGURAS
Figura 1: (a) Lagartas construindo casulos (b) Casulo (c) Pupa no interior
do casulo (Brancalhão, 2005) ... 5
Figura 2: Metamorfose do inseto (Brancalhão, 2005) ... 6
Figura 3: Estrutura da fibroína constituída de folhas beta antiparalelas (Lehninger, 2003)... 8
Figura 4 Representação esquemática das nanocápsulas e nanoesferas poliméricas (Schaffazick et al, 2003). ... 22
Figura 5: Principais tendências nas interações entre proteínas e polissacarídeos (Ye, A., 2008) ... 26
Figura 6: Representação esquemática da estruturas "ladder-like" e do modelo "scrambled-egg”. Preto representa o maior poliíon (negativo) e cinza representa o poliíon de carga oposta (positivo). (a) mostra a representação "ladder-like" onde ocorre um pareamento insuficiente de íons em certas condições estequiométricas permitindo a formação de agregados insolúveis e PECs solúveis (b) mostra o modelo "scrambled-egg”, onde polímeros de tamanhos semelhantes se complexam formando PECs insolúveis sob certas condições (Hartig et al, 2007). ... 27
Figura 7: Etapas do processo de secagem por atomização (http://irtec1.irtec.bo.cnr.it/proc-spray-drying.htm, 2008)... 31
Figura 8: Liofilizador de bancada (www.liobras.com.br/biofreezer_l202_page.htm)... 33
Figura 9: (a) Esquema da estrutura da fibra capilar (b) Seção transversal da fibra capilar humana (Wei et al., 2005). ... 34
Figura 10: Estrutura Química da Goma Guar ... 37
Figura 11: Goma Guar Quaternizada - JaguarC13 ® ... 37
Figura 13: Estrutura molecular do Poliquaternium 07® (Monteiro et al, 2003)... 39 Figura 14: Representação esquemática do sistema utilizado para extração da sericina... 47 Figura 15: Estrutura molecular (a) ácido aspártico (b) Goma Guar Quaternizada (Material Técnico Phytophora, revendora Rhodia). ... 49 Figura 16:Identificação das camadas carregadas em torno de uma partícula (Malvern Instruments)) ... 62 Figura 17: Extração em coluna recheada com casulos secos ... 72 Figura 18: Eletroforese SDS –PAGE em gel acrilamida 7,5%. (M)Marcadores; (1)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e (2) Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 350C; (3) Solução obtida pela extração com água a 1200C; (4)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e ajustada para neutralidade (pH7) ... 76 Figura 19: Eletroforese SDS –PAGE em gel acrilamida 10%. (M)Marcadores; (1)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e (2) Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 350C; (3) Solução obtida pela extração com água a 1200C; (4)Solução obtida pela extração com Na2CO3 a 900C e ajustada para neutralidade (pH7). ... 76 Figura 20: Diâmetro médio dos agregados protéicos em diferentes temperaturas de extração (a) 1200C (b) 1240C (c) 1260C (Análise por intensidade de luz espalhada). ... 79 Figura 21: Distribuição de tamanho dos agregados protéicos obtidos por extração com solução Na2CO3 (Análise por intensidade de luz espalhada). ... 81 Figura 22: Diâmetro médio das nanopartículas obtidas a partir da sericina extraída nas temperaturas: (a) 1200C (b) 1240C (c) 1260C (Análise por intensidade de luz espahada). ... 82
Figura 23: Diâmetro das nanopartículas de sericina formadas com diferentes concentrações de goma guar quaternizada em solução (% m/v): (a) 0,002; (b) 0,004; (c)0,02; (d) 0,03; (e) 0,035; (f)0,04; (g)0,05; (h) 0,1; (i) 0,14 (Análise por intensidade de luz espalhada). ... 86 Figura 24: Diâmetro das nanopartículas de sericina formadas com diferentes concentrações de goma guar quaternizada em pó: (a) 0,03% (b) 0,035% e (c) 0,04% (Análise por intensidade de luz espalhada). ... 88 Figura 25: Diâmetro das nanopartículas de sericina recobertas com diferentes concentrações de Cloritdrato de arginina ((a) 0,1; (b) 0,25; (c)0,5; (d) 1,0; (e) 2,5; (f)5,0; (g)10,0 (Análise por intensidade de luz espalhada). ... 91 Figura 26: Diâmetro das nanopartículas de sericina (precipitadas com etanol) recobertas com CTAC à: (a) 0,1; (b) 0,25 (Análise por intensidade de luz espalhada)... 93 Figura 27: Diâmetro das nanopartículas de sericina (precipitadas com etanol) recobertas com mistura CTAC/BTAC nas concentrações à: (a) 0,2/0,8%; (b) 0,5/0,5% (c)0,8/0,2% (Análise em intensidade de luz espalhada). ... 96 Figura 28: Diâmetro das partículas recobertas com 0,2% de BTAC e 0,8% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 98 Figura 29: Diâmetro das partículas recobertas com 0,2% de BTAC e 1,5% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 98 Figura 30: Diâmetro das partículas recobertas com 0,2% de BTAC e 2,5% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 99 Figura 31: Diâmetro das partículas recobertas com 0,4% de BTAC e 1,6% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 99 Figura 32: Diâmetro das partículas recobertas com 0,4% de BTAC e 3,0% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 100
Figura 33: Diâmetro das partículas recobertas com 0,4% de BTAC e 5,0% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 100 Figura 34: Diâmetro das partículas recobertas com 0,6% de BTAC e 2,4% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 101 Figura 35: Diâmetro das partículas recobertas com 0,6% de BTAC e 4,5% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 101 Figura 36: Diâmetro das partículas recobertas com 0,6% de BTAC e 7,5% de CTAC (a) número (b) intensidade. ... 102 Figura 37: Diâmetro das nanopartículas de sericina formadas (a) antes e (b) depois da adição dos conservantes. ... 104 Figura 38: Morfologia das partículas de sericina, secas por spray, com as seguintes concentrações de goma guar (a) 0; (b) 0,03% (c) 0,035% e (d) 0,04%... 105 Figura 39: Morfologia das partículas de sericina, secas por liofilização, com as seguintes concentrações de goma guar (a) 0; (b) 0,03% (c) 0,035% e (d) 0,04%. ... 106 Figura 40: Nanopartículas de sericina recobertas com1% de CTAC ... 108 Figura 41: Porcentagem de aumento de brilho nos cabelos virgens tratados com Placebos (P) e com Nanopartículas de Sericina (N) em diferentes concentrações, onde (P1%) solução aquosa do placebo a 1%, (P3%) solução aquosa do placebo a 3%, (P5%) solução aquosa do placebo a 5%, (N1%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 1%, (N3%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 3%, (N5%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 5%... 109 Figura 42: Porcentagem de aumento de brilho nos cabelos danificados tratados com Placebos e com Nanopartículas de Sericina em diferentes concentrações, onde (P1%) mecha tratada com solução aquosa do placebo a 1%, (P3%) mecha tratada com solução aquosa do placebo a 3%, (P5%) mecha tratada com solução aquosa do placebo a 5%, (N1%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 1%, (N3%) dispersão
