ANTIMICROBIANA DE UM CIMENTO EXPERIMENTAL À BASE DE SILICATO DE CÁLCIO PURO E ACRESCIDO DE ANTIBIÓTICOS
1
Hernando Valentim da Rocha Junior DDS, MSc
1
Francisco Orlando Giraldi Neto DDS, MSc
2
Bruno Gomes Duarte DDS
1
Eliston Comparim PhD
1
Diogo Rubim DDS, PhD
3
Marco Antonio Húngaro Duarte DDS, PhD
1
Paulo Weckwerth DDS, PhD
1
Universidade Sagrado Coração, Bauru – Brasil
2
Residente em Cirurgia e Traumatologia Buco Maxilo Facial do Hospital Federal de Bonsucesso, Rio de Janeiro – Brasil
3
Universidade de São Paulo, Faculdade de Odontologia de Bauru, Bauru – Brasil
Correspondências para:
Hernando Valentim da Rocha Junior
Rua Arroio Fundo 288, Jacarepaguá, Rio de Janeiro – RJ
CEP 22765-260
Phone number: +55 (21) 73193817 E-mail: hernando.valentim@gmail.com
Resumo
Introdução: A semelhança da composição e das propriedades mecânicas e biológicas, entre o cimento Portland e o MTA são comprovadas, sendo recomendada por alguns autores a substituição do MTA pelo cimento Portland na prática clínica, visando baratear o custo operacional. Os benefícios da adição de um antimicrobiano ao cimento Portland incrementaria as vantagens da sua utilização clínica, desde que houvesse a liberação do antibiótico tanto no momento da colocação bem como após sua presa. Objetivos: Avaliar a atividade antimicrobiana do cimento Portland puro e com óxido de zircônia como agente radiopacificador na proporção de 50% em massa, quando da adição de dois tipos de antibióticos, a amoxicilina e o ciprofloxacino, frente a cinco tipos de microrganismos mais comumente relacionados aos fracassos da terapia endodôntica convencional: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, E. faecalis e C. albicans. Material e métodos: Foram utilizadas 30 placas de Petri preparadas com o meio de cultura ágar Müller-Hinton, sendo escavados seis poços onde foram introduzidos os cimentos imediatamente após a manipulação, ou após presa de 24 h. Assim sendo, o desempenho do cimento Portland como veículo para antimicrobianos foi avaliado comparativamente in vitro. Os resultados foram avaliados pela análise da varia
ância ANOVA e a comparação dos grupos submetidos ao teste Tukey sendo considerado p > 0,05 Resultados: O cimento Portland apresentou atividade antimicrobiana apenas contra C. albicans; a adição do agente radiopacificador pouco interferiu no desempenho geral. O ciprofloxacino foi significantemente superior à amoxacilina em todos os testes. Conclusões: A adição de ciprofloxacino obteve bons resultados sendo eficiente em todas as bactérias estudadas, tanto pré-presa como pós-presa, havendo um desempenho superior ao da amoxicilina. A presa parece não interferir na liberação do ciprofloxacino, mas interfere na liberação de amoxacilina em alguns casos. O cimento Portland não possui atividade antibacteriana e a adição do radiopacificador não altera significativamente o seu desempenho.
Palavras-chave: Portland. Antimicrobianos. Cimentos endodônticos. Teste de difusão em ágar.
Quando a terapia endodôntica convencional falha ou está contra-indicada, a apicetomia, associada à obturação retrógrada, pode ser necessária para o tratamento do elemento dentário20.
Assim sendo, a eliminação de microrganismo no sistema de canais radiculares torna-se um importante objetivo na terapia endodôntica, sendo uma ferramenta importante para tal a colocação de um medicamento intracanal que possa atuar sobre os microrganismos. Consequentemente, o uso de um material de preenchimento do canal com alguma atividade antimicrobiana seria considerado um esforço benéfico na tentativa de controlar o número de microrganismos nos canais radiculares e na erradicação de infecções23.
