UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
HERNANDO VALENTIM DA ROCHA JUNIOR
ANÁLISE PELO MÉTODO DA DIFUSÃO RADIAL DA
AÇÃO ANTIMICROBIANA DO CIMENTO PORTLAND
PURO E ACRESCIDO DE ANTIBIÓTICOS
BAURU
2013
HERNANDO VALENTIM DA ROCHA JUNIOR
ANÁLISE PELO MÉTODO DA DIFUSÃO RADIAL DA
AÇÃO ANTIMICROBIANA DO CIMENTO PORTLAND
PURO E ACRESCIDO DE ANTIBIÓTICOS
Tese apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Oral, área de concentração: Implantologia, sob orientação do Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth.
BAURU
2013
R672a
Análise pelo método da difusão radial da ação antimicrobiana do cimento Portland puro e acrescido de antibióticos / Hernando Valentim da Rocha Junior -- 2013.
69f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth
Tese (Doutorado em Biologia Oral - Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial) – Universidade Sagrado Coração – Bauru – SP.
1. Cimento Portland. 2. Antimicrobianos. 3. Cimentos endodônticos. 4. Teste de difusão em ágar. I. Weckwerth, Paulo Henrique. II. Título.
HERNANDO VALENTIM DA ROCHA JUNIOR
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO CIMENTO PORTLAND PURO E
ACRESCIDO DE AMOXICILINA E CIPROFLOXACINA PELO MÉTODO
DE DIFUSÃO RADIAL
Tese apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Oral, área de concentração: Implantologia, sob orientação do Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________________ Prof. Dr. Paulo Henrique Weckwerth-
PRPPG - Universidade Sagrado Coração
_________________________________________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Ricci Vivan
PRPPG - Universidade Sagrado Coração
_________________________________________________________________ Prof.Dr. Thiago A. Pegoraro -
PRPPG - Universidade Sagrado Coração
_________________________________________________________________ Prof Dr. Marco Antonio Húngaro Duarte
FOB - Universidade de São Paulo
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Diogo Souza Ferreira Rubim de Assis
CCS – Universidade Federal do Maranhão
Aos meus pais, à minha esposa e, principalmente, a meus filhos, Helena e Hugo.
5 AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Nicolas Homsi, meu mentor, meu mestre, meu amigo, não tenho palavras para lhe agradecer.
Aos meus padrinhos, Antonio e Givanilda, por sempre acreditarem tanto em mim, mesmo em alguns momentos em que nem eu acreditava. Vocês são incríveis!
Ao Prof. Mauro Tadeu Teixeira (in memorian), por ter me incentivado e despertado minha paixão pela Cirurgia.
Ao meu amigo e “irmão”, Dr. Luis Eduardo C. Campos, pela eterna paciência e compreensão.
Aos meus companheiros do Hospital Geral de Nova Iguaçu, principalmente Dr. Paulo Piloto, Dr. José Emilio, Dr. Roger Toshio, Dr. Fabrizio Albieri e Dr. Luis Fernando, pelo aprendizado constante e amizade sincera.
Ao Prof. Dr Paulo Weckwerth, pela orientação efetiva e pelo exemplo de humildade e presteza.
Ao Prof. Dr. Marco Antonio Húngaro Duarte, por personificar aquilo que considero um verdadeiro Mestre.
Ao Prof. Dr. Eduardo Sanches Gonçales, por sua franqueza, transparência e firmeza em suas opiniões e atitudes.
Ao Prof. Dr. Hugo Nary Filho, pela confiança depositada em mim.
À Prof.ª Dr.ª Mariza Akemi Matsumoto, exemplo de carinho e serenidade. À Prof.ª Dr.ª Leda Franciscone, pela atenção e apoio constante.
À minha turma de doutorado, particularmente Éliston, Francisco, Diogo, Eduardo Moreschi e Wilmar Gotardo. O que aprendi com vocês é inimaginável. Muito obrigado!
A toda equipe do Hospital Geral de Bonsucesso.
A todos os funcionários da Universidade Sagrado Coração e, particularmente, aos funcionários do biotério Sergio e Mateus, bem como o Wilson no laboratório, pelo carinho e dedicação.
Ao Dr. Bruno Duarte, pela ajuda constante.
A todos os meus residentes, por aturarem meu mau humor e minhas manias. A todos os amigos e pessoas que, de alguma maneira, contribuíram para minha formação profissional e/ou humana, tornando-me uma pessoa melhor.
RESUMO
Devido à uma ação antimicrobiana mais baixa do MTA (Mineral Trioxide Aggregate) em relação à alguns cimentos endodônticos seria de grande valia um incremento em sua atividade antimicrobiana. Dada a semelhança da composição e das propriedades mecânicas e biológicas entre MTA e cimento Portland, há uma tendência nas pesquisas atuais de analisar o desempenho o cimento Portland no lugar do MTA. Frente aos benefícios da adição de um antimicrobiano aos cimentos superarem suas desvantagens, desde que se tenha uma proporção em peso não superior a 10%, soa uma boa idéia a incorporação de um antimicrobiano ao cimento Portland, incrementando, assim, as vantagens da utilização clínica desse cimento no preenchimento dos canais radiculares e/ou na obturação retrógrada. O trabalho visou avaliar a atividade antimicrobiana do cimento Portland puro e com óxido de zircônia como agente radiopacificador na proporção de 50% em massa, quando da adição de dois tipos de antibióticos, a amoxicilina e o ciprofloxacino, frente a cinco tipos de microrganismos geralmente envolvidos na infecção maxilofacial: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, E. faecalis e C. albicans. Para este experimento, foram utilizados 15 placas de petri preparadas com o meio de cultura ágar Müller-Hinton, sendo escavados seis poços onde foram introduzidos os cimentos imediatamente após sua manipulação. Outras 15 placas foram preparadas de forma semelhante, cuja diferença básica foi a introdução do cimento após 24 horas de presa. Assim sendo, o desempenho do cimento Portland como veículo para antimicrobianos foi avaliado comparativamente in vitro. Os resultados mostraram uma atividade inibitória do cimento Portland contra C. albicans. Quando acrescido de ciprofloxacino o cimento apresentou atividade antibacteriana em todas as bactérias testadas ,tanto pré quanto pós presa, fato este que não ocorreu quando associou-se a amoxicilina ao cimento, visto que demonstrou atividade inibitória apenas contra E. coli e S. aureus no pré e pós presa e contra a E. faecalis somente no pré presa Como conclusão, obteve-se incremento de atividade antimicrobiana do cimento após a adição de antibióticos, particularmente o ciprofloxacino, e demonstrou-se que a adição de agente radiopacificador parece não influenciar a atividade antimicrobiana das composições do cimento Portland testadas.
Palavras-chave: Cimento Portland. Atividade Antimicrobiana. Amoxicilina. Ciprofloxacina. Difusão Radial
7
ABSTRACT
Due to a lower antimicrobial activity of MTA (Mineral Trioxide Aggregate) in relation to some sealers would be of great value an increase in their antimicrobial activity. Given similarity of the composition, mechanical and biological properties, there is a trend in current research is to use Portland cement there is a tendency in current research analyzing the performance of Portland cement in place the MTA. Facing the benefits of adding an antimicrobial cements to overcome its drawbacks, since it has a weight ratio not exceeding 10%, sounds a good idea to incorporate an antimicrobial Portland cement, increasing thus the benefits of clinical utilization of cement to fill root canals and / or retrograde filling. This study evaluated the antimicrobial activity of pure Portland cement and zirconium oxide as radiopacifiers agent in a proportion of 50% by mass, after the addition of two types of antibiotics amoxicillin and ciprofloxacin, opposite the 5 types of microorganisms generally involved in a maxillofacial infection: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, E. faecalis and C. albicans. For this experiment we used 15 Petri plates prepared with the Mueller-Hinton agar, and sixth wells excavated where the cements were introduced immediately after manipulation. Another 15 plates were prepared in a similar manner where the basic difference was the introduction of the cement after 24 hours of prey. Thus, the performance of Portland cement as a vehicle for antibiotics was evaluated comparatively in vitro. The results showed an inhibitory activity against C. Portland Cement albicans. When the cement plus ciprofloxacin showed antibacterial activity on all the bacteria tested, both pre and post prey, a fact that did not occur when amoxicillin was associated with the cement, since only showed inhibitory activity against E. coli and S. aureus before and after and arrested against E. faecalis only in pre prey In conclusion, there was obtained an increase of antimicrobial activity of the cement after adding antibiotics, particularly ciprofloxacin, and it was shown that addition of radiopacificador agent does not influence the antimicrobial activity of the compositions of Portland cement tested.