de nanopartículas de sericina em água a 3%, (N5%) dispersão de
nanopartículas de sericina em água a 5%. ... 110
Figura 43: Redução de volume das mechas (cm) nos cabelos tratados com Controle (C), Placebos (P) e com Nanopartículas de Sericina (N) em diferentes concentrações: (P1%) solução aquosa do placebo a 1%, (P3%) solução aquosa do placebo a 3%, (P5%) solução aquosa do placebo a 5%, (N1%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 1%, (N3%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 3%, (N5%) dispersão de nanopartículas de sericina em água a 5%. ... 111
Figura 44: Fios de cabelos virgens ... 112
Figura 45: Fios de cabelos danificados... 112
L
ISTA DE
T
ABELAS
Tabela 1: Composição de aminoácidos da sericina (Zhang et al, 2004)... 9 Tabela 2: Massa de proteína recuperada por precipitação com acetato e com álcool, a partir de 100 mL extrato (com 52,8 mg de N) obtido a diferentes temperaturas de extração (Kodana, 1926)... 12 Tabela 3: Rendimento das extrações pela precipitação da sericina com etanol em diferentes concentrações (Hong et al, 2006)... 13 Tabela 4: Taxa de degomagem e conteúdo de sericina da fibra de seda em várias condições de degomagem (Ki et al, 2007). ... 16 Tabela 5: Classificação visual das transições de fases de uma mistura de biopolímeros (Prata, 2006)... 28 Tabela 6: Métodos, Solventes e Matéria Prima (MP) para Extração da Sericina. ... 42 Tabela 7: Condições experimentais utilizadas na extração em autoclave.44 Tabela 8: Condições experimentais utilizadas nas extrações realizadas em planta piloto... 48 Tabela 9: Concentrações de goma guar quaternizada utilizadas na produção das nanopartículas... 50 Tabela 10: Concentrações de BTAC e CTAC usados separadamente no recobrimento das NS, com remoção do sal. ... 53 Tabela 11: Concentrações das formulações (2,7% de proteína) preparadas com misturas de CTAC e BTAC, com remoção do sal. ... 54 Tabela 12: Concentrações das formulações preparadas com misturas de CTAC e BTAC, sem remoção do excesso e eletrólitos... 54 Tabela 13: Teor de proteína nas soluções de sericina obtidas através da extração com os fios e com os casulos, na extração em autoclave... 68 Tabela 14: Teor de proteína nas soluções de sericina obtidas através da extração com os fios. ... 69
Tabela 15: Concentração de nitrogênio total e proteína nas soluções obtidas por extração com solução aquosa de Na2CO3 em tanque agitado, à 80-900C. ... 70 Tabela 16: Concentração de proteína na solução de sericina obtida da extração dos casulos (picados e íntegros), com solução aquosa de Na2CO3 em tanque agitado, à 80-900C... 71 Tabela 17: Concentração de proteínas em diferentes tempos da extração, utilizando casulos secos e picados, à 80-900C. ... 72 Tabela 18: Concentração de proteínas em diferentes tempos da extração em coluna (casulos intumescidos), à temperatura 80-900C ... 73 Tabela 19: Teor de proteína e rendimento das extrações realizadas em planta piloto, à temperatura 80-900C, utilizando método de Bradford para quantificação... 74 Tabela 20: Potencial Zeta da Solução de Sericina e de uma Solução de Goma Guar Quaternizada, em pH 5,5, em água. ... 78 Tabela 21: Diâmetro médio dos agregados protéicos após a extração com água (Análise em número)... 79 Tabela 22: Diâmetro médio das partículas logo após a reticulação (Análise em número)... 81 Tabela 23: Diâmetro das partículas de sericina formadas com diferentes concentrações de solução de Goma Guar Quaternizada. ... 84 Tabela 24: Diâmetro (em número) das nanopartículas de sericina formadas com diferentes concentrações de goma guar quaternizada em pó... 87 Tabela 25: Rendimento das precipitações com etanol 96% ... 89 Tabela 26: Distribuição de tamanho (em número) e potencial zeta das nanopartículas de sericina obtidas em solução e recobertas com arginina. ... 90
Tabela 27: Diâmetro (em número) e potencial zeta das partículas recobertas com CTAC ... 92 Tabela 28: Potencial zeta das partículas recobertas com BTAC ... 94 Tabela 29: Diâmetro e potencial zeta das partículas precipitadas com etanol recobertas com mistura de CTAC e BTAC... 95 Tabela 30: Potencial zeta das nanopartículas de sericina em solução recobertas com mistura de CTAC e BTAC ... 97 Tabela 31: Influência da ordem de adição dos conservantes no diâmetro hidrodinâmico das partículas. ... 103 Tabela 32: Diâmetro médio das partículas formadas a partir da ressuspensão em água dos pós obtidos por atomização e por liofilização (Análise em número de partículas). ... 107
N
OMENCLATURA
BTAC: Cloreto de beheniltrimetil amônio CTAC: Cloreto de cetiltrimetil amônio MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura MM: Massa Molecular
NLC: Nanocarreadores lipídicos sólidos NP: Nanopartícula
NR: Nanopartículas de sericina recobertas NS: Nanopartículas de sericina
PCS: Photo correlation spectroscopy (Espectroscopia de Correlação de Fótons)
PEC: Complexo de polieletólitos PZ: Potencial Zeta
SLN: Nanopartícula lipídica sólida SS: Solução de sericina
1.
I
NTRODUÇÃO
A nanotecnologia está sendo um dos principais recursos para o desenvolvimento e inovação na área cosmética. Os avanços no desenvolvimento de produtos de base nanotecnológica têm trazido expressivos benefícios aos cosméticos para aplicação em pele e cabelos. Desde 1995 grandes empresas internacionais como a L’Oreal e Lancôme têm utilizado micro e nanopartículas em cremes e filtros solares, obtendo maior eficiência na estabilidade e nos efeitos dos compostos ativos incorporados. A partir do ano 2000, foram identificadas patentes com a utilização de nanopartículas em produtos para cabelo como xampus e condicionadores.
A seda derivada do bicho-da-seda Bombyx mori é constituída principalmente das proteínas sericina e fibroína. A sericina constitui cerca de 25-30% da proteína da seda e envolve a fibra de fibroína com sucessivas camadas adesivas que ajudam na formação dos casulos. A sericina é constituída principalmente dos aminoácidos: serina (31%), ácido aspártico (18%), glicina (19%) e treonina (8%), e representa a fração protéica da seda solúvel em água. A sericina é considerada como “cola hidrofílica”, devido à sua propriedade de adesão das fibras de fibroína.