A utilização de cimento Portland em substituição ao MTA como material de preenchimento de canais radiculares, particularmente quando da realização de obturação retrógrada, vem sendo sugerida por alguns autores, e ganha força à medida que se verifica a composição dos dois materiais ser bastante semelhante, diferindo principalmente na existência do óxido de bismuto na composição do MTA, que é um agente radiopacificador, e também pode ser adicionado ao cimento Portland11,15,17,21,22.
Devido ao fato de o óxido de bismuto poder, quando submetido ao meio ácido, ser dissolvido e sua dissolução pode diminuir a biocompatibilidade do MTA, além de poder deteriorar a estabilidade dimensional do material, a utilização do óxido de zircônia foi sugerido como um bom agente radiopacificador4,5,21.
A idéia de adicionar antibióticos aos cimentos parece ser pragmática em sua origem e faz muito sentido9.
O primeiro relato de utilização de cimentos com antibióticos foi feito por Buchholz e Engelbrecht, em 1970. Esse artifício visa à administração de altas doses de concentração local de antibióticos com baixas repercussões sistêmicas. O sucesso dessa técnica pode depender do antibiótico escolhido, que deve ser guiado pela susceptibilidade dos patógenos envolvidos na região12.
Está provado que a adição de antibióticos aos cimentos é efetivo na prevenção e controle de infecções11. A adição de antibióticos aos cimentos pode resultar em diminuição das propriedades biomecânicas desses cimentos, mas alguns estudos fracassaram na tentativa de provar essa relação. Em geral, a
redução de até 10% da resistência é aceitável, por exemplo, em prótese total de articulação9,12.
Este trabalho procurou estudar a atividade antimicrobiana do cimento Portland puro ou com a adição de um radiopacificador (óxido de zircônia), e ainda avaliar se a adição de antibióticos melhoraria o desempenho antimicrobiano deste cimento, frente aos microorganismos testados, no pré presa e no pós presa.
Material e métodos
Para este experimento, cinco cepas de micoorganismos foram obtidas da coleção de cultura de espécies americanas (ATCC – American Type Culture Collection), sendo elas: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922) e Candida albicans (ATCC 10231).
Foram testados os cimentos Portland (cimento branco Votoram – Grupo Votorantim, Rio de Janeiro, Brasil) com as seguintes composições:
Cimento Portland puro;
Cimento Portland acrescido de 50% de óxido de zircônia;
Cimento Portland Puro acrescido de 10% em peso de amoxicilina; Cimento Portland Puro acrescido de 10% em peso de ciprofloxacino;
Cimento Portland acrescido de 50% de óxido de zircônia e de 10% de amoxicilina;
Cimento Portland acrescido de 50% de óxido de zircônia e de 10% de ciprofloxacino.
Estes mesmos cimentos foram testados após presa de 24 h.
O acréscimo dos antibióticos ao cimento foi na proporção de 10% em massa semelhante ao experimento de Hoelscher et al10. Utilizando uma balança de
precisão Shimadsu, modelo AY220 (Shimadsu de Brasil, São Paulo, Brasil), pesava- se 0,9 g do cimento base (Portland puro ou Portland acrescido de óxido de zircônia em 50%); colocava-se em um frasco tipo eppendorf. Adicionava-se, neste mesmo, um frasco contendo 0,1 g do antibiótico escolhido e procedia-se a uma agitação manual.
Um total de 30 placas de Petri foram preparadas com meio de cultura ágar Müller-Hinton, conforme preconizado pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)13. Foram escavados poços de 6 mm de diâmetro nas placas conforme descrito por Ostrosky et al14. Os microrganismos foram semeados conforme as normas da NCCLS na diluição de 1 x 108 UFC/ml13. Esses poços foram preenchidos com uma mistura do cimento manipulados na proporção de 1g/0,26 ml pó-líquido, seguindo o protocolo de Bortoluzzi et al (2009)3. No teste pós-presa, os cimentos foram espatulados conforme descrito anteriormente, acondicionados em placa de Petri estéril, sem meio de cultura e incubados a 37ºC por 24 horas. Após esse período, o cimento é triturado em gral e pistilo, novamente espatulado na mesma proporção (pó/líquido anterior) e inserido nos respectivos poços.
