CN Derp 1 CD3/ CD28 0 5 10 15 ** *** C él u la s C D 4+ T b et + e m a sm át ic o s at ó p ic o s A Derp1 Th17 CN Derp 1 CD3/ CD28 0 5 10 15 C él u la s C D 4+ R O R t em a sm át ic o s at ó p ic o s * Derp1 Treg CN Derp 1 CD3/ CD28 0 5 10 15 20 C él u la s C D 4+ F O X P 3 em a sm át ic o s at ó p ic o s *** * *** C D FOXP3-RORGT CN Derp CD3/ CD28 0 1 2 3 * % o f T c el ls CD 4+ F o xp 3+ RORg t+ E RORGT-GATA3 CN Derp CD3/ CD28 0 1 2 3 * % d e cé lu la s CD 4+ R O R G t+ G A TA 3+ F
Figura 6. Análise das células estimuladas com DerP1 em pacientes asmáticos e controles. Células mononucleares foram purificadas do sangue periférico dos pacientes e cultivadas conforme descritos na legenda da Figura 1. A-D. Gráficos demonstrando a porcentagem Th1, Th2, Th17 e Tregs em pacientes asmáticos atópicos, com células estimuladas com DerP1, anticorpo antiCD3/antiCD28 e sem estímulo algum. E- F. Gráficos apresentando a porcentagem de células duplo-positivas Foxpγ/ROR t e ROR t/GATAγ respectivamente, sem estímulo e com células estimuladas com anticorpo antiCD3/antiCD28 e estimuladas com DerP1. Derp1 Th2 CN Derp 1 CD3/ CD28 0 2 4 6 8 C él u la s C D 4+ G A T A 3 em a sm át ic o s at ó p ic o s B
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70DISCUSSÃO
Este é o primeiro estudo que avalia células T helper circulantes de pacientes asmáticos subdividos entre atópicos e não-atópicos. A análise foi realizada através de citometria de fluxo, para identificar a expressão de seus fatores de transcrição: Tbet, GATAγ, ROR T e FOXPγ ou aquelas células que co-expressavam dois desses fatores de transcrição, e avaliou as citocinas mais prevalentes secretadas por células estimuladas com anti-CD3/CD28 pelo método de CBA. Sabemos que as células T desempenham diversos fatores na asma e exercem um papel fundamental na patogenia da mesma. Além disso, segundo Lloyd, a plasticidade das células T pode ser definida por um simples fator de transcrição, podendo ocorrer durante o estágio da doença depois da estimulação alérgica ou depois da exacerbação, sendo que o risco dessas crianças desenvolverem ou não hiperreatividade alérgica depende diretamente da diferenciação e função das sub-populações de células T (23, 24).
No presente estudo mostramos que apenas a expressão de GATA3 ou múltipla expressão deste fator de transcrição foram os que apresentaram diferenças significativas entre pacientes asmáticos e controles. Também apresentando maior expressão em pacientes asmáticos atópicos em relação não tópicos independente do estimulo empregado. Confirmando que asmáticos atópicos têm um perfil Th2. Um estudo realizado no ano de 2012 confirmou o presente estudo, pois eles apresentaram a super-expressão tanto do fator de transcrição GATA3 em células T, a qual é uma marca da resposta Th2 em pacientes asmáticos atópicos, assim como a expressão de citocina IL-4. E este aumento de células Th2 pode causar desequilíbrio nas Th1/Th2 e nos pacientes controles (7).
Ao analisar a expressão de células Th1, observamos que em pacientes controles atópicos e não atópicos a expressão dessas células se manteve no estado basal tanto em células estimuladas quanto a células não-estimuladas. Porém quando analisamos este processo em pacientes asmáticos, constatamos que o estímulo anti-CD3/CD28, tende a aumentar a expressão de células Th1, tanto em asmáticos atópicos como em asmáticos não-atópicos. Já Malmhäll et al, não encontrou diferença significativa entre os níveis de células Th1 de pacientes
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71asmáticos e controles (7). O estudo de Pereira relatou apenas que células Th1, está associada a asma não tópica e com controles, o que foi diferente em nosso estudo, pois o aumento da expressão de Tbet ocorreu em asmáticos após o estímulo (15). Se tratando de expressão de fator Tbet e severidade da doença, as células Th1 foram mais evidentes em pacientes com severidade leve. Este episódio pode ser devido ao desequilíbrio Th1/Th2 relatado anteriormente. Além disso, isto pode estar relacionado com o estimulo empregado, pois quando estimulamos as células de pacientes asmaticos com a proteína Derp1 encontramos uma diminuição da expressão de Tbet comparado ao controle. Sugerindo que o estimulo do anti- CD3/CD28 direciona as células dos pacientes para um perfil Th1.