Os peptídeos de sericina possuem aplicações importantes em toda a faixa de massa Molecular. Peptídeos com massa Molecular maior que 20 kDa estão sendo investigados para utilização como materiais médicos, biomateriais degradáveis, polímeros compostos, biomembranas funcionais, hidrogéis e fibras funcionais. Já os de baixa massa Molecular (< 20 kDa), ou hidrolisados, são utilizados em cosméticos, incluindo produtos para cuidados da pele e dos cabelos, além de possuírem propriedades antioxidante, anticoagulante, previnem o câncer de pele. Adicionalmente, a sericina possui atividade de hidratação da pele (possivelmente devido ao alto conteúdo de serina), ação anti-rugas, pode ser aplicada como antioxidante em medicina, cosméticos, alimentos e aditivos alimentares, possui atividade antibacteriana, é resistente à
radiação ultra-violeta e absorve e libera a umidade facilmente. Além disso, possui alta afinidade por outras proteínas, sendo capaz de se ligar à queratina da pele e dos cabelos, formando um filme resistente, hidratante e protetor, conferindo boas propriedades de barreira.
As fibras capilares, estruturas derivadas da epiderme, possuem entre 50-100 µm de diâmetro e consistem da cutícula e córtex e, em alguns casos, da medula na região central. Todas elas são compostas por células mortas, preenchidas principalmente com a proteína queratina. Os principais constituintes do cabelo são: proteína, lipídeo, água e melanina.
O condicionamento dos cabelos tem o efeito contrário ao de limpeza e envolve a adição ou reposição de compostos capazes de promoverem efeitos sensoriais como suavidade, maciez e facilidade de pentear, além dos efeitos visuais de brilho e acomodação de fios rebeldes. Para obtenção desses efeitos os condicionadores devem possuir caráter iônico positivo, para prolongar a sua permanência nos fios de cabelo que possuem caráter iônico negativo, como será visto na Seção 3.7.
As aplicações inovadoras da nanotecnologia no setor de cosméticos, a crescente demanda para produtos eficazes para o cuidado dos cabelos e as propriedades funcionais da sericina, motivaram o desenvolvimento desta pesquisa que trata do desenvolvimento tecnológico de nanopartículas de sericina para aplicações em produtos para tratamento de cabelos.
Este trabalho envolveu tanto a concepção de nanopartículas funcionais quanto do seu processo de produção, desde a extração da sericina, produção das nanopartículas, e modificações eletrostáticas na sua superfície.
Nesta dissertação, são apresentados os resultados obtidos relativos aos processos de extração da sericina, produção das nanopartículas e modificações de carga na sua superfície. A caracterização das nanopartículas produzidas é apresentada em termos de diâmetro hidrodinâmico e distribuição populacional, potencial zeta e morfologia.
A aplicação das nanopartículas em mechas de cabelos mostrou grande potencial como produto para recuperação de cutículas danificadas, com promoção do aumento do brilho e diminuição de volume.
2.
O
BJETIVOS
O principal objetivo deste trabalho foi a preparação de nanopartículas para aplicação capilar.
O tema foi abordado através dos seguintes aspectos:
Extração da sericina da seda, através de um método eficiente e escalonável;
Formação de nanopartículas por reticulação eletrostática; Avaliação dos métodos de secagem;
Precipitação da nanopartículas para separação de eletrólitos; Recobrimento com tensoativos catiônicos
Caracterização físico-química Ensaios de eficácia do produto
3.
R
EVISÃO
B
IBLIOGRÁFICA
3.1.
A
S
EDA3.1.1.
O
RIGEM E DISSEMINAÇÃO DA SERICICULTURAA seda é uma fibra natural secretada pelo inseto Bombyx mori, conhecido como bicho-da-seda, com a finalidade de protegê-lo dentro do casulo (Figura 1) durante a sua transformação em pupa e subsequentemente em mariposa (Figura 2).
Ao contrário de outras espécies, o Bombyx mori não sobrevive por muito tempo sozinho no ambiente. Portanto, a sua criação deve ser feita em ambiente fechado, chocando os ovos colocados na estação precedente e alimentando as lagartas com as folhas de amoreira. A produção dos casulos (sericicultura) envolve tanto o cultivo das amoreiras para prover a alimentação, quanto a criação dos bichos-da-seda (Frederico, 1997).
(a) (b) (c)
Figura 1: (a) Lagartas construindo casulos (b) Casulo (c) Pupa no interior do casulo (Brancalhão, 2005)
Figura 2: Metamorfose do inseto (Brancalhão, 2005)
A primeira evidência arqueológica da utilização da seda data de algum momento entre 2850 e 2650 a.C., no norte da China, mas sabe-se muito pouco sobre as primeiras fases da história da indústria da seda. A partir do primeiro milênio a.C. a China começou a exportar produtos de seda manufaturados. Esses artigos eram vendidos até a Grécia e Roma através da famosa rota da seda.
A China manteve o monopólio deste negócio por muitos séculos, que acabou entre 200-300 a.C., durante um período de tumulto político. Os ovos de bicho-da-seda foram contrabandeados para a Coréia, Ásia central e Índia. A próxima onda de expansão da seda começou alguns séculos mais tarde, em 300-400 d.C. com o início da produção de seda no Japão. Em 552-556 d.C. a sericicultura alcançou a costa do Mediterrâneo e a posterior expansão da sericicultura para o oeste foi interrompida em alguns países, principalmente pela baixa condição econômica. Eventualmente, os muçulmanos levaram a sericicultura para a Espanha (séc. IX) e para a Sicília (séc. XI). A partir daí iniciou-se uma marcha lenta para o norte, ao longo da Península Itálica, chegando à França no início do século XV, com a produção da seda em larga escala iniciando-se alguns anos mais tarde. No fim do século dezessete, a produção de seda
Pupa
Lagarta Mariposa
se propagou pela Ásia e por tudo sul da Europa, permanecendo assim pelos três séculos seguintes. A quantidade de seda comercializada cresceu vinte vezes de 1820 a 1920 e, de 1870 a 1929, o valor da seda comercializada subiu nove vezes. Esse crescimento foi abruptamente interrompido entre 1929 e 1950, em virtude da Grande Crise, da 2ª Guerra Mundial e da invenção de inúmeros substitutos sintéticos. A sericicultura desapareceu totalmente da Europa e do Oriente Médio, e a produção japonesa caiu para dois terços. A China permaneceu como único exportador de seda, e tem sido acompanhada, em tempos recentes, por concorrentes como o Brasil, Tailândia e Coréia do Sul (Frederico, 1997).
3.1.2.