Keywords: Portland cement. Antimicrobial Activity. Amoxicillin. Ciprofloxacin. Radial diffusion
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Média do tamanho do halo de inibição formado em todas as placas
testadas (mm) ... 35
Tabela 2 – Padrão das comparações realizadas ... 36
Tabela 3 – Resultado de significância estatística ... 38
9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 9 2 OBJETIVOS ... 9 2.1 OBJETIVO GERAL ... 9 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 9
3 ARTIGO: ANÁLISE PELO MÉTODO DA DIFUSÃO RADIAL DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DE UM CIMENTO EXPERIMENTAL À BASE DE SILICATO DE CÁLCIO PURO E ACRESCIDO DE ANTIBIÓTICOS ... 9
REFERÊNCIAS ... 9
APÊNDICE A – FIGURAS ... 9
1 INTRODUÇÃO
O insucesso do tratamento endodôntico é determinado clinicamente pelo acompanhamento radiográfico, cujo surgimento, persistência ou aumento de uma lesão periapical passa a ser um importante indicativo de insucesso, assim como a persistência ou o aparecimento de sinais e sintomas do dente tratado endodonticamente. O acompanhamento por um período de quatro anos é considerado desejável para confirmar o sucesso da terapêutica endodôntica. Para resolução dos casos de insucesso, há duas modalidades de tratamento: o retratamento endodôntico e a cirurgia apical. O retratamento endodôntico é, de acordo com a maioria dos autores, o tratamento de primeira escolha, porém, a cirurgia periapical consiste em um tratamento adicional nos casos em que o retratamento fracassou ou não foi possível ser realizado1.
Allen et al2 e Hepworth & Friedman3, analisando o sucesso do retratamento endodôntico, encontraram uma taxa de aproximadamente 66%. Esse índice se apresenta modesto quando comparado à alta taxa de sucesso do tratamento endodôntico, que pode variar de 85% a 96%1. O menor índice de sucesso do retratamento endodôntico pode indicar, além de dificuldades técnicas devido a fatores iatrogênicos do tratamento anterior, uma dificuldade na eliminação da microbiota do canal radicular de dentes com insucessos do tratamento endodôntico1. Pinheiro1 mostra que a microbiota de canais com insucesso do tratamento endodôntico difere daquela encontrada normalmente em dentes necrosados e não tratados, tanto quantitativamente quanto qualitativamente, sendo caracterizada por um número limitado de microrganismos, com predominância de Gram-positivos. O Enterococcus faecalis é a espécie bacteriana mais frequentemente isolada, com prevalência variando entre 29% e 77% nos canais radiculares de dentes com insucesso endodôntico.
Informações sobre a natureza das infecções dos canais radiculares de dentes com tratamento endodôntico prévio associados a lesões periapicais têm aumentado nos últimos seis anos1. Estudos iniciais revelaram que a microbiota de canais radiculares de dentes com fracasso do tratamento endodôntico era diferente daquela encontrada em canais radiculares de dentes com polpas necrosadas e não tratados endodonticamente. Esses dados foram confirmados, posteriormente, pela maioria
dos estudos da microbiota de canais radiculares de dentes com insucesso do tratamento endodôntico.
Vários estudos têm demonstrado que a infecção de canais radiculares com polpas necrosadas e não tratados caracteriza-se pela presença de uma microbiota mista e polimicrobiana, comumente em combinações de quatro a sete espécies, predominantemente anaeróbia estrita, com relativo equilíbrio entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas1.
Espécies bacterianas pertencentes ao gênero Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Peptostreptococcus e Eubacterium são frequentemente cultivadas de canais radiculares infectados1.Moller4, realizando um estudo microbiológico de 654
canais radiculares de dentes com polpas vitais, polpas necróticas e com tratamento endodôntico prévio associado a lesões periapicais, relatou que a microbiota de canais radiculares de dentes com fracasso da terapia endodôntica era composta por um número menor de microrganismos quando comparada aos dentes com polpas necróticas, apresentando uma média de 1,6 espécies bacteriana por canal. Dos 264 dentes estudados com tratamento endodôntico prévio, 120 (45,5%) apresentaram culturas positivas. Os autores relataram que havia equilíbrio entre as bactérias anaeróbias facultativas e estritas e um predomínio de bactérias Gram-positivas, compreendendo 80% dos isolados. Espécies dos gêneros Streptococcus, Enterococcus, Peptostreptococcus, Lactobacillus e Eubacterium foram isoladas frequentemente, enquanto Prevotella e Fusobacterium foram menos frequentes. Enterococcus faecalis foi isolado em 29% dos casos que apresentavam culturas positivas.
Engström5, investigando a presença de Enterococcus spp nas infecções endodônticas, verificou que estavam presentes em 20,9% das amostras de dentes com tratamento endodôntico prévio, enquanto representavam 12,1% das amostras de polpas necrosadas. O autor ressaltou, em seu trabalho, a dificuldade em eliminar esses microrganismos dos canais radiculares, constituindo um problema na terapêutica endodôntica.
Molander et al6 analisaram o estado microbiológico de 100 dentes tratados endodonticamente com periodontite apical visível radiograficamente. Os resultados mostraram que havia bactérias presentes em 68 dentes, porém, o uso de clorofórmio para a desobstrução do conduto foi considerado um fator influente, diminuindo o crescimento bacteriano. Dos 21 casos em que se utilizou clorofórmio, houve
crescimento bacteriano em apenas dez casos (47,3%), enquanto nos 79 dentes restantes o crescimento foi detectado em 58 canais (73,4%). Um total de 117 linhagens microbianas foram isoladas, com 114 bactérias e três fungos. A maioria dos canais continha uma ou duas espécies bacterianas (85% dos casos). As bactérias anaeróbias facultativas Gram-positivas predominaram, constituindo 69% das espécies isoladas. Os microrganismos isolados foram: Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Actinomyces, Veillonella, Fusobacterium, Prevotella e Candida foram os principais gêneros isolados. Enterococcus foi o gênero bacteriano mais frequentemente isolado, presente em 47% dos canais com bactérias. Os autores concluíram que a microbiota dos dentes tratados endodonticamente diferenciava, tanto quantitativamente quanto qualitativamente, dos dentes com polpas necrosadas.
Peciuliene et al7 investigaram a ocorrência de fungos, bacilos entéricos Gram-negativos e Enterococcus em 40 dentes tratados endodonticamente, assintomáticos, e com periodontites apicais visíveis radiograficamente. Foram detectados microrganismos em 33 dos 40 dentes. Havia fungos presentes em seis canais (18% das culturas positivas) e foram identificados como Candida albicans em todos os casos. Bacilos entéricos Gram-negativos estavam presentes em três casos: Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli. Enterococcus estavam presentes em 21 canais (64% das culturas positivas), sendo o principal ou o único componente da microbiota em 19 casos. Todas as cepas foram identificadas como Enterococcus faecalis.
Estudos têm revelado um aumento surpreendente da resistência antimicrobiana do Enterococcus, especialmente os isolados de infecções hospitalares1. Eles possuem mecanismos que conferem resistência a uma variedade de antibióticos comumente utilizados na terapêutica.
As bactérias são microrganismos procariotas, unicelulares e se reproduzem apenas assexuadamente. Caracterizam-se pela capacidade de adaptação rápida a alterações no meio ambiente, crescendo e dividindo-se rapidamente. Tipicamente, as células procariotas apresentam taxas metabólicas (quantidade de substrato ou oxigênio consumida por hora e por unidade de massa celular) entre dez a 100 vezes superior às das células eucariotas. Essa capacidade, aliada à composição química, estrutura, características bioquímicas e genéticas, faz das bactérias um objeto ideal para o estudo do crescimento celular, desenvolvimento e aplicação de novos métodos de engenharia genética e metabólica e desenvolvimento de processos industriais de produção de proteínas recombinadas8.
