As intera¸ c˜ oes com o hormˆ onio

Al´em de mudan¸cas nas propriedades estruturais e dinˆamicas do LBD, o resultado das simula¸c˜oes permitem verificar se ocorrem altera¸c˜oes na intera¸c˜ao do s´ıtio de liga¸c˜ao com o T3. Um aspecto importante j´a discutido anteriormente ´e que a h´elice H12 muda sua posi¸c˜ao nas simula¸c˜oes com mutantes I280R e I280K, enquanto no I280M a posi¸c˜ao da H12 permanece praticamente inalterada. Tamb´em foi obser- vado pequenas altera¸c˜oes no n´_{umero de contatos e na mobilidade do grampo-β.} Como a H12 faz importantes contatos hidrof´obicos com o T3 (atrav´es de duas fe- nilalaninas, P455 e P459) enquanto o grampo-β faz intera¸c˜oes hidrof´ılicas (atrav´es T329 e N331), uma suposi¸c˜ao razo´avel ´e a de que ocorram altera¸c˜oes nestas in- tera¸c˜oes.

Figura 3.11. Evolu¸c˜ao temporal das seguintes propriedades, de cima para baixo: Distˆancia entre os centros de massa da h´elice H12 e do T3; Distˆancia entre os centros de massa do grampoβ (gp-β) e do T3; Energia de intera¸c˜ao entre LBD e o T3; Energia de intera¸c˜ao entre a solu¸c˜ao aquosa e o T3.

A Figura 3.11 nos permite verificar esta hip´otese, onde s˜ao mostradas a evolu¸c˜ao temporal nos ´ultimos 2 ns da distˆ_{ancia entre H12 e grampo-β do T3, al´em da}

64 Cap´ıtulo 3. As Bases Moleculares dos Desvios Funcionais de 5 Mutantes varia¸c˜ao das energias de intera¸c˜ao do T3 com o sistema (composto pelo LBD do TRβ e pela solu¸c˜ao aquosa). Verifica-se que a distˆancia H12-T3 nos mutantes pouco muda quando comparada `a estrutura nativa. O ´unico mutante onde esta distˆancia aparece ligeiramente diferente ´e o I280K, estando a H12 do mutante mais pr´oxima do ligante (de 0,5 a 1,0 ˚A em m´edia). J´a quando observa-se a distˆancia grampo-β-T3 verifica-se que em todos os mutantes o T3 est´a mais distante desta regi˜ao (de 1.1 a 1.3 ˚A em m´edia), sem exce¸c˜oes.

Estas observa¸c˜oes indicam que o T3 mant´em quase o mesmo contato com a H12, mesmo com ela mais distorcida nos mutantes I280K e I280R, mas acaba perdendo intera¸c˜_{oes com o grampo-β. Olhando agora as energia de intera¸c˜ao na} Figura 3.11, verifica-se que as intera¸c˜oes LBD-T3 ficam menos estabilizadas nos mutantes I280K e I280R (i.e., mais positivas) enquanto a intera¸c˜ao com mol´eculas de ´agua, agora nos trˆes mutantes, ´e muito mais favor´avel (i.e., mais negativa).

Figura 3.12. Representa¸c˜ao do s´ıtio de liga¸c˜ao na estrutura cristalogr´afica e nas quatro simula¸c˜_{oes realizadas (TRβ-LBD nativo e os trˆes mutantes, no tempo} 1,8 ns. Para facilitar a compara¸c˜ao com os mutantes s˜ao mantidas as estruturas da H12 e do T3 obtidas na simula¸c˜_{ao do TRβ-LBD nativo (cinza transl´}ucido). N˜ao s˜ao mostrados os ´atomos de hidrogˆenio das estruturas moleculares, com exce¸c˜ao das mol´eculas de ´agua.