C
OMPOSIÇÃO DA SEDAA seda derivada do bicho-da-seda Bombyx mori é constituída principalmente das proteínas sericina e fibroína. A sericina constitui cerca de 25-30% da proteína da seda e envolve a fibra de fibroína com sucessivas camadas adesivas que ajudam na formação dos casulos (Zhang, 2002).
A fibroína constitui 70-80%, é o principal produto no processamento da seda e é uma fibra natural valiosa, com brilho e agradável ao tato. Além do uso como fibra têxtil, a fibroína tem sido recentemente estudada para outras aplicações como material funcional para produtos alimentícios, cosméticos e farmacêuticos. Trata-se de uma proteína fibrosa, altamente insolúvel em água, com alta massa Molecular, da ordem de 25 a 350 kDa,e estrutura constituída por uma série de folhas beta antiparalelas, intercaladas com segmentos peptídicos irregulares, como apresentada na Figura 3. Mais de 90% dos aminoácidos são glicina (Gli), alanina (Ala) e serina (Ser). A repetição Gli-Ala-Gli-Ala-Gli-Ser produz aumento da natureza cristalina da fibra da seda (Miyaguchi, 2005; Cozzone, 2002; Handbook of Fiber Chemistry, 1998).
Figura 3: Estrutura da fibroína constituída de folhas beta antiparalelas (Lehninger, 2003)
A sericina é uma proteína globular, solúvel em água e possui uma ampla faixa de massa molecular, variando de 10 a mais de 300 kDa (Zhang et al, 2004). É constituída por 17 aminoácidos e dentre os principais estão a serina (31%), a glicina (19,1%), o ácido aspártico (17,8%), a e a treonina (8,0%). A Tabela 1 mostra a composição completa de aminoácidos na sericina (Kato et al, 1997).
Tabela 1: Composição de aminoácidos da sericina (Zhang et al, 2004) Aminoácido %Mol Serina 31,00 Glicina 19,1 Ácido aspártico 17,8 Treonina 8,0 Ácido glutâmico 4,4 Arginina 3,9 Alanina 3,8 Tirosina 3,3 Valina 3,1 Lisina 2,7 Histidina 1,0 Leucina 0,8 Isoleucina 0,4 Prolina 0,4 Fenilalanina 0,2 Cisteína <0,05 Metionina <0,05
A sericina ocorre principalmente em estrutura randômica enovelada e amorfa e, em menor extensão, como uma estrutura organizada em folha do tipo beta (Padamwar, 2005). Ela pode ser reticulada, copolimerizada ou misturada com qualquer outro material macromolecular, principalmente polímeros sintéticos, para produção de materiais com melhores propriedades (Sarovart et al, 2003).
3.1.3.
A
PLICAÇÃO NAI
NDÚSTRIA DEF
IAÇÃOO processamento dos casulos para utilização na indústria de fiação inicia-se com o processo de secagem dos casulos. A secagem tem por objetivos: a) interromper o processo da metamorfose da crisálida, induzindo a sua morte evitando assim a sua saída dos casulos, como
mariposa, o que provoca a perda do casulo pelo rompimento do fio, b) eliminar a umidade excessiva dos casulos, que prejudica a fiação. Nessas condições, o comprimento dos fios de seda nos casulos varia normalmente de oitocentos a mil e quinhentos metros, com espessura de 2mm (Holanda et al 2004).
A produção de seda bruta requer que parte da sericina seja removida dos casulos. A remoção é feita pelo processo de degomagem, utilizando-se água quente (aproximadamente 600C), a fim de dissolver a sericina e
liberar os fios para a posterior fiação.
(http://www.bndes.gov.br/conhecimento/setorial/is11seda.pdf).
De acordo com Zhang (2002), estima-se que a produção anual de casulos no mundo é cerca de um milhão de toneladas (massa fresca), o que é equivalente à quatrocentos toneladas de casulos secos. O processamento da seda bruta gera cerca de cinquenta toneladas de sericina anualmente, cuja recuperação e aproveitamento poderia representar uma economia significativa, um benefício social e ambiental (Zhang, 2002 e Wu, 2006).
3.2.A SERICINA
3.2.1.EXTRAÇÃO E SEPARAÇÃO
A extração ou remoção da sericina dos casulos, também conhecida como degomagem, é feita por via física ou química. No primeiro caso, os processos são bem conhecidos e baseiam-se principalmente na solubilidade dessa proteína em água.
Os métodos de degomagem que utilizam enzimas como agentes são mais eficazes e envolvem economia em termos de água, energia, produtos químicos, e do tratamento de efluentes. Entretanto, o alto custo das enzimas tem limitado a sua aplicação industrial (Lamoolphak et al, 2008).
Há vários métodos físicos descritos na literatura para a remoção da sericina, sendo os mais estudados: a extração em água através da utilização de alta pressão e a extração com soluções aquosas alcalinas.
Os primeiros métodos de extração da sericina utilizavam água em ebulição e foram realizados por Cramer em 1895 e por Bondi em 1902, como descritos no trabalho de Kodama (1926). Cramer extraiu a sericina em água fervente, promoveu a sua precipitação com ácido acético e em seguida decompôs esse precipitado com sulfeto de hidrogênio, separando a proteína com etanol. Bondi também estudou a extração com água em ebulição e a recuperação da proteína foi realizada através de dois métodos. Primeiro o extrato foi evaporado, o material obtido lavado com água, dissolvido em uma solução alcalina e precipitado com etanol. No segundo método a proteína foi precipitada com ácido acético e o precipitado obtido foi tratado com álcool.
Modificando a metodologia de separação da sericina usada por Bondi, Kodama (1926), após extrair a sericina de cerca de 100 g de casulos em água em ebulição, estudou a precipitação da proteína em solução pela adição ácido acético (até pH 3,8). O precipitado foi separado por decantação, lavado com água e aquecido com 25% de álcool até que esse ficasse incolor. Cerca de 27 g de pó foi obtido pelo tratamento desse precipitado com álcool e éter.
Kodama (1926) estudou também a extração da sericina em água sob pressão, a partir de 20 g de casulos e 500 mL de água destilada, à 100 e a 1050C, durante uma hora. Esse procedimento foi repetido três vezes e a água renovada a cada extração. A recuperação da proteína foi realizada através da adição de ácido acético (até pH 3,8) ou álcool. Foi demonstrado que a extração à 1050C é mais efetiva do que a 1000C, onde os rendimentos, em porcentagem de Nitrogênio no extrato, foram de 0,165% e 0,150%, respectivamente, somando-se as três extrações. Quanto maior a temperatura utilizada na extração, menor foi a quantidade de proteína precipitada pelo acetato e maior a concentração de álcool
necessária para a precipitação da proteína no extrato (Tabela 2). Concluiu-se, portanto, que o aquecimento a altas temperaturas causa alguma mudança na proteína ou na sua decomposição.