Escherichia coli
A bactéria Escherichia coli foi descrita pela primeira vez em 1885, por Theodor Escherich, um bacteriologista alemão, que a designou como bacterium coli commune. O nome Escherichia coli refere-se a um grupo de bactérias constituído por diferentes estirpes que têm em comum várias características. A E. coli, como microrganismo procariota, é relativamente pequena e simples. Sua dimensão típica é de 0,5 μm de diâmetro e 1,5 μm de comprimento, apresentando forma de bastonete8.
A grande maioria das amostras é pertencente à microbiota intestinal, tanto de seres humanos quanto de outros animais de sangue quente. No entanto, aproximadamente, 10% são patogênicas, podendo causar infecções intestinais e infecções extraintestinais9.
As células dessa bactéria são formadas especialmente por compostos orgânicos, sendo sua constituição média obtida por análise elementar em peso seco de 50% de carbono; 20 de oxigênio; 14% de azoto; 8% de hidrogênio; 3% de fósforo; 2% de potássio; 1% de enxofre, 0,05% de cálcio, magnésio e cloro; 0,2% de ferro, e um total de 0,3% de minerais como magnésio, cobalto, cobre, zinco e molibdênio8. A E. coli é uma bactéria Gram-negativa, cuja célula é revestida pela membrana citoplasmática, uma parede fina de mureína e uma membrana exterior. Em determinadas condições, pode, ainda, observar-se uma camada viscosa de polímeros, essencialmente polissacarídeos, designada por cápsula. Essa estrutura tem um papel preponderante na capacidade de a E. coli se proteger de condições
ambienteais adversas, facilitando-lhe a adesão a superfícies. Tipicamente, possui dois tipos de apêndices superficiais: os flagelos e as fímbrias. Ambos surgem da membrana citoplasmática e são essencialmente agregados de proteínas. Apesar da composição semelhante, têm funções distintas. Há, ainda, as fímbrias sexuais, que permitem a transferência do DNA durante a conjugação bacteriana8.
Staphylococcus aureus
Os Staphylococcus são cocos Gram-positivos, catalase positivos, com aproximadamente 0,5 a 1,5 μm de diâmetro, imóveis, não esporulados e geralmente não encapsulados. Essa bactéria pode se apresentar em diversos arranjos, que vão desde isolados, aos pares, em cadeias curtas ou agrupados irregularmente (com aspecto semelhante a um cacho de uvas), devido à divisão celular, que ocorre em três planos perpendiculares. O Staphylococcus foi descrito pela primeira vez em 1880, em pus de abscessos cirúrgicos, pelo cirurgião escocês Alexandre Ogston e, atualmente, é um dos microrganismos mais comuns nas infecções piogênicas em todo o mundo10.
O gênero Staphylococcus pertence à família Micrococcaceae, juntamente como os gêneros Planococcus, Micrococcus e Stomatococcus. Atualmente, o gênero Staphylococcus possui 33 espécies, sendo que 17 delas podem ser isoladas de amostras biológicas humanas. Geralmente, esse gênero faz parte da microbiota da pele humana normal e de outros sítios anatômicos. A espécie de maior interesse médico, principalmente em ambiente nosocomial; o S. aureus está frequentemente relacionado a infecções severas10.
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno humano frequentemente associado a infecções hospitalares, acometendo, principalmente, pacientes imunossuprimidos. Essa espécie bacteriana tem sido considerada um patógeno oportunista, uma vez que, raramente, está associada a infecções comunitárias em indivíduos imunocompetentes.
Pseudomonas aeruginosa pertence à família Pseudomonadaceae e se apresenta na forma de bastonetes de 0,5 a 0,8 μm de largura por 1,5 a 3,0 μm de comprimento. É um bacilo Gram-negativo, aeróbio, não esporulado, não fermentador de glicose e móvel devido à presença de um flagelo polar. As células de P. aeruginosa podem ser visualizadas ao microscópio como isoladas, aos pares ou em cadeias curtas11.
O primeiro relato desses microrganismos foi realizado por Luke, em 1862, com observação de pus de cor azul esverdeada presente em algumas infecções purulentas. Essa mesma coloração havia sido relatada por outros pesquisadores e, devido a esse fato, inicialmente foi chamada Bacillus pyocyaneus. Suas colônias têm variação morfológica, podendo ser puntiforme, gelatinosa, rugosa ou mucosa. A forma mucoide ocorre devido à produção de grandes quantidades de um polissacarídeo extracelular, o alginato, identificada em amostras clínicas de portadores de fibrose cística12. Cepas mucoides formam agregados de colônias mais firmes, que superam os mecanismos de defesa e permitem maior aderência a superfícies celulares. A composição física e química (polianiônica) da membrana externa desse microrganismo demonstra poder de barreira à passagem de substâncias, como antibióticos e antissépticos, que precisam saturar toda a superfície antes da penetração, conferindo maior resistência a essas cepas13.
A bactéria P. aeruginosa é invasiva e toxigênica. Além dos componentes da superfície celular, produz metabólitos extracelulares (elastases, proteases) envolvidos na patogênese das infecções.
P. aeruginosa pode colonizar vários tecidos, devido principalmente à presença de fímbria e à cápsula mucoide (alginato). A cápsula possibilita aderência à superfície da mucosa normal, é antifagocitária e permite também a formação de microcolônias, denominadas biofilme, que são fortemente aderidas e recobertas por um material espesso, constituído pelo próprio alginato, lipopolissacarídeo (LPS) e proteína14. Em sua maioria, os biofilmes estão presentes em próteses vasculares, articulares, cateteres, drenos e pulmões de indivíduos acometidos por fibrose cística15.
Em relação à invasão tecidual por P. aeruginosa, fosfatase alcalina, exoenzima S, citotoxina, elastase, exotoxina A, lipase e fosfolipase são os principais produtos extracelulares relacionados a esse processo. A bactéria pode ser isolada de água, plantas, solo e tecidos animais e tem habilidade de utilizar vários substratos orgânicos como fontes de carboidrato.
Essa capacidade de sobreviver em diferentes ambientes torna-a uma bactéria ubíqua. Sua presença na água do solo contribui para que chegue aos vegetais e até ao intestino humano. Por ter predileção por locais úmidos, é encontrada com maior facilidade em áreas do corpo humano como orofaringe, axilas, períneo e mucosa nasal, sendo o trato gastrointestinal sua principal área de colonização11.
A colonização em pacientes hospitalizados pode exceder a 50%, principalmente em pacientes internados em UTIs, que facilmente são colonizados devido à constante exposição a procedimentos invasivos. Em pacientes com ventilação mecânica, 75% das pneumonias são causadas por bactérias Gram-negativas e, entre elas, a P. aeruginosa é a primeira causa.
Enterococcus faecalis
Enterococcus compõe um grupo de bactérias Gram-positivas associadas a infecções endodônticas em odontologia. No entanto, essas espécies correspondem a uma porcentagem muito pequena da microbiota bacteriana inicial de dentes com polpas necróticas sem tratamento16. É frequentemente encontrado em canais obturados, exibindo sinais de periodontite crônica apical. Estudos in vitro demonstraram a capacidade do E. faecalis em penetrar nos túbulos dentinários, habilidade essa não demonstrada por todas as espécies bacterianas17. Do ponto de vista microbiológico, os enterococos apresentam poucas exigências para o seu crescimento, sendo capazes de crescer em temperatura de 10 a 45°C, pH 9,6 em 6,5% de solução salina, e sobreviver a 60°C por 30 minutos. São microrganismos facultativos, catalase negativos.
E. faecalis apresenta resistência aos efeitos antimicrobianos do hidróxido de cálcio, provavelmente devido ao efetivo sistema de bombeamento de prótons que mantém níveis de pH citoplasmático ótimos dificultando o tratamento endodôntico17. É ainda o microrganismo mais comumente isolado de dentes com infecções pós-tratamento endodôntico17.