Após o preenchimento dos poços, as placas ficaram em temperatura ambiente por duas horas, e então incubadas, a 37ºC, por 18 horas, como determinado pela NCCLS.
A leitura das placas foi feita observando-se se houve ou não a formação de um halo de inibição. Caso houvesse a formação do halo, este era medido com uma régua sobre uma fonte de luz, conforme determinado pela NCCLS.
Os resultados foram expressos de acordo com a média dos três experimentos por microrganismo e aplicou-se o teste ANOVA, para análise de variância, e teste de Tukey, para comparação grupo a grupo, com nível de significância p>0,05
Resultados
A Tabela 1 mostra as médias dos halos de inibição formados em todas as placas do experimento.
Tabela 1 – Média do tamanho do halo de inibição formado em todas as placas testadas (mm) E.coli P. aeruginosa E.faecalis S. aureus C. albicans Portland Puro 0 0 0 0 0 0 0 0 20 14 Portland Puro+Cipro 48 45 50 48 38 38 53 48 20 15 Portland Puro+Amoxicilina 37 33 0 0 45 0 65 35 20 15 Portland 50% 0 0 0 0 0 0 0 0 20 15 Portland 50% Cipro 45 45 50 48 38 38 53 47 20 15 Portland 50% Amoxicilina 35 28 0 0 44 0 65 17 20 14 Pré- presa Pós- presa Pré- presa Pós- presa Pré- presa Pós- presa Pré- presa Pós- presa Pré- presa Pós- presa
Foram aplicados testes estatísticos na comparação dos cimentos:
Cimento Portland Puro (CP) Cimento Portland 50% (CP50)
Cimento Portland + Ciprofloxacina (CPC) Cimento Portland + Amoxicilina (CPA)
Cimento Portland 50% + Ciprofloxacina (CP50C) Cimento Portland 50% + Amoxicilina (CP50A)
Tabela 2 – Padrão das comparações realizadas Comparação dos cimentos */*
CP/CPC CPC/CPA CPA/CP50C
CP/CPA CPC/CP50 CPA/CP50A
CP/CP50 CPC/CP50C CP50/CP50C
CP/CP50C CPC/CP50A CP50/CP50A
CP/CP50A CPA/CP50 CP50C/CP50A
A Tabela 3 demonstra se houve significância estatística entre os grupos comparados após aplicação do teste Tukey.
Tabela 3 – Resultado de significância estatística
coli1 coli2 aer1 aer2 aur1 aur2 faec1 faec2 alb1 alb2
CP/CPC s s s s s s s s ns ns CP/CPA s s ns ns s s s ns ns ns CP/CP50 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns CP/CP50C s s s s s s s s ns ns CP/CP50A s s ns ns s s s ns ns ns CPC/CPA s s s s s s s s ns ns CPC/CP50 s s s s s s s s ns ns CPC/CP50C s ns ns ns ns ns ns ns ns ns CPC/CP50A s s s s s s s s ns ns CPA/CP50 s s ns ns s s s ns ns ns CPA/CP50C s s s s s s s s ns ns CPA/CP50A s s ns ns ns s ns ns ns ns CP50/CP50C s s s s s s s s ns ns CP50/CP50A s s ns ns s s s ns ns ns CP50C/CP50A s s s s s s s s ns ns
s= significância estatística; ns= não significância estatística. Coli = E. coli; aer = P. aeruginosa; aur = S. aureus; faec = E. faecalis; alb = C. albicans. O número 1, após a sigla do microrganismo, refere-se ao teste pré-presa e, o número 2, ao teste pós-presa.