Tabela 2: Massa de proteína recuperada por precipitação com acetato e com álcool, a partir de 100 mL extrato (com 52,8 mg de N) obtido a diferentes temperaturas de extração (Kodana, 1926).
Nitrogênio (mg) – precipitação com diferentes concentrações de
álcool Temperatura da Autoclave (0C) Nitrogênio (mg) precipitação com acetato 25% 40% 50% 75% 100 32,1 20,0 20,4 20,4 20,4 105 12,4 36,1 37,5 38,0 38,0 110 10,2 29,9 40,6 41,0 41,0 112 9,4 29,9 40,0 41,0 41,0 125 7,1 26,8 31,1 26,4 44,0 130 6,2 7,0 16,9 25,2 40,2 140 6,2 0,6 6,6 10,2 14,6
Kurioka et al (2004) compararam a extração em água sob pressão, com a extração alcalina e ácida. A degomagem alcalina foi feita com solução de carbonato de sódio 0,5% (m/v), a extração em água sob pressão foi feita a 110, 115 e 1210C e a extração ácida foi feita com solução aquosa de ácido cítrico 1,25% em ebulição. O rendimento da sericina em pó obtido pela degomagem ácida foi comparável ao obtido pela degomagem alcalina e em água quente. A média de perda de massa dos casulos na extração ácida foi de 27,8% e nas extrações alcalina e em água foi de 25,7% e 21%, respectivamente.
A extração da sericina dos casulos em água sob pressão também foi estudada por Hong et al (2006). A solução obtida foi concentrada pela
vaporização da água a 400C, secada por spray-dryer e o pó resultante foi solubilizado em água destilada (razão 1:10) e refrigerado à 40C. A precipitação foi feita com diferentes proporções de etanol (-180C), e centrifugada a 3500 rpm por 20 minutos. O material precipitado foi reservado e o etanol residual evaporado a 400C e liofilizado. Para obtenção do teor de nitrogênio solúvel, determinou-se o teor de nitrogênio do pó obtido por atomização e, após a solubilização desse pó em água e centrifugação, determinou-se também o teor de nitrogênio do sobrenadante. Dessa maneira o rendimento em termos de nitrogênio solúvel, que correspondem à sericina, foi 95%. O rendimento da precipitação da sericina com etanol aumenta com o aumento da concentração de etanol (Tabela 3).
Tabela 3: Rendimento das extrações pela precipitação da sericina com etanol em diferentes concentrações (Hong et al, 2006)
Concentração de etanol (% v/v) Rendimento da extração (% m/m)
30 46,1
50 52,1
70 61,2
75 63,6
90 71,3
Lamoolphak et al (2008) baseados na baixa eficácia da extração com água em ebulição, propuseram a extração da sericina utilizando água subcrítica, ou seja, água pressurizada à temperaturas acima da temperatura de ebulição da água mas abaixo da temperatura crítica, na remoção da sericina da seda. Nesse trabalho foram analisados os efeitos da temperatura (120-1600C), da razão entre seda:água (1:20, 1:50 e 1:100) e do tempo de reação (10-60 min) no rendimento dos produtos. Em baixas temperaturas (120 e 1300C) foram obtidos produtos mais viscosos
daqueles obtidos em temperaturas maiores e observou-se também a gelificação desses produtos após o resfriamento. A massa de resíduo não alterou significativamente com o aumento da temperatura de 120 para 1600C, indicando que a maior parte da fibroína não foi hidrolisada nessa temperatura. A solução de sericina obtida após 30 minutos de extração à baixas temperaturas continha misturas complexas de polipeptídeos com massas moleculares que variavam de 10 - 225 KDa. Com tempo de reação menor (10 minutos) os produtos obtidos apresentaram massas moleculares entre 100 - 225 KDa. Foi observado que mesmo após 10 minutos à 1200C, a sericina pôde ser completamente removida e portanto, a quantidade de proteína na solução de sericina não é significativamente afetada pela temperatura e tempo de reação estudados. Ainda nesse trabalho foi demonstrado a influência da razão mássica entre seda:água na taxa de decomposição da proteína. Para razões menores (1:100) a taxa de decomposição da sericina em peptídeos e aminoácidos foi menor, quando comparado a razões maiores (1:50 e 1:20). Segundo os autores, isso pode ter acontecido pois, no último caso, a viscosidade da proteína pode aumentar a resistência à transferência de massa, limitando a taxa de reação.
Muitos outros trabalhos na literatura descrevem a remoção da sericina por degomagem alcalina para o aproveitamento da fibroína nas mais diversas áreas, sem, no entanto, preocuparem-se com o rendimento do material solúvel removido.
Ellis (1932), em sua patente sobre tratamento de tecidos, descreve a degomagem da seda utilizando-se soluções de sais alcalinos orgânicos e inorgânicos (como silicatos, boratos, carbonatos) e banhos contento sabões, em pH 10-10,5 e temperatura de 800C.
A extração básica descrita por Li et al (2002), utiliza solução aquosa de carbonato de sódio 0,5% (m/v), a 950C por 1 hora, para a completa remoção da sericina da seda, com o objetivo de estudar a formação de
géis de fibroína e álcool polivinílico com potencial para utilização como substrato em cultura de células.
Yeo et al (2002), com o objetivo de preparar microesferas de fibroína, isolaram a sericina pela extração com solução de Na2CO3 0,3% (m/v) e
sabão de Marselha 0,5%, a 1000C por 1 hora, duas vezes.
Li, K. H. (2003) em seu trabalho sobre a influência da sericina na cristalização da fibroína para preparação de um filme formado por essas proteínas, isolou a sericina através da extração alcalina com uma solução aquosa (Na2CO3 0,5% e sabão de Marselha 0,3% (m/v)) em ebulição, por
1 hora.
Ki et al (2007) em seu trabalho sobre o efeito da sericina residual na estrutura e na propriedade mecânica do filamento de seda extraíram a sericina dos casulos, previamente secos, com água a e com misturas em diferentes concentrações de sabão de Marselha e carbonato de sódio, a 1000 C, durante 1 h. A taxa de degomagem foi calculada através da Equação 1 e o conteúdo de sericina residual foi calculada de acordo com a Equação 2, onde d é a taxa de degomagem.
100 ) deg 1 ( ) (00 × − = casulos de total massa omados casulos de massa Degomagem de Taxa Equação 1 100 1 266 , 0 1 1 ) ( Re 00 × − − − = d Sericina de sidual Conteúdo Equação 2
Os resultados obtidos pelos autores mostram o aumento na taxa de degomagem com o aumento da concentração de sabão e de carbonato de sódio, como mostrado na Tabela 4.
Tabela 4: Taxa de degomagem e conteúdo de sericina da fibra de seda em várias condições de degomagem (Ki et al, 2007).