A habilidade de formação de biofilme pelo gênero Enterococcus permite a colonização de superfícies inertes e biológicas; protege contra agentes antimicrobianos e ação de fagócitos, mediando adesão e invasão de células do hospedeiro. Além da formação de biofilme, os fatores de virulência mais citados na literatura são a produção de substância de agregação, adesinas de superfície, ácido
lipopoliteicoico, produção extracelular de superóxido, enzima lítica gelatinase e hialuronidase. Cada um desses fatores pode estar associado a vários estágios de infecções endodônticas, bem como à inflamação periapical. As bacteriocinas de Enterococcus, por exemplo, AS-48, têm importância na dominância de E. faecalis em infecções endodônticas persistentes18.
A substância de agregação (AS) é uma adesina bacteriana, codificada por plasmídio, que responde a feromônios e realiza eficiente contato entre hospedeiro e receptor bacteriano, facilitando a troca de plasmídios18. Esse contato depende de uma substância ligante, também codificada por plasmídios. Espécies que não são codificadas por essa substância ligante não conseguem eficiente ação do AS19. A substância agregativa é de natureza proteica e sua expressão na superfície da célula pode ser induzida por soro20.
A AS tem sido responsável por promover adesão direta, independentemente de opsonina, E. faecalis, neutrófilos humanos pelo mecanismo mediado por receptores do sistema complemento, tornando essas cepas de E. faecalis resistentes à fagocitose por neutrófilos18. Espécies que possuem AS realizam produção extracelular de superóxidos, os quais contribuem para o dano tecidual em infecções. E. faecalis também produz a enzima hialuronidase, atuando no ácido hialurônico encontrado no tecido conjuntivo humano, facilitando a disseminação bacteriana. Essa enzima já foi isolada de dentina cariada, apresentando participação na destruição dentinária durante o processo de cárie. A presença da hialuronidase constitui-se um fator auxiliar na disseminação de uma infecção pulpar para a região periapical, no entanto, esse fator ainda não foi comprovado. Para a bactéria ser patogênica, ela deve essencialmente aderir-se aos tecidos, invadi-los, multiplicar-se e sobreviver aos mecanismos de defesa do hospedeiro e a outras bactérias, em competição, e então produzir dano tecidual17.
E. faecalis apresenta em sua parede celular o ácido lipopoliteicóico (LTA), auxiliando na ligação das bactérias às células eucarióticas, incluindo linfócitos17. O LTA estimula reabsorção óssea, além de estimular diversas células polimorfonucleadas a liberarem mediadores inflamatórios, contribuindo para o dano tecidual18. E. faecalis tem os requisitos para estabelecer uma infecção endodôntica e manter a resposta inflamatória potencialmente danosa ao hospedeiro. Ocorrendo contaminação do canal radicular por E. faecalis, este pode aderir-se à parte mineral da dentina por meio do LTA e ao colágeno por AS18.
Fungos
Durante muito tempo, foram considerados vegetais. Em 1969, passaram a ser classificados como um reino à parte, denominado Fungi. Apresentam um conjunto de características que permitem sua diferenciação de plantas: não sintetizam clorofila, nem qualquer pigmento fotossintético, não têm celulose na parede celular (exceto alguns fungos aquáticos) e não armazenam amido como substrato de reserva. Os fungos são ubíquos, encontrando-se em vegetais, no solo, animais e homens. São seres vivos eucarióticos com um só núcleo, como as leveduras; e multinucleados, como os fungos filamentosos ou bolores e cogumelos21.
Candica albicans
C. albicans é, sem dúvida, a espécie mais frequentemente isolada de infecções superficiais e invasivas em diversos sítios anatômicos e causa de candidíase em todas as partes do mundo. É a espécie de Candida com maior potencial patogênico, devido à diversidade de fatores de virulência descobertos. Habitualmente, considera-se que a origem de C. albicans, causadora de infecções, considera-seja a microbiota do trato digestório humano (organismo comensal), porém, diversos casos têm sido relatados de forma horizontal21.
C. albicans foi o primeiro fungo zoopatogênico que teve o genoma sequenciado (organismo diploide com oito pares de cromossomos), possibilitando uma variedade de experimentos e, por conseguinte, grande avanço na biologia desse fungo, principalmente na expressão dos genes. A espécie é naturalmente sensível a todas as drogas antifúngicas de uso sistêmico, mas casos de resistência adquirida a azólicos são conhecidos em pacientes expostos prolongadamente a tais medicamentos21.
Espécies de Candida residem como comensais, fazendo parte da microbiota normal dos indivíduos sadios. Todavia, quando há uma ruptura no balanço normal da microbiota ou o sistema imune do hospedeiro encontra-se comprometido, as espécies do gênero Candida tendem a manifestações agressivas, tornando-se patogênicas21.
Quanto à origem, pode ser endógena, quando oriunda da microbiota ou exógena, como uma doença sexualmente transmissível (DST)21. As leveduras do
gênero Candida têm grande importância, pela alta frequência com que infectam e colonizam o hospedeiro humano.
Espécies de Candida são encontradas no tubo gastrointestinal em 80% da população adulta saudável. Entre as mulheres, cerca de 20 a 30% apresentam colonização por Candida vaginal, e, em hospitais, essa levedura responde por cerca de 80% das infecções fúngicas documentadas, representando grande desafio aos clínicos de diferentes especialidades devido às dificuldades diagnósticas e terapêuticas das infecções causadas por tais agentes22.
Infecções por Candida envolvem um espectro amplo de doenças superficiais e invasivas oportunistas, acometendo pacientes expostos a uma grande diversidade de fatores de risco. Infecções de pele e mucosas podem ser documentadas em pacientes saudáveis, mas com pequenas alterações locais de resposta do hospedeiro no sítio da infecção. Por outro lado, infecções sistêmicas por Candida podem comprometer vísceras como resultado de disseminação hematogênica, complicações infecciosas – essas geralmente documentadas em pacientes críticos, portadores de doenças degenerativas e/ou neoplásicas22.
A biologia de C. albicans apresenta diferentes aspectos, entre eles, a habilidade de se apresentar com distintas morfologias. A fase unicelular leveduriforme pode gerar um broto e formar hifas verdadeiras. Entre esses dois extremos, brotamento e filamentação, o fungo ainda pode exibir uma variedade de morfologias durante seu crescimento, formando assim as pseudo-hifas, que, na realidade, são leveduras alongadas unidas entre si. A mudança na morfologia de fase leveduriforme para filamentosa pode ser induzida por uma variedade de condições ambientais, como variação de temperatura e pH22.
Numerosos fatores contribuem para as infecções fúngicas, dentre eles, pode-se destacar: rompimento das barreiras cutânea e mucosa; disfunção dos neutrófilos; defeito na imunidade mediada por células; desordem metabólica; exposição direta aos fungos; extremos de idade (recém-nascidos e idosos); desnutrição aguda; longo tratamento com antibióticos; quimioterapia; transplantes; resistência a antifúngicos, dentre outros23.
Os microrganismos comensais tornam-se patogênicos, caso ocorram alterações nos mecanismos de defesa do hospedeiro (imunodepressão) ou o comprometimento de barreiras anatômicas secundárias, como queimaduras ou procedimentos médicos invasivos. Alterações dos mecanismos de defesa do
hospedeiro podem ser decorrentes de mudanças fisiológicas características da infância (prematuridade) e do envelhecimento ou, mais frequentemente, associadas a doenças degenerativas, neoplásicas, imunodeficiências congênitas ou adquiridas e imunodepressão induzida por atos médicos23.
C. albicans tem sucesso em ambos os casos, como comensal e como patógeno em hospedeiros humanos e animais, podendo colonizar em larga extensão diferentes sítios anatômicos. A transição do estado comensal para “parasita” requer um hospedeiro suscetível, mas também um processo de ativação. A expressão gênica de C. albicans é regulada por uma interação entre hospedeiro e patógeno. Programas transcricionais associados à transformação de estado leveduriforme para estado filamentoso contribuem também para a invasão no hospedeiro. Isso não é apenas o primeiro passo para a transição de comensal a “agressor”, mas prepara a Candida para os subsequentes passos da infecção21.
Enquanto a hifa é a morfologia que melhor transpõe barreiras, devido ao seu desenvolvimento filamentoso, a fase leveduriforme, por sua morfologia arredondada, é a melhor para a disseminação eficiente. Em geral, a forma de levedura predomina durante a colonização no hospedeiro sadio, enquanto as hifas surgem frente à deficiência do sistema imune. Portanto, ambas as formas são de grande importância na patogênese, uma vez que elas são requeridas em diferentes situações no hospedeiro21.