O que estaria acontecendo no s´ıtio de liga¸c˜ao que poderia explicar estes efeitos? A Figura 3.12, mostra uma representa¸c˜ao do s´ıtio de liga¸c˜ao, no tempo de 1,8 ns. Verifica-se que a estrutura retirada das simula¸c˜_{oes do TRβ nativo e do I280M s˜ao}

bem semelhantes na regi˜ao da H12, inclusive em rela¸c˜ao `a estrutura cristalogr´afica experimental. Entretanto, na outra extremidade do ligante, aparece uma diferen¸ca evidente na muta¸c˜ao I280M: um maior n´umero de mol´eculas de ´agua. Nos mutantes I280R e I280K s˜ao observadas mudan¸cas maiores ainda. Al´em da entrada de ´agua, ´

e poss´ıvel observar o deslocamento da H12 e do pr´oprio ligante, na mesma dire¸c˜ao. Isto explica porque a distˆancia H12-T3 n˜ao varia muito quando comparamos as simula¸c˜oes da estrutura nativa e dos mutantes, chegando at´e diminuir em I280K. O ligante acompanha o deslocamento da H12, mantendo os contatos hidrof´obicos, mas ao mesmo tempo em que perde intera¸c˜oes hidrof´ılicas na regi˜_{ao do grampo-β,} o que permite a entrada de ´agua.

Para verificar a extens˜ao da entrada de ´agua ao longo dos ´ultimos 2 ns da simula¸c˜ao, foi computado o n´umero de mol´eculas de ´agua pr´oximas do T3, como mostra a Figura 3.13. Nesta Figura tamb´em ´e mostrado n´umero de mol´eculas de ´

agua pr´oximas de partes hidrof´obicas do T3.

Figura 3.13. Evolu¸c˜ao temporal do n´umero de mol´eculas de ´agua pr´oximo do T3 (NT 3−solv) e apenas pr´oximo de regi˜oes hidrof´obicas do T3 (Nhidrof−solv), que

envolve os dois an´eis arom´aticos. Uma mol´ecula de ´agua foi considerada pr´oxima quando qualquer de seus ´atomos localiza-se a menos de 4 ˚A da regi˜ao de interesse. Verifica-se que no LBD nativo existem em torno de trˆes mol´eculas de ´agua pr´oximas ao T3 durante toda simula¸c˜ao, enquanto praticamente nenhuma mol´ecula de ´agua aproxima-se de regi˜oes hidrof´obicas. Nos mutantes a hidrata¸c˜ao do T3 se altera. I280K e I280R mostram de 4 a 7 de mol´eculas de ´agua pr´oximas ao T3, incluindo de 1 a 3 mol´eculas pr´oximas a regi˜oes hidrof´obicas. J´a o mutante I280M

66 Cap´ıtulo 3. As Bases Moleculares dos Desvios Funcionais de 5 Mutantes mostra um n´umero de mol´eculas de ´agua ao redor de T3 semelhante ao LBD nativo, por´em com uma mol´ecula de ´agua pr´oxima a regi˜oes hidrof´obicas.

As altera¸c˜oes na intera¸c˜ao do T3 com o s´ıtio de liga¸c˜ao observadas at´e aqui s˜ao resumidas na Tabela 3.2, que mostra as m´edias das energia de intera¸c˜ao LBD-T3 e Solu¸c˜ao-T3, al´em do n´umero de mol´eculas de ´agua pr´oximas do T3 e regi˜oes hidrof´obicas. Tamb´em s˜ao mostrados os valores de afinidade experimental obtidos por Barra (j´a mostrados na Tabela 3.1) para compara¸c˜ao das tendˆencias.

Tabela 3.2. Efeito das muta¸c˜oes I280 no s´ıtio de liga¸c˜ao.

Energia Energia N´umero de mol´eculas de ´agua

Sistema LBD-T3 Solu¸c˜ao-T3 Pr´oximas Pr´oximas de partes Afinidade (kcal.mol−1) (kcal.mol−1) do T3 hidrof´obicas do T3