Condição Água em ebulição 1000C Sabão 0,012% Na2CO3 0,008% (m/v) Sabão 0,024% Na2CO3 0,016% (m/v) Sabão 0,3% Na2CO3 0,2% (m/v) Taxa de degomagem (%) 9,5 13,1 18,8 26,6 Conteúdo de sericina (%) 18,9 15,5 9,6 0
3.2.2.PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
A sericina produzida pelo bicho da seda Bombyx mori é constituída por frações com diferentes massas moleculares e a separação dessas frações (Takasu et al, 2002), assim como as propriedades de gelificação e solubilidade dessa proteína, são assuntos bastante estudados.
Os métodos tradicionais de extração (descritos no item 3.2.1) usam soluções aquosas ácidas ou alcalinas, ou ainda, altas pressões, o que resulta em redução da massa molecular causada por hidrólise. Quando a sericina é dissolvida em um solvente polar, hidrolisada em soluções ácidas, alcalinas ou degradada por proteases, o tamanho resultante das suas moléculas depende de fatores como pH, temperatura e tempo de processamento. Os peptídeos pequenos resultantes são solúveis em água fria e podem ser recuperados nos estágios iniciais de produção da seda bruta. Peptídeos maiores são solúveis em água quente e podem ser obtidos nos estágios finais do processamento da seda (Zhang, 2002).
Na tentativa de identificar os vários tipos de sericina, e extrair essa proteína íntegra, inibindo a redução de massa molecular causada pela hidrólise, utilizou-se solução aquosa de tiocianato de lítio na preparação de uma solução contendo sericina e fibroína. Para remoção do sal, procedeu-se a diálise contra água e a solução resultante foi analisada por eletroforese SDS-PAGE, mostrando bandas que iam de 20 a mais de 400
KDa. Dentre elas comprovou-se que duas são derivadas da fibroína (300 e 20 KDa), uma vez que após a degomagem dos casulos, e solubilização em solução de tiocianato de zinco, confirmou-se a presença dessas duas bandas. Dessa maneira, atribuiu-se as outras bandas à proteína sericina (400, 250 e 150 KDa). Paralelamente, extraiu-se a sericina diretamente da glândula sericígena do bicho-da-seda (Midlle Silk Gland), dividindo-a em três partes distintas (anterior, média e posterior) e solubilizando-as em água. Quando da eletroforese dessas soluções, verificou-se a presença de três componentes principais que correspondiam àqueles observados anteriormente. O maior peptídeo (400 KDa) foi encontrado na parte média dessa glândula e portanto foi denominado sericina M. As duas bandas ao redor de 250 KDa, foram encontradas na parte anterior da glândula sericígena e por isso foram denominadas sericina A. A banda por volta de 150 KDa foi encontrada abundantemente na parte posterior da glândula e foi denominada sericina P (Takasu et al, 2002).
Tsubouchi et al (2004) identificaram e quantificaram quatro frações de sericina: A, B, C e D. A sericina A apresentou uma massa molecular em torno de 400 kDa. A fração D possui aproximadamente 250 kDa, a sericina B possui cerca de 200 kDa e a C apresenta massa molecular de 35 kDa, e correspondem a aproximadamente 45%, 34%, 15,5% e 5,3%, respectivamente. Nesse trabalho os autores concluíram que quando a seda passa pelo processo de degomagem as frações B e D, que são mais fáceis de serem dissolvidas em água, são removidas nos primeiros estágios.
Quando a degomagem é feita com aquecimento, quanto mais distante da neutralidade estiver o pH, mais fácil será a remoção da sericina.
A formação espontânea de géis após a extração ácida foi estuda por Kurioka et al (2004), que comparou as extrações ácida e alcalina da sericina. Esses géis foram estáveis por pelo menos 5-8 meses à 100C, e puderam ser resolubilizados por aquecimento à 980C. Por outro lado, na
extração alcalina, a proteína não apresentou a capacidade de formação de gel.
A solubilidade da sericina em água está relacionada à sua estrutura e diminui quando as suas moléculas adquirem o estado cristalino característico da estrutura de folhas beta (Kweon et al, 2000). A sericina possui ainda propriedade de gelificação dependente da temperatura, a qual se deve à mudança da sua estrutura de aleatória randômica para a estrutura organizada de folha beta. Desse modo, a sericina dissolve-se facilmente a 50-600C e gelifica-se reversivelmente com o abaixamento da temperatura (Padamwar, 2005).
O ponto isoelétrico da sericina determinado por Kodama (1926) é cerca de 3,9. Essa proteína pode ser considerada como uma “cola hidrofílica” devido a sua propriedade de adesão das fibras de fibroína.
3.2.3.
A
PLICAÇÕESOs peptídeos de sericina de alta massa molecular (> 20 KDa) estão sendo investigados para utilização como materiais médicos, biomateriais degradáveis, polímeros compostos, biomembranas funcionais, hidrogéis e fibras funcionais e tecidos. Já os de baixa massa molar (< 20 KDa), ou hidrolisados, são utilizados em cosméticos, incluindo produtos para cuidados da pele e dos cabelos (Zhang, 2002).
Kato et al (1998) demonstraram a primeira evidência da ação antioxidante da sericina através do estudo da inibição da atividade da tirosinase (polifenol oxidase), enzima responsável pelas reações de escurecimento (Maillard) de vários alimentos e biossíntese da melanina, sugerindo que este biomaterial é uma valiosa matéria-prima para a indústria de alimentos e de cosméticos.
A supressão da incidência e do número de câncer de cólon através da ingestão de sericina foi descrita no trabalho de Sasali et al (2000). Essa proteína também mostrou forte efeito anti-tumoral em modelos de pele
animal, sugerindo sua aplicação como agente preventivo contra o câncer de pele (Zhaorigetu et al, 2003).
Dentre outras propriedades, a sericina possui atividade de hidratação da pele (possivelmente devido ao alto conteúdo de serina) e ação anti-rugas (Kato et al, 1998), possui atividade antibacteriana, é resistente à radiação ultra-violeta e absorve e libera a umidade facilmente (Zhang, 2002). Além disso, possui alta afinidade por outras proteínas, sendo capaz de se ligar à queratina da pele e dos cabelos, formando um filme resistente, hidratante e protetor, conferindo boas propriedades de barreira (Tyrrell et al, 2003).
Zhang et al (2004) prepararam micropartículas de sericina da ordem de 1-30 µm, as quais foram reticuladas quimicamente com a enzima L-asparaginase e utilizadas para tratamento de leucemia linfoblástica.