A tabela 4 demonstra quem obteve um desempenho superior na comparação realizada frente às várias cepas estudadas, baseada na significância estatística.
Tabela 4 – Interpretação do comparativo frente à análise estatística
coli 1 coli 2 aer 1 aer 2 aur 1 aur 2 faec 1 faec 2
CP/CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CP/CPA CPA CPA SEM SEM CPA CPA CPA SEM
CP/CP50 SEM SEM SEM SEM SEM SEM SEM SEM
CP/CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C
CP/CP50A CP50A CP50A SEM SEM CP50A CP50A CP50A SEM
CPC/CPA CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CPC/CP50 CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CPC/CP50C CPC SEM SEM SEM SEM SEM SEM SEM
CPC/CP50A CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CPA/CP50 CPA CPA SEM SEM CPA CPA CPA SEM
CPA/CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C
CPA/CP50A CPA CPA SEM SEM SEM CPA SEM SEM
CP50/CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50/CP50A CP50A CP50A SEM SEM CP50A CP50A CP50A SEM CP50C/CP50A CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C
Inseriu-se a sigla do material que obteve desempenho estatisticamente superior na comparação direta. A sigla SEM foi atribuída quando nenhum material foi superior ao outro, obtendo-se, assim, um comportamento estatisticamente semelhante.
Discussão
Os microrganismos testados são patógenos envolvidos com a infecção endodôntica ou associados a casos resistentes à terapêutica. A despeito dos microrganismos aeróbicos e aeróbicos facultativos serem geralmente os menores constituintes das infecções primárias, eles são encontrados em maior frequência nos casos onde o tratamento é mais demorado, em casos de flare-ups e em casos de fracassos do tratamento. Esses microrganismos podem entrar no sistema de canais radiculares, antes, durante e após o tratamento, causando infecções secundárias. P. aeruginosa e E. faecalis são mais comumente encontrados em casos de fracassos da terapia endodôntica. O S. aureus é encontrado algumas vezes nos canais radiculares e representa um microrganismo padrão em testes antimicrobianos7. E. Faecalis é o microrganismo mais frequentemente encontrado na periodontite periapical refratária, sendo utilizado em numerosos estudos sobre propriedades antibacterianas de
agentes desinfectantes, devido à sua resistência a alguns medicamentos e sua habilidade em sobreviver à terapia endodôntica convencional23.
Estudos anteriores demonstraram que, sob atmosferas aeróbicas, o MTA (mineral trioxide aggregate) pode gerar espécies reativas ao oxigênio (ROS), a qual tem atividade antimicrobiana. Entretanto, sob atmosfera anaeróbica, a diminuição de ROS foi observada. Provavelmente, o meio rico em oxigênio favorece a atividade antimicrobiana do MTA19. Em estudo com E. coli e E. faecalis, Ribeiro et al18 demonstraram que E. faecalis foi sucetível ao GMTA (MTA cinza) tanto quanto ao hidróxido de cálcio, após incubação sob atmosfera aeróbica. Entretanto, cepas de E. coli foram resistentes ao GMTA e suscetíveis ao hidróxido de cálcio, quando incubados sob as mesmas condições. Esse fato pode ser explicado por meio dos estudos, que demonstram que cepas puras de E. coli são relativamente resistentes ao ROS, no qual, para mudar esse panorama, seria necessária a utilização de cepas mutantes. Tal fato é corroborado pelo estudo de Ribeiro et col19, concluindo que foi possível observar zonas de inibição sob condições aeróbicas promovidas pelos cimentos estudados em duas cepas mutantes de E.coli, mas não houve inibição em cepas selvagens.
Tem-se demonstrado que a colonização por fungos resultando em doenças radiculares pode estar associada ao fracasso do tratamento dos canais radiculares. O fungo mais comumente isolado é a C. albicans. Esse microorganismo tem sido detectado em cerca de 20% dos canais infectados utilizando-se 18S rRNA primer de especificidade direta de espécies. C. albicans demonstrou habilidade em colonizar paredes dos canais radiculares e penetrar em túbulos dentinários1.