Analisando as células Th17 observamos que não ocorreu diferença entre os pacientes asmáticos e controles. Também não encontramos diferenças quando analisamos pacientes asmáticos atópicos e não-atópicos em relação a freqüência destas células. Este resultado contradiz o estudo de Wei et al, onde a expressão de células Th17 estava aumentada em pacientes asmáticos comparadas com os controles. Neste mesmo estudo foi analisada a IL-17 no plasma, assim como no fluido bronco-alveolar de pacientes asmáticos e controles, e foi constatado que a concentração de IL17 foi maior nos pacientes com asma. Estes dados corroboram com o presente estudo em que a concentração de IL-17 foi maior em pacientes asmáticos quando comparados com controles (25).
Recentemente em estudos com modelos murinos, foi mostrado que as células Tregs suprimem as células Th17 que medeiam à inflamação pulmonar, regulado assim a inflamação neutrofílica. No nosso estudo, observamos que a expressão do fator de transcrição FOXP3+ foi expressiva em pacientes asmáticos atópicos após a estimulação. Porém quando observamos a expressão de células Tregs entre pacientes asmáticos atópicos e não-atópicos, verificamos que as células dos asmáticos atópicos têm um nível de expressividade de FOXP3+ maior que as células dos não atópicos quando estimuladas. Corroborando com o estudo de Palomares et al, que apresentou dados semelhantes aos nossos, podemos sugerir que a baixa expressão de células Th17 tanto em pacientes asmáticos como em controles, pode ser explicada pelo fato da função supressora que as células Tregs exerce sobre as células Th17, resultando em seu baixo nível de expressão (26).
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72A fim de analisar a plasticidade das células T no presente estudo verificamos a presença de células duplo-positivas nos pacientes asmáticos e controles. Analisamos a expressão de células duplo-positivas Tbet+ROR T+, e verificamos que a expressividade da dupla-positividade destas células em pacientes asmáticos apresentou um aumento significativo após o estímulo com anti-CD3/CD28. Estudos realizados, relatando a expressão transcricionais de células Tbet e Th17 em encefalomielites autoimune, relataram que células Th17 inflamatórias podem expressar ROR t juntamente com T-bet ou GATA3. Sendo constatado que nestes estudos exprimentaisT-bet+ROR T+ são altamente patogênicas, onde T-bet está associada com a patogenicidade, mesmo quando não há INF , o que pode ser observado em nosso estudo, já que a expressão duplo-positiva destas células foram significativas apenas em pacientes asmáticos (27, 28).
Sabe-se que células FOXP3+ podem expressar fatores de transcrição como T-bet, GATAγ e ROR T (29), o que foi constatado no presente estudo. Porém, quando analisamos as possíveis diferenças de expressividade entre pacientes asmáticos e controles co-expressando FOXPγ+ ROR T+, podemos observar que não ocorreu diferença significativa entre eles, tanto com células estimuladas como em não estimuladas, o que não foi concordante com o estudo de Malmhäll, em que a co-expressão destas células foram somente aumentadas em pacientes asmáticos (7).
Para confirmar então a hipótese que o fator de transcrição FOXP3+ co- expressar outros fatores de transcrições, analisamos também FOXP3+T-bet+. Em nosso estudo, esta co-expressividade foi aumentada em pacientes asmáticos atópicos e não-atópicos quando as células destes eram estimuladas com anti- CD3/CD28, diferentemente do estudo de Malmhäll em que este dado não foi aumentado em nenhum dos grupos de pacientes asmáticos analisados. Além disso, nossos resultados foram diferentes de estudos em animais que mostraram que a expressão de T-bet nas células Tregs depois da infecção, facilitou que estas células suprissem células Th1 inflamatórias (29, 30). Porém, se comparando outros estudos, nossos resultados reforçaram o fato, de que as células podem perder a expressão FOXP3 e adquirir a capacidade de produzir citocinas pró-inflamatórias (31, 32).
Pelo fato, do não requerimento de células Treg para a homeostase basal e funcional, a expressão de GATA3 em células Treg é crucial durante a resposta
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73inflamatória, onde é mantida a expressão de FOXP3 e limita a conversão de células Treg para um fenótipo de células T efetoras (33). Pensando nisto, analisamos a expressão duplo-positiva de fatores de transcrição FOXP3+GATA3+, a qual apresentou uma expressão superior em células de pacientes asmáticos atópicos quando estimuladas, além disso, em pacientes controles esta expressão foi quase nula. Este ocorrido é analisado em outro estudo, que mostram que a expressão de GATA3+ em células Tregs é proposta por ser uma falta na resposta da estimulação do TCR sob condições neutras, enquanto que em condições inflamatórias, a expressão de GATA3+ em Tregs limita a expressão de fatores de transcrição associado com diferenciação de células T(34).