A patogênese da candidíase é facilitada por vários fatores de virulência envolvidos em funções, tais como21: aderência às células do hospedeiro pelas adesinas; morfogênese (dimorfismo fúngico); variação fenotípica; sobrevivência dentro de fagócitos; modulação do sistema imune; sequestro de ferro; variação de temperatura e do pH; toxinas e enzimas hidrolíticas.
Sabe-se que nenhum fator de virulência é dominante, ou seja, a patogênese depende de uma expressão coordenada de múltiplos genes de uma forma apropriada para as condições do sítio de infecção e fatores ligados ao hospedeiro. Considerando-se que as condições diferem muito nos diversos sítios de infecção, é bem provável que genes selecionados associados à virulência sejam importantes para tipos específicos de candidíase. Mas essa hipótese não tem sido muito avaliada. Além disso, a extensão com que os fatores de virulência contribuem para a colonização ou para o processo de doença não está definitivamente esclarecida21.
Antibioticoterapia e resistência microbiana
A amoxicilina é uma penicilina semissintética de amplo espectro, atuando em Gram-negativos e Gram-positivos, mas é inativada por betalactamases, sendo considerada o antibiótico de primeira escolha no tratamento empírico das infecções bucais e maxilofaciais24-26.
Assim sendo, Castilho et al27 demonstraram que esse é o antibiótico mais prescrito por dentistas brasileiros, totalizando 50,06% dos antibióticos prescritos.
A introdução de fluoroquinolonas, grupo ao qual pertencem a norfloxacina e ciprofloxacina, na década de 1980, significou, sem dúvida, um avanço no tratamento de infecções por bactérias multirresistentes, particularmente infecções do trato urinário, visto que diversas cepas de bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos mostraram-se sensíveis a esse novo grupo de medicamentos. Trabalhos mais recentes, no entanto, têm alertado para um aumento da frequência de bactérias resistentes às quinolonas28.
São medicamentos onerosos e, dentre o grande número de substâncias que compõem esse grupo, os mais citados para uso em Odontologia são a ciprofloxacina e a levofloxacina. Não há muitos estudos analisando a eficácia desses medicamentos no tratamento das infecções odontogênicas e, dentre eles, há relatos conflitantes quanto ao espectro de ação da ciprofloxacina contra bactérias isoladas a partir de lesões orais. Dessa forma, a indicação do uso de quinolonas no tratamento de infecções odontogênicas parece carecer de suporte científico27.
Enterococcus faecalis são microrganismos resistentes a diversos antibióticos (tetraciclina e gentamincina). Enterococcus ssp são suscetíveis à ampicilina, benzilpenicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina, rifampicina, estreptomicina e vancomicina18.
Enterococcus spp apresentam sensibilidade reduzida à penicilina, embora sejam um pouco mais sensíveis à amoxicilina e à ampicilina – antibióticos que têm apenas um efeito bacteriostático sobre a maioria dos Enterococcus spp. O grupo das penicilinas age inibindo a síntese da parede celular. O anel betalactâmico é a chave do modo de ação das penicilinas, pois se ligam a enzimas envolvidas no processo de síntese da parede celular, inativando-as. Ocasionalmente, a alta resistência desse microrganismo se deve à produção de beta-lactamases, enzimas que têm a propriedade de destruir o anel beta-lactâmico de algumas penicilinas18.
Resistência aos agentes antimicrobianos pode ser adquirida por uma mutação no DNA existente ou por aquisição de um novo DNA. Enterococos têm adquirido determinantes genéticos que conferem resistência a várias classes de antibióticos, incluindo eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol e, mais recentemente, vancomicina18.
Pinheiro1 concluiu, em seu estudo com cepas bacterianas isoladas de dentes com canais tratados que apresentavam sintomatologia clínica ou achados radiográficos, os seguintes pontos: a) a microbiota dos canais de dentes tratados endodonticamente foi composta por um número limitado de espécies microbianas, predominantemente Gram-positivas. Anaeróbios facultativos, especialmente Enterococcus faecalis, são os microrganismos mais comumente isolados; b) infecções polimicrobianas e anaeróbios estritos são frequentemente encontrados em canais de dentes tratados endodonticamente com sintomatologia clínica; c) as cepas de Enterococcus faecalis isoladas foram sensíveis, in vitro, a amoxicilina e amoxicilina associada ao ácido clavulânico; d) todos os microrganismos isolados foram sensíveis à vancomicina e moxifloxacina. A maioria desses mesmos microrganismos era sensível a cloranfenicol, ciprofloxacino, tetraciclina ou doxiciclina. Eritromicina e azitromicina foram menos eficazes contra essas cepas estudadas.
A resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos pode ser intrínseca ou adquirida. A resistência intrínseca é uma propriedade natural da célula bacteriana e comumente se manifesta pela diminuição da captação dos agentes ou pela produção de enzimas que inativam o agente químico. A resistência adquirida pode ser obtida pela bactéria por meio de mutações ou por processos de recombinação gênica. As infecções por P. aeruginosa adquiridas em hospitais são marcadas por uma forte característica: a multirresistência. A maioria das amostras resistentes é isolada nas UTIs, refletindo o maior uso de antimicrobianos nesse ambiente e possivelmente a transmissão de cepas multirresistentes entre os pacientes. Esses dados podem ser confirmados pelo relatório anual do sistema National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) de 2004, que relata a resistência a ciprofloxacina, imipenem, ceftazidima e piperacilina 1,5 a 3 vezes maior em amostras isoladas de pacientes internados em UTIs do que nas amostras de pacientes internados em enfermarias e ambulatórios. Vários antibióticos, como algumas penicilinas, cefalosporinas, carbapenens, monobactâmicos, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, além das polimixinas, conseguem vencer os mecanismos inerentes a estas bactérias
e podem ser ativos contra muitas amostras. Entretanto, os processos de mutação ou aquisição de novos genes podem levar à resistência a estes antimicrobianos11.
Na década de 1940, a grande maioria dos Staphylococcus aureus era sensível à penicilina. No fim dos anos 1950, essa espécie tinha adquirido resistência a praticamente todos os antibióticos de uso parenteral, incluindo a eritromicina e a tetraciclina. A introdução das penicilinas resistentes a penicilinases, na década de 1960, possibilitou avanço na terapêutica antiestafilocócica. Devido ao uso das penicilinas semissintéticas, como a meticilina empregada no tratamento de infecções estafilocócicas, surgiram cepas resistentes à meticilina denominadas MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus), cujo padrão de resistência se estende a outros antibióticos beta-lactâmicos. Em 1997, foram descobertas amostras de S. aureus resistentes aos glicopeptídeos denominadas VRSA (vancomycin resistant Staphylococcus aureus)29.
Felizmente, esses microrganismos ainda mantêm boa sensibilidade à oxacilina e às cefalosporinas da primeira geração na maioria dos isolados do meio extra-hospitalar no Brasil, possibilitando o uso desses antimicrobianos nas infecções estafilocócicas comunitárias, bem como algumas cepas ainda não se apresentam resistentes à amoxicilina1.
Cimento Portland
A similaridade de composição entre MTA (minetral trioxide aggregade) e o cimento Portland tem sido descrita em vários estudos30-37. Portanto, o cimento Portland, com adição de 4:1 de óxido de bismuto, é comercializado como MTA34. Dada essa similaridade da composição entre esses dois compostos, alguns autores têm sugerido a troca de um pelo outro no tratamento de lesões endodônticas35,37. Portanto, o fato de o MTA ser essencialmente o cimento Portland com adição de óxido de bismuto, como agente radiopacificador, tem estimulado estudos objetivando o uso do Cimento Portland (PC) como uma alternativa ao MTA. A semelhança entre esses cimentos não ocorre somente na composição, mas também na ação antimicrobiana e propriedades biológicas36. Essa substituição apresenta um aspecto importante sob o ponto de vista econômico, visto que o MTA é muito mais caro que o cimento Portland34,37. Assim sendo, o emprego de técnicas visando resolver
problemas endodônticos que utilizam o MTA como base – e hoje se encontra inviável no sistema de saúde pública no Brasil – poderia ser disponibilizado a todos os usuários do Sistema Único de Saúde (SUS).
