Pesquisas demonstraram que o aumento de grupos sulfonatos na meso- tetrafenilporfirina, eleva a anfifilicidade da molécula e diminui o grau de agregação do fotossensibilizador, afetando as propriedades fotofísicas da substância como o rendimento quântico do estado triplete 7. Entretanto, estudos in vitro 59 e in vivo 60 têm demonstrado que as meso-tetrafenilporfirinas sulfonadas são neurotóxicas, pois provocam a morte de neurônios, inibem o crescimento de neuritos (prolongação dos neurônios) e diminuem a velocidade de condução dos impulsos nervosos. Nestas pesquisas também foram avaliadas as toxidades de outros fotossensibilizadores e os resultados são mostrados na tabela 2. Não há informações na literatura sobre a toxidade do InTPP ou da meso-tetrafenilporfirina não sulfonada.
Tabela 2 – Concentração de fotossensibilizador necessária para inibir 50% do crescimento do neurito. Porfirina Concentração ALA > 1,5 mM Uroporfirina I 100 µM Coproporfirina I 100-500 µM Protoporfirina IX 50 nM Meso-tetrafenilporfirina sulfonada 6 µM Derivado de Hematoporfirina 50-100 µM
Os derivados das tetrafenilporfirinas são compostos de grande interesse na PDT, devido à alta eficiência na geração de oxigênio singlete, cuja propriedade depende da natureza do íon metálico central e do caráter dos substituintes periféricos. Por exemplo, o GaTPP (meso-tetrafenilporfirina de Ga), apresentado na figura 6, é caracterizado pela alta solubilidade em solvente orgânico e apreciável estabilidade fotoquímica. Experimentos mostraram que o GaTPP, devido ao “efeito do átomo pesado”, apresenta rendimentos quânticos de geração de oxigênio singlete relativamente altos, constituindo-se em um fotossensibilizador em potencial para tratamento de câncer através da PDT 24,61,62.
Estudos realizados por Cañete et. al.63 demonstraram que a meso-tetrafenilporfirina (TPP) incorporada em sistemas vesiculares (lipossoma) apresenta eficiência fotodinâmica para uso em PDT, em razão dos resultados obtidos quando culturas de células cancerígenas (Hela) foram irradiadas na presença de TPP (5 a 100 µM).
Cl N N N N Ga
A meso-tetrafenilporfirina de índio é uma substância que já foi estudada para ser
utilizada como um radiomarcador64,65. Os radiomarcadores são compostos que têm várias
aplicações clínicas, como a identificação de plaquetas, eritrócitos e leucócitos presentes em
órgãos normais ou doentes64. Isto permiti a detecção de lesões inflamatórias bem como de
coágulos sanguíneos intravasculares por imagens64,65. Estudos in vitro64,65 demonstraram que o InTPP foi eficiente em identificar as plaquetas e leucócitos sem causar alterações na fisiologia celular. Na presença de eritrócitos o InTPP tende a se deslocar das plaquetas para as hemácias, não sendo um bom radiomarcador de plaquetas nestas condições. Estudos in
vivo65 demonstraram que o InTPP mostrou uma excelente visualização da medula óssea em
pacientes com anemia hemolítica. Em razão do InTPP ser bem mais barato do que o
Photofrin® (250 mg de InTPP custam U$ 105 enquanto e 75 mg de Photofrin® custam U$
2.200) e em razão do InTPP apresentar estrutura semelhante ao GaTPP, torna-se interessante em termos de custo e propriedades fotofísicas/fotoquímicas o seu estudo para aplicação em terapia fotodinâmica.
2. OBJETIVOS
Este trabalho tem os seguintes objetivos: a) investigar, in vitro, a habilidade do meso-tetrafenilporfirina de índio (InTPP), para atuar como potencial fotossensibilizador na PDT; b) investigar qual o mecanismo (tipo I ou II) está envolvido na fotoxidação de biomoléculas.
3. JUSTIFICATIVA
A meso-tetrafenilporfirina de gálio (GaTPP) é um fotossensibilizador que apresenta alta eficiência na geração de oxigênio singlete, sendo uma substância fotoativa de 25 a 30 vezes mais potente que a hematoporfirina em ensaios biológicos, in vivo, para tratamento de células cancerígenas 66,67. A meso-tetrafenilporfirina de índio é uma substância que tem a mesma estrutura química do GaTPP e ambos os átomos centrais pertencem ao mesmo grupo da tabela periódica, sendo que vários artigos relatam o potencial das meso- tetrafenilporfirinas em PDT 24,62,66,67. Dessa forma, será investigado, in vitro, a habilidade do InTPP em atuar como novo potencial sensibilizador para a PDT.