A plasticidade dos fenótipos de células T é ditada por influências ambientais, sendo que no contexto de doenças alérgicas a exposição a alérgicos/atopia, a genética, idade, histórico de infecções, poluição ou dieta pode afetar a natureza dos fenótipos de células T helper que desenvolve após a exposição à alérgenos(24). A partir disto, também foi analisado a dupla-expressão de fatores de transcrição ROR t+GATAγ+, pois os dois subtipos celulares promovem o recrutamento da maioria de infiltrados inflamatórios ambos neutrofílicos e eosinofílicos, juntamente a patologia pulmonar (35). Foi apresentado no presente estudo que a expressão dupla destes fatores de transcrição foi superior em pacientes asmáticos atópicos em relação aos demais grupos, bem como entre suas células quando estimuladas com anti-CD3/CD28.
Pensando na primeira hipótese das funções de células T que seria entre células Th1/Th2, a qual é um dos principais exemplos de co-expressão de fatores de transcrição, em que células GATA3+ podem se reprogramar-se para expressar T-bet e INF- , em locais de infecções virais, resolvemos analisar esses achados em nosso estudo (36). Analisamos que a expressão de duplo-positiva destes dois fatores de transcrições foi altamente expressiva em pacientes asmáticos atópicos quando comparados com não atópico, assim como o estudo de Manhäll et al. Outro estudo que analisou especificamente a reprogramação de células Th2 e Th1, em animais infectados com vírus linfocítico coriomeningitis, demonstrou que após 9 dias de infecção com LCVM, a expressão de IFN- reduziu pela metade, possivelmente pelo efeito inibidor de GATAγ+, pois a expressão de GATAγ+ na presença de IFN em células Th2 foi alta, assim como na ausência do mesmo fator de transcrição (36).
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74Este é o primeiro estudo que avaliou células duplo-positivas em relação a severidade da asma. Foi demonstrado recentemente que existe uma maior expressão das células Tbet+GATA3+ em pacientes com asma com eosinofilia e uma diminuição das células T GATA+ROR T+FOXPγ+ (7). Foi demonstrado por Wang et al em camundongos que células Th2 de memória que produzem IL-17 promovem a exacerbação da asma, além disso, estas células Th2 produtoras de IL-17 estão presentes em maior frequência em asmáticos atópicos que controles (35). Nosso estudo demonstrou que pacientes asmáticos moderados apresentam maior frequência de células duplo-positivas ROR t/GATAγ em células não estimuladas, e ocorre um maior aumento destas células quando estimuladas com Derp1, sugerindo um maior envolvimento destas células com a severidade e corroborando de certo modo com o estudo de Wang.
Sabe-se que inalação de HDM causa o recrutamento de eosinófilos para os pulmões (37). A estimulação de células com a proteína DerP1, mostrou que quando estimulada com este alérgeno, o perfil das células Th1 estimuladas mudam, passando a não expressar níveis altos de T-bet. Esta característica de supressão da expressão de células Th1 quando estimulada com este alérgeno, torna uma característica de alta expressão do fator de transcrição T-bet apenas quando estas células são estimuladas com anti-CD3/CD28, e não com um alérgeno específico de atopia. O grupo contendo apenas fator de transcrição GATA3, quando estimulado com Derp1 não alterou seu perfil e nem mudou suas características basais entre células estimuladas ou não estimuladas. Porém, quando analisadas as células co- expressando outro fator de transcrição tal como ROR T+GATA+, o perfil destas células apresenta uma expressão superior quando estimuladas com Derp1 se comparando com células não estimuladas, ou estimuladas com anti-CD3/CD28, assim como quando analisado os fatores de transcrição FOXPγ+ROR T. Nossos dados sugerem que dependendo do estímulo que as células recebem a modulação do perfil de células T CD4 pode ser alterado inclusive das células duplo-positivas. Mais estudos são necessários para entender todos os mecanismos e as rotas celulares envolvidas nesse processo de modulação do fenótipo das células T CD4 na asma e a real função das células duplo-positivas na severidade da doença. Entendendo melhor os mecanismos envolvidos podem ser desenvolvidos novos medicamentos tendo como alvo a modulação dos fenótipos das células T CD4.
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