Dentre os requisitos básicos de um material retro-obturador, espera-se que este previna a proliferação de microrganismos38. Assim, vários estudos sobre ação antimicrobiana do cimento Portland foram publicados. Asgary e Kamrani39 realizaram um estudo no sentido de avaliar a atividade antibacteriana de cinco tipos de material de preenchimento de canais radiculares. Foram testados MTA branco e cinza, hidróxido de cálcio (HC), cimento Portland e um novo cimento endodôntico (NEC). Esses cimentos foram testados frente às cepas de Pseudomonas aeruginosa, E. faecalis, S. aureus, E. coli e todas essas misturadas, em um teste de difusão em ágar (ADT). Demonstrou-se, após as medidas dos halos de inibição, que todos os materiais testados inibiram crescimento de todas as bactérias testadas e os melhores resultados foram do NEC e do HC. MTA e Portland obtiveram resultados semelhantes. Esses resultados contrariam o descrito por Torabinejad38, que não encontrou em seus experimentos eficiência antibacteriana do MTA contra E. faecalis, P. aeruginosa, E. coli e S. aureus.
Estrela40 também não encontrou atividade antimicrobiana contra E. faecalis, P. aeruginosa e C. albicans, tanto para o MTA quanto para o cimento Portland. Em outro estudo, dois tipos de MTA e o cimento Portland foram testados contra cepas de P. aeruginosa, E. coli, E. faecalis e Bacteroides fragilis em teste de ADT e incubados em atmosfera de anaerobiose, exceto a P. aeruginosa. Como resultados, MTA e PC inibiram apenas o crescimento de P. aeruginosa41. Em extensa revisão bibliográfica, Torabinejad30 mostrou quatro estudos em que o MTA inibiu crescimento de C. albicans, enquanto em outros três estudos, o MTA não teve efeito sobre esse microrganismo.
Dessa forma, fica claro que não há consenso sobre o espectro de microrganismos sensíveis à ação antimicrobiana do MTA e, consequentemente, do cimento Portland.
O óxido de bismuto é adicionado ao MTA como agente radiopacificador42,43. Em seu trabalho, Parirokh e Torabinejad30 realizaram extensa revisão de literatura sobre as propriedades antimicrobiana do MTA e demonstraram que o bismuto afeta o precipitado após a hidratação do MTA, basicamente o hidróxido de cálcio. Devido ao fato de o óxido de bismuto se dissolver em meios ácidos, especula-se, portanto,
que a colocação do MTA em meios ácidos, tal qual em processos inflamatórios, poderia resultar em liberação do óxido de bismuto. Dessa forma, pode haver diminuição da biocompatibilidade do MTA, pois o óxido de bismuto não encoraja a proliferação celular em culturas de células.
Camilleri44 afirma que a adição de óxido de bismuto reduz a liberação de hidróxido de cálcio, aumenta a solubilidade do material e causa a deteriorização da estabilidade dimensional do material. Cornélio et al45 concluíram que o óxido de zircônia e o tungstato de cálcio podem ser uma boa alternativa como agente radiopacificador.
Weckwerth et al46 demonstraram que o óxido de zircônia como agente radiopacificador na proporção de 20% em massa mostrou menor solubilidade que os compostos radiopacificadores à base de bismuto, a capacidade de alcalinização foi similar ao cimento Portland branco puro, e atividade antifúngica contra C. albicans superior aos demais cimentos testados. Como conclusão os autores relatam que radiopacificadores à base de bismuto tem uma influência negativa sobre o cimento Portland branco enquanto o óxido de zircônia não afeta o desempenho deste cimento.
O teste de difusão em ágar, também chamado difusão em placas, é um método físico, no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do microrganismo desafiado com a concentração da substância ensaiada47 sendo o método mais comumente usado para avaliar a atividade antimicrobiana dos cimentos endodônticos48.
O método padronizado recomendado atualmente pelo Subcomitê para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana do NCCLS( National Committee for Clinical and Laboratory Standards) baseia-se no método descrito originalmente por Bauer et al, em 196649.
Devido ao fato de muitos materiais atualmente utilizados para o preenchimento dos canais radiculares não promoverem perfeito selamento de espaços microscópicos existentes na interface com as paredes dos canais, onde os microrganismos e seus produtos podem penetrar, esses materiais idealmente deveriam possuir alguma atividade antimicrobiana50.
Em que pese o fato do ADT ser um teste semiquantitativo e relativamente insensível, não distinguindo entre efeitos bactericida e bacteriostático de um
material, ele foi usado neste estudo, pois se trata do método mais utilizado in vitro para avaliação de atividade antimicrobiana dos materiais, proporcionando comparação direta entre eles50,51.
A ideia de acrescentar antibióticos aos cimentos parece ser pragmática em sua origem. O conceito de utilizar os cimentos como um depósito de antibióticos faz sentido, ao passo que permite a liberação do fármaco diretamente no sítio da iminente infecção52.
O primeiro relato de utilização de cimento carregado com antibióticos foi descrito por Buchholz e Engelbrecht em 1970, conforme afirma Klekamp et al53. O interessante dessa técnica é a possibilidade de disponibilizar altas doses de antibióticos localmente, com baixa toxicidade sistêmica. Deve-se ressaltar que o sucesso da idéia depende do antibiótico escolhido, que deve ser guiado pela susceptibilidade dos microrganismos envolvidos, sejam eles empíricos ou comprovados53.
Os antibióticos liberados pelos cimentos ósseos, por exemplo, seguem um modelo tipicamente bifásico. Numa primeira fase, existe um pico de liberação, seguido então por uma longa “cauda” de baixa liberação que continua por dias e até meses52. A eficiência de cimentos ósseos carregados com antibióticos na prevenção de infecções pode ser ilustrada pela seguinte observação: em período anterior e após a adição de antibióticos ao cimento ósseo Palacos®, uma drástica redução de infecção foi notada. Mesmo em técnicas assépticas, houve queda adicional da taxa de infecção após procedimentos primários usando cimentos ósseos carregados de gentamicina. Semelhantemente nos casos de revisões cirúrgicas secundárias, houve benefício adicional no uso de cimentos ósseos carregados com antibióticos52. A adição de antibióticos aos cimentos pode resultar em diminuição das propriedades mecânicas, embora alguns estudos tenham fracassado ao demonstrar alguma significância estatística nas forças de compressão e de tensão52. Em geral, não mais que 10% de redução das forças dos cimentos ósseos são consideradas aceitáveis para artroplastia total53. Ginebra54 demonstrou que, em geral, os cimentos de apatita com antibióticos tenderam a aumentar o tempo de presa e reduzir as forças mecânicas, por exemplo, ao se incorporar diferentes concentrações de antibióticos, porém, todas as concentrações utilizadas foram superiores a 10% em peso. Seguindo o exemplo anterior, Pelletier55 relatou que alguns cimentos com baixas doses de antibióticos são disponíveis comercialmente fora dos Estados Unidos e,
recentemente, receberam aprovação do FDA (Food and Drug Administration) para serem vendidos. Demonstrou-se, em seu estudo, que a força de compressão de dois cimentos (Simplex P® da Striker® e o Versabond® da Smith & Nephew®), com duas concentrações de antibióticos (4,8% em peso e 13% em peso), foram afetadas. As amostras foram analizadas em 24 h e, em quatro semanas, com e sem antibióticos. Em 24 h, as propriedades de compressão do Versabond® foram superiores ao Simplex P®, sem adição de antibióticos. A força de compressão de todas as amostras foram superiores ao preconizado pela ASTM F541 e a ISO 5833, com um mínimo de 70 MPa. As propriedades compressivas do VersaBond® foram afetadas nas duas concentrações de antibiótico, enquanto o SimplexP® foi afetado apenas na dose mais alta. Não houve diferenças estatísticas na comparação dos dois cimentos entre as duas concentrações de antibiótico. Em quatro semanas, houve redução das propriedades mecânicas nos dois cimentos carregados com os antibióticos. Os cimentos nas concentrações de 13% em peso demonstraram-se mais fracos que o com 4,8% em peso, mas apenas o SimplexP®, com 13%, ficou abaixo do 70 MPa recomendado com 67,8+6,9 MPa, ficando o VersaBond® com 71+ 3,06 MPa55.