Géis de sericina foram preparados usando pluronic PF-127 e carbopol 934 P como estabilizantes, com a finalidade de investigar os efeitos de hidratação dessa proteína, os quais foram demonstrados pela diminuição da impedância e pelo aumento nos níveis de hidroxiprolina e hidratação das células epidérmicas. Além disso, foi observada a diminuição da perda de água transepidermal (TEWL), devido ao efeito oclusivo, que previne a perda de água da camada superior da pele Padamwar et al (2005).
Aramwit et al (2007) estudaram os efeitos da sericina na cicatrização e diminuição do tamanho de feridas em ratos. Um creme contendo 8% de sericina não mostrou nenhum efeito tóxico nos ratos, mostrando-se seguro e biocompatível, sendo que as reações inflamatórias da pele, nas feridas tratadas com sericina, mostraram-se menores do que aquelas tratadas com o controle. A cicatrização das feridas tratadas com o creme contendo sericina foi mais rápida do que a cicatrização das feridas tratadas com o controle (11 vs. 15 dias).
O uso de sericina na formulação de um cosmético para as unhas foi patenteado por Yamada et al (2007). Segundo os autores, a sericina na
concentração de 0.2 a 20%, é capaz de diminuir a secura das unhas, tornando-as brilhantes e mantendo ou melhorando a sua saúde.
Fox et al (2006), descreveram os estudos realizados por Yao (2004), que mostrou a relação entre a massa molecular de peptídeos de sericina e os seus efeitos nos cuidados com os cabelos. Neste trabalho foram estudadas influência da adsorção desses peptídeos na superfície e nas propriedades mecânicas dos cabelos humanos. Os peptídeos que tiveram maior afinidade ao cabelo humano, formaram um filme transparente na superfície, protegendo-os dos danos causados por fatores externos, conferindo brilho e elasticidade, e facilitando a penetração para a reparação do cabelo danificado.
3.3.NANOPARTÍCULAS
O domínio da nanotecnologia está compreendido entre 1nm e 1 m. Essa ciência tem evoluído muito nos últimos anos devido ao fato de os materiais em escala nanométrica apresentarem novos comportamentos e/ou propriedades diferentes daqueles que apresentam em escala macroscópica.
Atualmente, a utilização de sistemas carreadores de bioativos para a liberação em sítios específicos é área de intensa pesquisa. Esses sistemas incluem os lipossomas e as nanopartículas (Schaffazick et al, 2003).
Lipossomas ou vesículas lipídicas são estruturas esféricas, compostas por bicamadas fosfolipídicas, que encapsulam no seu interior parte do solvente aquoso do meio no qual ele está disperso. Podem apresentar uma ou várias lamelas concêntricas, variando o tamanho de poucos nanômetros até algumas dezenas de micrômetros. A bicamada pode acomodar em seu interior ativos lipofílicos (Lasic, 1993).
Porém, alguns problemas associados à essas vesículas tais como baixa eficiência de encapsulação, rápida liberação de ativos hidrofílicos na
presença de elementos sanguíneos e baixa estabilidade durante a estocagem, fazem das nanopartículas (NPs) uma alternativa interessante, com algumas vantagens em relação aos lipossomas como aumento da estabilidade dos bioativos e propriedades úteis de liberação controlada (Soppimath et al, 2001).
Dentre os sistemas nanoparticulados, os mais recentes são as nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) e os carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) utilizados principalmente para a encapsulação de ativos lipofílicos. As SLNs são derivadas das nanoemulsões O/A pela substituição dos lipídeos líquidos (óleo) por lipídeos sólidos, sendo sólidos à temperatura corpórea (370C) (Muller et al, 2007). As SLNs foram a primeira geração de partículas lipídicas desenvolvidas, porém apresentaram problemas de baixa eficiência de encapsulação devido à matriz da partícula formar uma estrutura de cristal relativamente perfeita, com espaço limitado para acomodar o ativo, o que pode levar à sua expulsão durante o armazenamento. Em contraste, as NLCs, usam uma mistura lipídica (lipídeos sólidos e líquidos à temperatura ambiente) com moléculas estruturadas em diferentes tamanhos que distorcem a formação de um cristal perfeito. Dessa maneira, a matriz da partícula possui muitas imperfeições criando espaços para a acomodação do ativo na forma molecular, promovendo o aumento da eficiência de encapsulação e a liberação mais lenta do ativo da matriz (Muller et al, 2007).
Outros sistemas bastante estudados atualmente são as nanopartículas poliméricas, que incluem as nanocápsulas e as nanoesferas, diferenciadas de acordo com a organização estrutural e a composição (Figura 04). As nanocápsulas possuem um invólucro de polímero biodegradável e um núcleo oleoso, sendo que o ativo pode estar dissolvido no núcleo oleoso ou adsorvido ao invólucro polimérico (Schaffazick et al, 2003). Lambert et al (2000) desenvolveram
nanocápsulas lipofílicas com núcleo aquoso, utilizando
As nanoesferas são sistemas poliméricos matriciais no qual o ativo está uniformemente distribuído (Soppimath et al, 2001).
Figura 4 Representação esquemática das nanocápsulas e nanoesferas poliméricas (Schaffazick et al, 2003).
Essas partículas podem ser preparadas através de uma variedade de técnicas, algumas envolvendo a utilização de solventes e componentes potencialmente tóxicos. Para relevar essas limitações de processo, têm sido desenvolvidas nanopartículas hidrossolúveis, biodegradáveis, obtidas a partir de polímeros e polieletrólitos. Essas NPs, denominadas dispersões de complexos de polieletrólitos (PECs), resultam de interações eletrostáticas fortes entre microdomínios carregados de pelo menos dois polieletrólitos de cargas opostas (Hartig et al, 2007).
Entre os polímeros naturais utilizados na produção de nano e microesferas estão a albumina, gelatina, colágeno, quitosana, entre outros (Oliveira, 2005).
3.4.NANOPARTÍCULAS PARA APLICAÇÃO EM COSMÉTICOS
Nos últimos anos têm ocorrido avanços na área cosmetológica, realizados pelas empresas de ponta do setor, sendo esta uma área em franca expansão com fins dos mais lucrativos (Schmaltz et al, 2005).
A definição legítima de cosmético é um produto que melhora a aparência, auxilia na higiene pessoal e não afeta a estrutura ou a função da pele. Produtos cosméticos não possuem, portanto, fármacos ativos (Jackson, 1999). Parede Polimérica Núcleo Ativo Ativo Matriz Polimérica
O departamento americano “Food and Drud Administration” (FDA) define cosmético como (1) artigos destinados a serem esfregados, vertidos, espalhados ou borrifados, ou aplicado de outra maneira no corpo humano, com o objetivo de limpeza, embelezamento, promoção de atratividade, ou alteração da aparência e (2) artigos destinados ao uso como componentes de quaisquer desses artigos, exceto aqueles que não incluam o termo sabão. O FDA não reconhece nenhuma categoria como “cosmecêutico”. Um produto pode ser um fármaco, um cosmético ou a combinação dos dois, mas o termo “cosmecêutico” não tem significado sob a lei norte-americana (http://www.fda.gov).