Conforme algumas publicações 3,68,69, o oxigênio singlete produzido no mecanismo tipo II, tem maior difusibilidade do que os radicais produzidos pelo mecanismo do tipo I, e a velocidade das reações de transferência de energia (mecanismo tipo II), entre o oxigênio e o fotossensibilizador no estado triplete, é maior quando comparada às reações de
transferência de elétrons (mecanismo tipo I)18. Mediante estas informações, torna-se
necessário a investigação do mecanismo (I e II) envolvido na fotoxidação da biomolécula pelo fotossensibilizador, já que o oxigênio singlete é um agente citotóxico mais eficiente que os radicais gerados no mecanismo do tipo I.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Reagentes e Equipamentos
O cloreto de meso-tetrafenilporfirina de índio foi adquirido da Porphyrin Products
Inc., com grau de pureza maior que 95% e o Photofrin foi cedido pela Axcan Pharma
Ltda, com grau farmacéutico. A dimetilformamida (DMF) foi obtida da VETEC Química
Fina Ltda, o polioxietileno-sorbitan monolaurato (Tween20) e o triptofano foram
adquiridos da Sigma, a albumina bovina foi obtida da Quimibrás Ind. Químicas Ltda., a
água deuterada foi obtida da Aldrich enquanto que a azida de sódio, o fosfato
monobásico e dibásico de potâssio, o cloreto de sódio e o cloreto de potâssio, foram
obtidos da Merck®. O sangue utilizado nos ensaios de hemólise de eritrócitos, foi cedido
pelo Hemocentro do Hospital das Clínicas da UNICAMP.
Foram utilizados os espectrofluorímetros PTI LS-100TM – Luminescence System
LS-100TM e ISS PC1TM – Photon Counting; o espectrofotômetro Hewlett Packard 8453A
– Diode Array; uma lâmpada de mercúrio HPLN 80W (Phillips) contendo filtro para bloqueio das emissões abaixo de 400 nm e acima de 600 nm; as centrífugas NT-811 (Nova Técnica) e Revan 14000D (Revan Instrumentos Científicos); a balança analítica Mettler AE200 e a microbalança Perkin Elmer AD-6 Autobalance.
4.2 Determinação do comprimento de onda de excitação e de emissão.
O comprimento de onda de excitação de cada fotossensibilizador (InTPP e
Photofrin) em uma solução de tampão fosfato (PBS) pH 7.2 contendo 1% (v:v) de
comprimentos de onda de emissão dos fotossensibilizadores foram obtidos no espectrofluorímetro através da excitação da molécula no comprimento de onda onde a mesma apresentou maior absorbância.
4.3 Estudo do estado de agregação do fotossensibilizador
4.3.1 Influência da concentração de Tween20 e % de fase aquosa no estado de
agregação do InTPP
A fim de se minimizar a agregação do fotossensibilizador, otimizou-se a concentração de surfactante presente em PBS pH 7.2 e 5% de DMF, fixando-se a
concentração de InTPP (15,3 mg.L-1) e variando-se a porcentagem de Tween20 em PBS
(0 a 1% (v:v)). A concentração do surfactante foi mantida bem acima da CMC de valor
0,04 mM 70 para que o fotossensibilizador pudesse ser totalmente incorporado pelas
micelas. A excitação do InTPP foi feita no comprimento de onda 427 nm e a emissão foi verificada em 613 nm para cada concentração pesquisada de surfactante (vide figura 10, p.41). Foi utilizada fenda de excitação e de emissão de 4 nm e uma cubeta de quartzo triangular de dimensão 1,4x1,0x1,0 cm.
O InTPP é um composto extremamente hidrofóbico, sendo necessária a utilização de solvente orgânico (DMF) para solubilização do mesmo. Portanto, foi averiguada a influência da porcentagem de fase aquosa sobre o processo de agregação do InTPP, para que a menor porcentagem possível de solvente orgânico fosse utilizada, através da medida
da fluorescência do InTPP, mantendo-se sua concentração (15,3 mg.L-1) e a de Tween20
(1% v:v) fixas, diminuindo-se a porcentagem de DMF e aumentado-se a porcentagem de tampão PBS pH 7.2 (0 a 95%). Houve formação de emulsão quando foram utilizadas concentrações abaixo de 40% de fase aquosa, impossibilitando as medidas de fluorescência nesta faixa de concentração. Portanto, os resultados obtidos (vide p. 41) compreendem os experimentos realizados com 0% de fase aquosa e com concentrações acima de 40% de fase aquosa.