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico, no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do microrganismo desafiado com a concentração da substância ensaiada14. O ADT (teste de difusão em ágar) é uma técnica semiquantitativa e relativamente insensível, não distinguindo entre efeitos bactericida e bacteriostático7. A despeito disso, é o método mais utilizado para avaliação de atividade antimicrobiana dos cimentos endodônticos23. Em que pese o fato de alguns autores indicarem o teste de contato direto para a avaliação de atividade antimicrobiana dos cimentos endodônticos2, o ADT ainda é o teste recomendado pela NCCLS como teste de sensibilidade antimicrobiano13. Configura-
se como um teste de execução rápida, fácil reprodutibilidade, baixo custo e, atualmente, ainda muito executado, facilitando a comparação entre os desempenhos dos mais variados cimentos. Apesar de suas limitações, pode ser encarado como um teste inicial para avaliar as atividades antimicrobianas de algumas substâncias.
A ideia de acrescentar antibióticos aos cimentos parece ser pragmática em sua origem. O conceito de utilizar os cimentos como um depósito de antibióticos faz sentido, ao passo que permite a liberação do fármaco diretamente no sítio da iminente infecção9.
O primeiro relato de utilização de cimento carregado com antibióticos foi descrito por Buchholz e Engelbrecht em 1970, conforme afirma Klekamp et al12. O interessante dessa técnica é a possibilidade de disponibilizar altas doses de antibióticos localmente, com baixa toxicidade sistêmica. Deve-se ressaltar que o sucesso dessa ideia depende do antibiótico escolhido, que deve ser guiado pela suscetibilidade dos microrganismos, envolvidos sejam eles empíricos ou comprovados12.
Hendriksa et al9 afirmam que os antibióticos liberados pelos cimentos ósseos, por exemplo, segue um modelo tipicamente bifásico. Numa primeira fase, existe um pico de liberação, seguido então por uma longa “cauda” de baixa liberação que continua por dias e até meses. Baseado nessa premissa testou-se o cimento Portland, carregado com os antibióticos; 24 h depois, a presa para se averiguar esse fato. A adição de um segundo antibiótico também pode levar a um aumento na liberação de ambos, o que pode ser conveniente quando um sinergismo entre drogas for necessário para o tratamento mais adequado.
A eficiência de cimentos ósseos carregados com antibióticos na prevenção de infecções pode ser ilustrada pela seguinte observação: em período anterior e após a adição de antibióticos ao cimento ósseo Palacos®, uma drástica redução de infecção foi notada. Mesmo em técnicas assépticas, houve uma queda adicional da taxa de infecção após procedimentos primários usando-se cimentos ósseos carregados de gentamicina. Semelhantemente nos casos de revisões cirúrgicas secundárias, houve um benefício adicional no uso de cimentos ósseos carregados com antibióticos9.
A adição de antibióticos aos cimentos pode resultar em diminuição das propriedades mecânicas, embora alguns estudos tenham fracassado ao demonstrar alguma significância estatística nas forças de compressão e de tensão com a adição
de antibióticos9. Em geral, não mais que 10% de redução das forças dos cimentos ósseos são consideradas aceitáveis para artroplastia total12. Ginebra8 demonstrou que, em geral, os cimentos de apatita com antibióticos tenderam a aumentar o tempo de presa e reduzir as forças mecânicas, por exemplo, ao incorporarem-se diferentes concentrações de antibióticos; porém, todas as concentrações utilizadas foram superiores a 10% em peso. Pelletier16 demonstra que, se uma alta dose de antibiótico for necessário para erradicação de uma infecção, deve ser observado que, acima de 12% em peso na proporção de antibiótico no cimento, este pode colocar-se abaixo do mínimo no desempenho das propriedades mecânicas requeridas. Em seu trabalho, um dos cimentos em que foi adicionado antibióticos na ordem de 13% em peso, este ficou abaixo do 70 MPa recomendado com 67,8+6,9 MPa. Ele afirma ainda que as altas doses de antibióticos incorporados aos cimentos podem levar a complicações sistêmicas como nefrotoxicidade, ototoxicidade e hepatites. Pelo exposto podemos concluir que carregar um cimento com antibióticos até uma proporção de 10% em peso, não produz uma diminuição muito significativa de suas propriedades mecânicas.