Parece que a utilização do cimento Portland em lugar do MTA é possível e a adição do óxido de zircônia no lugar do óxido de bismuto pode ser uma boa alternativa, eliminando-se as desvantagens do bismuto. Também parece ser benéfica a adição de antibióticos aos cimentos sem significante redução de suas propriedades mecânicas, desde que essa adição não ultrapasse uma concentração superior a 10% em peso.
Diante do exposto, fica clara a controvérsia sobre a atividade antimicrobiana do cimento Portland e a adição de antimicrobianos ao cimento, até determinada proporção, pode ser benéfica, sem afetar as propriedades mecânicas. Na literatura, não foram encontrados trabalhos realizados para avaliar atividades antimicrobianas do cimento Portland associados à amoxicicilina e ao ciprofloxacino. Assim sendo, parece lícito perguntar se a adição de antibióticos ao cimento Portland pode incrementar a atividade antibacteriana, servindo este como veículo, liberando o antibiótico localmente. Questiona-se ainda se a presa do cimento pode interferir na liberação do antibiótico localmente, bem como qual antibiótico conseguiu melhor liberação no local, agindo mais eficientemente sobre os principais microrganismos encontrados nos casos de complicações endodônticas, em que a cirurgia paraendodôntica se mostra como último recurso para possível solução do problema.
Assim, propôs-se, nesta pesquisa, realizar um trabalho comparativo, em um teste de difusão em ágar, entre o cimento Portland, antes e depois da presa, puro ou em associação com antibiótico, sendo um largamente utilizado em Odontologia (amoxicilina) e outro com pouco uso na área, frente aos principais microrganismos encontrados em dentes tratados endodonticamente, cuja terapêutica apresenta falha.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antimicrobiana do cimento Portland puro ou em associações.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A) Determinar se a adição de agente radiopacificador interfere na atividade antimicrobiana do cimento Portland;
B) Determinar, ainda, se a adição de antibióticos ao cimento Portland promove aumento de sua capacidade antimicrobiana;
C) Observar se o cimento Portland pode ser um carreador de substâncias antimicrobianas, liberando-as no sítio de inserção e se a presa interfere nesta liberação;
D) Observar comparativamente o desempenho da amoxicilina e do ciprofloxacina quando associados ao cimento Portland.
3 ARTIGO: ANÁLISE PELO MÉTODO DA DIFUSÃO RADIAL DA AÇÃO
ANTIMICROBIANA DE UM CIMENTO EXPERIMENTAL À BASE DE SILICATO DE CÁLCIO PURO E ACRESCIDO DE ANTIBIÓTICOS
1
Hernando Valentim da Rocha Junior DDS, MSc
1
Francisco Orlando Giraldi Neto DDS, MSc
2
Bruno Gomes Duarte DDS
1
Eliston Comparim PhD
1
Diogo Rubim DDS, PhD
3
Marco Antonio Húngaro Duarte DDS, PhD
1
Paulo Weckwerth DDS, PhD
1
Universidade Sagrado Coração, Bauru – Brasil
2
Residente em Cirurgia e Traumatologia Buco Maxilo Facial do Hospital Federal de Bonsucesso, Rio de Janeiro – Brasil
3
Universidade de São Paulo, Faculdade de Odontologia de Bauru, Bauru – Brasil
Correspondências para:
Hernando Valentim da Rocha Junior
Rua Arroio Fundo 288, Jacarepaguá, Rio de Janeiro – RJ
CEP 22765-260
Phone number: +55 (21) 73193817 E-mail: hernando.valentim@gmail.com
Resumo
Introdução: A semelhança da composição e das propriedades mecânicas e biológicas, entre o cimento Portland e o MTA são comprovadas, sendo recomendada por alguns autores a substituição do MTA pelo cimento Portland na prática clínica, visando baratear o custo operacional. Os benefícios da adição de um antimicrobiano ao cimento Portland incrementaria as vantagens da sua utilização clínica, desde que houvesse a liberação do antibiótico tanto no momento da colocação bem como após sua presa. Objetivos: Avaliar a atividade antimicrobiana do cimento Portland puro e com óxido de zircônia como agente radiopacificador na proporção de 50% em massa, quando da adição de dois tipos de antibióticos, a amoxicilina e o ciprofloxacino, frente a cinco tipos de microrganismos mais comumente relacionados aos fracassos da terapia endodôntica convencional: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, E. faecalis e C. albicans. Material e métodos: Foram utilizadas 30 placas de Petri preparadas com o meio de cultura ágar Müller-Hinton, sendo escavados seis poços onde foram introduzidos os cimentos imediatamente após a manipulação, ou após presa de 24 h. Assim sendo, o desempenho do cimento Portland como veículo para antimicrobianos foi avaliado comparativamente in vitro. Os resultados foram avaliados pela análise da varia
ância ANOVA e a comparação dos grupos submetidos ao teste Tukey sendo considerado p > 0,05 Resultados: O cimento Portland apresentou atividade antimicrobiana apenas contra C. albicans; a adição do agente radiopacificador pouco interferiu no desempenho geral. O ciprofloxacino foi significantemente superior à amoxacilina em todos os testes. Conclusões: A adição de ciprofloxacino obteve bons resultados sendo eficiente em todas as bactérias estudadas, tanto pré-presa como pós-presa, havendo um desempenho superior ao da amoxicilina. A presa parece não interferir na liberação do ciprofloxacino, mas interfere na liberação de amoxacilina em alguns casos. O cimento Portland não possui atividade antibacteriana e a adição do radiopacificador não altera significativamente o seu desempenho.
Palavras-chave: Portland. Antimicrobianos. Cimentos endodônticos. Teste de difusão em ágar.
Quando a terapia endodôntica convencional falha ou está contra-indicada, a apicetomia, associada à obturação retrógrada, pode ser necessária para o tratamento do elemento dentário20.
Assim sendo, a eliminação de microrganismo no sistema de canais radiculares torna-se um importante objetivo na terapia endodôntica, sendo uma ferramenta importante para tal a colocação de um medicamento intracanal que possa atuar sobre os microrganismos. Consequentemente, o uso de um material de preenchimento do canal com alguma atividade antimicrobiana seria considerado um esforço benéfico na tentativa de controlar o número de microrganismos nos canais radiculares e na erradicação de infecções23.
A utilização de cimento Portland em substituição ao MTA como material de preenchimento de canais radiculares, particularmente quando da realização de obturação retrógrada, vem sendo sugerida por alguns autores, e ganha força à medida que se verifica a composição dos dois materiais ser bastante semelhante, diferindo principalmente na existência do óxido de bismuto na composição do MTA, que é um agente radiopacificador, e também pode ser adicionado ao cimento Portland11,15,17,21,22.
Devido ao fato de o óxido de bismuto poder, quando submetido ao meio ácido, ser dissolvido e sua dissolução pode diminuir a biocompatibilidade do MTA, além de poder deteriorar a estabilidade dimensional do material, a utilização do óxido de zircônia foi sugerido como um bom agente radiopacificador4,5,21.
A idéia de adicionar antibióticos aos cimentos parece ser pragmática em sua origem e faz muito sentido9.
O primeiro relato de utilização de cimentos com antibióticos foi feito por Buchholz e Engelbrecht, em 1970. Esse artifício visa à administração de altas doses de concentração local de antibióticos com baixas repercussões sistêmicas. O sucesso dessa técnica pode depender do antibiótico escolhido, que deve ser guiado pela susceptibilidade dos patógenos envolvidos na região12.
Está provado que a adição de antibióticos aos cimentos é efetivo na prevenção e controle de infecções11. A adição de antibióticos aos cimentos pode resultar em diminuição das propriedades biomecânicas desses cimentos, mas alguns estudos fracassaram na tentativa de provar essa relação. Em geral, a
redução de até 10% da resistência é aceitável, por exemplo, em prótese total de articulação9,12.