Nativo -133,00 ± 5,88 -8,11± 4,34 3 a 4 0 a 1 100%

I280M -132,03 ± 5,78 -28,52 ± 3,70 3 a 4 1 a 2 29%

I280K -126,63 ± 6,27 -32,10 ± 5,85 4 a 6 1 a 3 <1%

I280M -116,37 ± 7,64 -34,15 ± 7,57 4 a 7 2 a 3 <1%

A compara¸c˜ao dos resultados experimentais e das simula¸c˜oes da Tabela 3.1 sugere que a redu¸c˜ao da afinidade est´a relacionada `a perda de intera¸c˜ao com o LBD e com o aumento da hidrata¸c˜ao do ligante (e consequentemente do s´ıtio de liga¸c˜ao). A an´alise de hidrata¸c˜ao de partes hidrof´obicas do T3 (an´eis arom´aticos e iodos) mostra que ocorre aumento da hidrata¸c˜ao nesta regi˜oes. Este tamb´em deve ser um fator importante para perda de afinidade. No caso das muta¸c˜oes I280R e I280K, esse resultado parece claramente correlacionado ao deslocamento do ligante na dire¸c˜ao da H12. J´a com o mutante I280M, os efeitos parecem bem mais tˆenues. Para a compreens˜ao detalhada de todas as altera¸c˜oes nas intera¸c˜oes do s´ıtio de liga¸c˜ao, foram calculadas as energias m´edias de intera¸c˜ao de cada res´ıduo desta regi˜ao do LBD com o T3. A Figura 3.14 mostra uma representa¸c˜ao esquem´atica do resultado desta an´alise, sendo mostrados os res´ıduos e energia m´edia de intera¸c˜ao de onde se verificou diferen¸cas entre a estrutura nativa e os mutantes. S˜ao destacadas ainda as mudan¸cas estruturais e de hidrata¸c˜ao observadas no s´ıtio de liga¸c˜ao.

Figura 3.14. Representa¸c˜ao esquem´atica do s´ıtio de liga¸c˜ao, dando des- taque para os res´ıduos onde a intera¸c˜ao mais se altera com a muta¸c˜ao (em ver- melho). Os tra¸cos pontilhados representam intera¸c˜oes entre s´ıtios carregados e liga¸c˜oes de hidrogˆenio enquanto a linha ondulada representa intera¸c˜oes entre s´ıtios hidrof´obicos. Os valores aos lados das intera¸c˜oes correspondem a energia m´edia de intera¸c˜ao res´ıduo- T3, em kcal.mol−1.

Verifica-se que os principais res´ıduos respons´aveis pela perda de intera¸c˜ao LBD- T3 nos mutantes s˜ao os res´ıduos T329, L330, al´em do R282 no caso espec´ıfico dos mutantes I280R e I280K. Todas estas intera¸c˜oes s˜ao substitu´ıdas por intera¸c˜oes com mol´eculas de ´agua, ocorrendo de maneira distinta. No res´ıduo T329 a in- tera¸c˜ao da carbonila do seu backbone com o NH3+ do T3 ´e substitu´ıda por, em m´edia, uma mol´ecula de ´agua. J´a o N331 muda seu modo de liga¸c˜ao, trocando a intera¸c˜ao do NH3+ com a carbonila do backbone pela intera¸c˜ao com o carboxilato

68 Cap´ıtulo 3. As Bases Moleculares dos Desvios Funcionais de 5 Mutantes da cadeia lateral. Al´em disso, uma uma nova intera¸c˜ao do NH3+ _{com ´agua se}

forma, substituindo em parte a intera¸c˜ao intramolecular entre NH3+ _{e carboxilato}

do T3. No caso dos mutantes I280K e I280R tamb´em ocorrem os mesmos efeitos de aumento da hidrata¸c˜ao observados no mutante I280M, mas de forma mais acen- tuada. Em I280K e I280R, intera¸c˜oes entre T3 e ´agua substituem inclusive parte da forte ponte salina entre R282 e o carboxilato do T3.

Todas as intera¸c˜oes substitu´ıdas descritas at´e aqui s˜ao hidrof´ılicas, sendo a troca por intera¸c˜oes com mol´eculas de ´agua praticamente equivalente. Mais importante do que estas substitui¸c˜oes, no entanto, podem ser as mudan¸cas nos contatos hi- drof´obicos. Dentre as observadas, destaca-se a perda dos contatos hidrof´obicos do res´ıduo L330 devido a entrada de ´agua, como destacado nos trˆes mutantes. Verifica-se que os mutantes I280R a I280K chegam a ter em torno de 3 mol´eculas de ´agua de pr´oximas ao anel, enquanto I280M apresenta em m´edia uma mol´ecula de ´agua nessa posi¸c˜ao. Estas mol´eculas n˜ao est˜ao isoladas, e fazem contato com a solu¸c˜ao.

A perda de intera¸c˜oes hidrof´ılicas e de contatos hidrof´obicos entre ligante e o TR podem implicar ∆G mais positivo entre formas holo e apo, o que explicaria a menor afinidade dos mutantes. Uma discuss˜ao de como estes resultados se traduzem do ponto de vista termodinˆamico ´e feita no Cap´ıtulo 4, junto de outros resultados.