Diante disto, parece seguro sugerir a adição de ciprofloxacino ao cimento Portland no sentido de incrementar uma atividade antimicrobiana mais ampla a este cimento. Como alerta, sugere-se que as propriedades físico-químicas dos cimentos testados neste estudo devem ser avaliadas. Os resultados apresentados aqui são encorajadores, mas não sustentam ainda a aplicação clínica desses cimentos
Conclusão
Pode-se concluir, então, nas condições deste estudo, que o cimento Portland apenas possui atividade antimicrobiana contra C. albicans, tanto pré quanto pós- presa, entretanto, a adição de ciprofloxacino permitiu atividade antibacteriana, tanto pré quanto pós-presa em todas as bactérias estudadas demonstrando o comportamento com uma tendência mais linear e superior se comparado à amoxicilina. A adição do agente radiopacificador parece não interferir na liberação do ciprofloxacino, exceto nas cepas pré-presa de E. coli. O cimento Portland parece continuar liberando o ciprofloxacino mesmo após a presa, fato este que não acontece com a amoxicilina diante das cepas de E. faecalis..
1. Al-Hezaimi K, Al-Hamdan K, Naghshbandi J, Oglesby S, Simon JHS. Effect of white-colored mineral trioxide aggregate in different concentrations on Candida albicans in vitro. J Endod. 2005;31(9):684-86.
2. Asgary S, Kamrani FA. Antibacterial effects of five different root canal sealing materials. J Oral Science. 2008;50(4):469-74.
3. Bortoluzzi EA, Guerreiro-Tanomaru JM, Duarte MAH. Radiographic effect of different radiopacifiers on a potential retrograde filling material. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.2009;108:628-32.
4. Camilleri J. Evaluation of the Effect of Intrinsic Material properties and ambient conditions on the dimensional stability of white mineral trioxide aggregate and Portland cement. J Endod. 2011;37(2):239-45.
5. Cornelio ALG, Salles LP, Paz MC, Cirelli JA, Guerreiro-Tanomaru JM, Tanomaru Filho M. Cytotoxicity of Portland cement with different radiopacifying agents: a cell death study. J Endod. 2011;37(2):203-10.
6. Duarte MAH, El Kadre GDO,Vivan RR, Tanomaru JMG, Tanomaru Filho M, Moraes IG. Radiopacity of Portland cement associated with different radiopacifying agents. I: chemical, physical, and antibacterial properties. J Endod 2009;35(5):737-40.
7. Eldeniz AU, Hadimili HH, Ataoglu H, Orstavik D. Antibacterial effect of selected root-end filling materials. J Endod.2006;32(4):345-9.
8. Ginebra MP, Traykova T, Planell JA. Calcium phosphate cements as bone drug delivery systems: A review. J Control Release. 2006;113:102-10.
9. Hendriksa JGE, Van Hornb JR,Van der Meia HC, Busscher HJ. Backgrounds of antibiotic-loaded bone cement and prosthesis-related infection. Biomaterials. 2004;25:545-56.
10. Hoelscher AA, Bahcall JK, Maki JS.In Vitro Evaluation of the Antimicrobial Effects of a Root Canal Sealer Antibiotic Combination Against Enterococcus faecalis. J Endod. 2006;32(2):145-7.
11. Hwang YC, Kim DH, Hwang N, Song SJ, Park YJ, Koh JT, et al. Chemical