Este trabalho procurou estudar a atividade antimicrobiana do cimento Portland puro ou com a adição de um radiopacificador (óxido de zircônia), e ainda avaliar se a adição de antibióticos melhoraria o desempenho antimicrobiano deste cimento, frente aos microorganismos testados, no pré presa e no pós presa.
Material e métodos
Para este experimento, cinco cepas de micoorganismos foram obtidas da coleção de cultura de espécies americanas (ATCC – American Type Culture Collection), sendo elas: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922) e Candida albicans (ATCC 10231).
Foram testados os cimentos Portland (cimento branco Votoram – Grupo Votorantim, Rio de Janeiro, Brasil) com as seguintes composições:
Cimento Portland puro;
Cimento Portland acrescido de 50% de óxido de zircônia;
Cimento Portland Puro acrescido de 10% em peso de amoxicilina; Cimento Portland Puro acrescido de 10% em peso de ciprofloxacino;
Cimento Portland acrescido de 50% de óxido de zircônia e de 10% de amoxicilina;
Cimento Portland acrescido de 50% de óxido de zircônia e de 10% de ciprofloxacino.
Estes mesmos cimentos foram testados após presa de 24 h.
O acréscimo dos antibióticos ao cimento foi na proporção de 10% em massa semelhante ao experimento de Hoelscher et al10. Utilizando uma balança de
precisão Shimadsu, modelo AY220 (Shimadsu de Brasil, São Paulo, Brasil), pesava-se 0,9 g do cimento bapesava-se (Portland puro ou Portland acrescido de óxido de zircônia em 50%); colocava-se em um frasco tipo eppendorf. Adicionava-se, neste mesmo, um frasco contendo 0,1 g do antibiótico escolhido e procedia-se a uma agitação manual.
Um total de 30 placas de Petri foram preparadas com meio de cultura ágar Müller-Hinton, conforme preconizado pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)13. Foram escavados poços de 6 mm de diâmetro nas placas conforme descrito por Ostrosky et al14. Os microrganismos foram semeados conforme as normas da NCCLS na diluição de 1 x 108 UFC/ml13. Esses poços foram preenchidos com uma mistura do cimento manipulados na proporção de 1g/0,26 ml pó-líquido, seguindo o protocolo de Bortoluzzi et al (2009)3. No teste pós-presa, os cimentos foram espatulados conforme descrito anteriormente, acondicionados em placa de Petri estéril, sem meio de cultura e incubados a 37ºC por 24 horas. Após esse período, o cimento é triturado em gral e pistilo, novamente espatulado na mesma proporção (pó/líquido anterior) e inserido nos respectivos poços.
Após o preenchimento dos poços, as placas ficaram em temperatura ambiente por duas horas, e então incubadas, a 37ºC, por 18 horas, como determinado pela NCCLS.
A leitura das placas foi feita observando-se se houve ou não a formação de um halo de inibição. Caso houvesse a formação do halo, este era medido com uma régua sobre uma fonte de luz, conforme determinado pela NCCLS.
Os resultados foram expressos de acordo com a média dos três experimentos por microrganismo e aplicou-se o teste ANOVA, para análise de variância, e teste de Tukey, para comparação grupo a grupo, com nível de significância p>0,05
Resultados
A Tabela 1 mostra as médias dos halos de inibição formados em todas as placas do experimento.
Tabela 1 – Média do tamanho do halo de inibição formado em todas as placas testadas (mm) E.coli P. aeruginosa E.faecalis S. aureus C. albicans Portland Puro 0 0 0 0 0 0 0 0 20 14 Portland Puro+Cipro 48 45 50 48 38 38 53 48 20 15 Portland Puro+Amoxicilina 37 33 0 0 45 0 65 35 20 15 Portland 50% 0 0 0 0 0 0 0 0 20 15 Portland 50% Cipro 45 45 50 48 38 38 53 47 20 15 Portland 50% Amoxicilina 35 28 0 0 44 0 65 17 20 14 Pré-presa Pós-presa Pré-presa Pós-presa Pré-presa Pós-presa Pré-presa Pós-presa Pré-presa Pós-presa
Foram aplicados testes estatísticos na comparação dos cimentos:
Cimento Portland Puro (CP) Cimento Portland 50% (CP50)
Cimento Portland + Ciprofloxacina (CPC) Cimento Portland + Amoxicilina (CPA)
Cimento Portland 50% + Ciprofloxacina (CP50C) Cimento Portland 50% + Amoxicilina (CP50A)
Tabela 2 – Padrão das comparações realizadas Comparação dos cimentos */*
CP/CPC CPC/CPA CPA/CP50C
CP/CPA CPC/CP50 CPA/CP50A
CP/CP50 CPC/CP50C CP50/CP50C
CP/CP50C CPC/CP50A CP50/CP50A
CP/CP50A CPA/CP50 CP50C/CP50A
A Tabela 3 demonstra se houve significância estatística entre os grupos comparados após aplicação do teste Tukey.
Tabela 3 – Resultado de significância estatística
coli1 coli2 aer1 aer2 aur1 aur2 faec1 faec2 alb1 alb2
CP/CPC s s s s s s s s ns ns CP/CPA s s ns ns s s s ns ns ns CP/CP50 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns CP/CP50C s s s s s s s s ns ns CP/CP50A s s ns ns s s s ns ns ns CPC/CPA s s s s s s s s ns ns CPC/CP50 s s s s s s s s ns ns CPC/CP50C s ns ns ns ns ns ns ns ns ns CPC/CP50A s s s s s s s s ns ns CPA/CP50 s s ns ns s s s ns ns ns CPA/CP50C s s s s s s s s ns ns CPA/CP50A s s ns ns ns s ns ns ns ns CP50/CP50C s s s s s s s s ns ns CP50/CP50A s s ns ns s s s ns ns ns CP50C/CP50A s s s s s s s s ns ns
s= significância estatística; ns= não significância estatística. Coli = E. coli; aer = P. aeruginosa; aur = S. aureus; faec = E. faecalis; alb = C. albicans. O número 1, após a sigla do microrganismo, refere-se ao teste pré-presa e, o número 2, ao teste pós-presa.
A tabela 4 demonstra quem obteve um desempenho superior na comparação realizada frente às várias cepas estudadas, baseada na significância estatística.
Tabela 4 – Interpretação do comparativo frente à análise estatística
coli 1 coli 2 aer 1 aer 2 aur 1 aur 2 faec 1 faec 2
CP/CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CP/CPA CPA CPA SEM SEM CPA CPA CPA SEM
CP/CP50 SEM SEM SEM SEM SEM SEM SEM SEM
CP/CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C
CP/CP50A CP50A CP50A SEM SEM CP50A CP50A CP50A SEM
CPC/CPA CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CPC/CP50 CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CPC/CP50C CPC SEM SEM SEM SEM SEM SEM SEM
CPC/CP50A CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC CPC
CPA/CP50 CPA CPA SEM SEM CPA CPA CPA SEM
CPA/CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C
CPA/CP50A CPA CPA SEM SEM SEM CPA SEM SEM
CP50/CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50/CP50A CP50A CP50A SEM SEM CP50A CP50A CP50A SEM CP50C/CP50A CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C CP50C
Inseriu-se a sigla do material que obteve desempenho estatisticamente superior na comparação direta. A sigla SEM foi atribuída quando nenhum material foi superior ao outro, obtendo-se, assim, um comportamento estatisticamente semelhante.
Discussão
Os microrganismos testados são patógenos envolvidos com a infecção endodôntica ou associados a casos resistentes à terapêutica. A despeito dos microrganismos aeróbicos e aeróbicos facultativos serem geralmente os menores constituintes das infecções primárias, eles são encontrados em maior frequência nos casos onde o tratamento é mais demorado, em casos de flare-ups e em casos de fracassos do tratamento. Esses microrganismos podem entrar no sistema de canais radiculares, antes, durante e após o tratamento, causando infecções secundárias. P. aeruginosa e E. faecalis são mais comumente encontrados em casos de fracassos da terapia endodôntica. O S. aureus é encontrado algumas vezes nos canais radiculares e representa um microrganismo padrão em testes antimicrobianos7. E. Faecalis é o microrganismo mais frequentemente encontrado na periodontite periapical refratária, sendo utilizado em numerosos estudos sobre propriedades antibacterianas de