A nanotecnologia está sendo um dos principais recursos para o desenvolvimento e inovação na área cosmética. As empresas do ramo destinam cada vez mais recursos para pesquisas nesta nova opção tecnológica (Schmaltz et al, 2005).
Os lipossomas representam o sistema carreador de cosmético mais inovador dos anos 80, introduzidos no mercado pela companhia Dior em 1986 (produto Capture). Apesar das características positivas, o maior problema hoje é a sua estabilidade física limitada (Muller et al, 2007).
Em 1995, as nanocápsulas poliméricas foram introduzidas no mercado cosmético pela L’Oreal. Subseqüentemente, vários artigos científicos baseados na penetração cutânea e distribuição de fármacos e cosméticos encapsulados em nanopartículas poliméricas foram publicados (Guterres et al, 2007).
A Lancôme lançou há alguns anos um produto cosmético contendo nanocápsulas de vitamina E (Primordiale). A proposta é de que a vitamina se distribua largamente através das camadas externas da pele formando um gradiente. A eficácia da vitamina E protegida, quando incorporada em nanopartículas foi mostrada in vivo (Jansen et al, 2001). Dingler et al (1999) mostraram que a incorporação de vitamina E em SLN é capaz de estabilizar quimicamente esse ativo. As partículas ultrafinas formam um
filme adesivo fino na pele, levando a um efeito oclusivo e à hidratação, o que promove a penetração da vitamina E na pele.
Zulli et al (2001) encapsularam Uvinil T 150 (filtro UV-B) em nanopartículas lipídicas. Eles observaram uma afinidade quase cem vezes maior do Uvinil T ao cabelo nas partículas carregadas positivamente comparadas àquelas carregadas negativamente.
Shefer et al patentearam em 2002 um sistema de liberação controlada para produtos de cuidados com os cabelos como xampus e condicionadores, incluindo nanopartículas formadas por polímeros e copolímeros hidrofóbicos, em combinação com agentes condicionantes catiônicos para melhorar o sistema de deposição nos cabelos. As nanopartículas, formadas por um núcleo sólido e uma superfície externa catiônica, incluem ingredientes ativos e marcadores sensoriais. A substantividade das nanopartículas foi avaliada através da análise de amostras de cabelos tratadas com as nanopartículas por microscopia eletrônica de varredura.
As NLCs foram desenvolvidas em 1999 e o primeiro produto introduzido no mercado em 2005, pela companhia alemã Dr. Rimpler, foi o NanoRepair Q10 Cream e NanoRepair Q10 Serum (Muller et al, 2007).
Nanopartículas de sericina de 200 a 400 nm foram obtidas por autoagregação para aplicação cosmética, através da conjugação química da proteína sericina com polietilenoglicol ativado em meio básico, à 40C, durante 12 horas aproximadamente. Em seguida, essa solução foi dialisada contra água por dois dias, e para a formação das nanopartículas, o conjugado foi solubilizado em etanol e dialisado contra água novamente por dois dias (Cho et al, 2003).
3.5. PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS DE PROTEÍNA ATRAVÉS DA FORMAÇÃO DE
COMPLEXOS DE POLIELETRÓLITOS (PECS)
As preparações de micro e nanopartículas para aplicações farmacêutica e cosmética têm sido bastante estudadas. Dentre os vários métodos utilizados para a preparação de micro/nanopartículas de proteínas destaca-se a formação de complexos de polieletrólitos.
Uma mistura de dois biopolímeros terá o comportamento de fases determinado por parâmetros físico-químicos como a estrutura dos polímeros em solução (Schmitt et al, 1998). Essas misturas são geralmente instáveis, com a separação em duas fases (Ye, A., 2008), onde as forças de desestabilização são maiores do que as forças de estabilização, podendo ocorrer a segregação de cada macromolécula em fases separadas, conhecida por incompatibilidade termodinâmica (Schmitt et al, 1998). Uma mistura diluída de biopolímeros (proteína e polissacarídeo) que não interagem, pode ser co-solúvel, formando uma solução estável. Porém, se a proteína e o polissacarídeo apresentam atração eletrostática, pela presença de grupos com cargas opostas, ocorrerá a coacervação complexa ou separação de fase associativa como ilustrado na Figura 5 (Ye, A., 2008).
Figura 5: Principais tendências nas interações entre proteínas e polissacarídeos (Ye, A., 2008)
Portanto, a formação de complexos de polieletrólitos consiste na mistura de soluções de poliânions e policátions permitindo a agregação espontânea com a liberação de contra-íons (Dautzenberg, 2000). A força molecular predominante na agregação dos polieletrólitos é a forte interação eletrostática. Entretanto, ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e forças de van der Waals complementam a formação dos PECs. A formação dos PECs é composta de duas etapas principais: (1) o processo de difusão cinética do entrelaçamento mútuo entre polímeros, que ocorre em um espaço de tempo relativamente curto e depende das diferenças dos tamanhos molares e (2) o rearranjo termodinâmico dos agregados simples já formados devido a mudança conformacional e desentrelaçamento (Hartig et al, 2007).
Dois modelos estruturais de PECs são descritos na literatura, baseados nas características dos grupos de poliíons, na estequiometria e massa molecular (Figura 6): o modelo "ladder-like", onde a formação dos complexos ocorre em nível molecular, através de adaptação
Insolúvel (Separação de Fases) Incompatibilidade Separação de Fases Co-solubilidade Sem Separaração de Fases Solúvel Complexos Polissacarídeo Proteína
conformacional e o modelo “scrambled-egg”, onde um grande número de cadeias são incorporadas no interior das partículas.
Figura 6: Representação esquemática da estruturas "ladder-like" e do modelo "scrambled-egg”. Preto representa o maior poliíon (negativo) e cinza representa o poliíon de carga oposta (positivo). (a) mostra a representação "ladder-like" onde ocorre um pareamento insuficiente de íons em certas condições estequiométricas permitindo a formação de agregados insolúveis e PECs solúveis (b) mostra o modelo "scrambled-egg”, onde polímeros de tamanhos semelhantes se complexam formando PECs insolúveis sob certas condições (Hartig et al, 2007).
De acordo com Hartig et al (2007), três tipos de complexos de polieletrólitos aquosos podem ser formados:
PECs solúveis: sistemas macroscopicamente homogêneos, contendo pequenos PECs agregados;
Coloidais turvos: sistemas de PECs na transição para separação de fases, exibindo um aparente espalhamento de luz;
Sistema de duas fases, com um sobrenadante líquido e um precipitado de PEC, que são isolados como um sólido após lavagem e secagem.
A Tabela 5 apresenta um resumo do comportamento das macromoléculas em solução.
