Analise das propriedades fotossensibilizantes do In(III)-mesotetrafenilporfirina para uso em terapia fotodinamica

Texto

(1)Universidade Estadual de Campinas Instituto de Química. Dissertação de Mestrado. Análise das Propriedades Fotossensibilizantes do In(III)-mesotetrafenilporfirina para uso em Terapia Fotodinâmica. 14/02/2003. Aluno: André Romero da Silva Orientador: Prof. Dr. Renato Atílio Jorge i.

(2) Aos meus pais, Roseli e Miguel, e irmãos, Alessandra e Adriano, pelo apoio e incentivo que sempre me concederam, desde a época de graduação.. À minha esposa, pelo carinho, compreensão e incentivo durante a realização deste trabalho.. iv.

(3) A coisa mais bela que o homem pode experimentar é o mistério. É essa emoção fundamental que está na raiz de toda ciência e toda arte. (Albert Einstein). v.

(4) Agradecimentos Gostaria de agradecer imensamente: ao Prof. Dr. Renato Atilio Jorge pela orientação que me foi concedida e pela oportunidade de poder trabalhar com ciência. a Profa. Dra. Tereza Dib Zambon Atvars pela forma atenciosa com que me auxiliou na resolução de problemas relacionados a fotoquímica e fotofísica. ao Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda pelo empréstimo do banho de ultrassom e da centrífuga utilizados neste trabalho. a Profa. Dra. Inés Joekes, pelos inúmeros conselhos e incentivos que me deste para trabalhar com ciência. a srta. Aline Cristina Prezedel, funcionária do Hemocentro do Hospital das Clínicas da Unicamp, pelas inúmeras doações de sangue que foram concedidas para a realização dos ensaios de hemólise. a srta. Dayanne Santos da United Medical Ltda, pela doação do fármaco Photofrin®. aos meus amigos do laboratório, Joselito, Adriana, Araceli, Clésia, César, Edenir, Fabíola, Geraldo, Guida, Kennedy, Lilian, Luciana, Madson, Mariana, Marcel e Thais, pelo carinho e respeito com que me trataram no laboratório. aos meus amigos do laboratório da Profa. Tereza, Marcelo, Neife, Rafael, Sahori e Tatiana, pela atenção e respeito com que me trataram durante as inúmeras análises espectrofluorimétricas que foram realizadas durante este trabalho. aos funcionários da secretária da pós-graduação, André, Bel, Celi e Rodrigo, pela competência, responsabilidade e profissionalismo com que tratam todos os pós-graduandos. as técnicas Cláudia, Débora, Elisabeth e Egli, pela amizade e o carinho com que me trataram durante o desenvolvimento deste trabalho. a sr. Fontana da vidraria, pelo profissionalismo e carinho com que me tratou durante todo o mestrado. a Fapesp e ao CnPq pelo apoio financeiro.. vi.

(5) Curriculum Vitae Formação Acadêmica. • •. Bacharel em Química com Atribuições Tecnológicas. Universidade Estadual de Campinas – Instituto de Química (março/2001) Técnico em Administração. E.E.I.P.S.G.E.S. Fundação Bradesco (dezembro/1991). Experiência Científica. •. Mestrado desenvolvido no Instituto de Química-Unicamp, na área de concentração físico-química, sob orientação do Prof. Dr. Renato Atílio Jorge, sendo a tese intitulada: Análise das propriedades fotossensibilizantes do In(III)-mesotetrafenilporfirina para uso em terapia fotodinâmica. (agosto/2001 a fevereiro/2003). Experiência Profissional. •. Banco ABN AMRO Real S/A, trabalho executado na área de atendimento a clientes e na área de processamento de dados. (janeiro/1990 a agosto/2001). Núcleo de Preparação de Oficiais da Reserva, 28o Batalhão de Infantaria Blindado-CMSE-2a DE- Campinas/SP , trabalho executado na seção técnica de ensino. (fevereiro/1991 a abril/1992) TecForm administração Ltda, estágio realizado na empresa-escola localizada na Fundação Bradesco /Campinas-SP no departamento de auditoria e inspetoria. (agosto/1989 a dezembro/1991). • •. Honras. • • • • •. 1o Colocado no exame de ingresso ao curso de Mestrado do Instituto de Química-Unicamp (agosto/2001) Prêmio Lavoisier, concedido pelo Conselho Regional de Química-IV Região-SP devido ter obtido os melhores resultados durante o curso de graduação de bacharel em química tecnológica (março/2001). Medalha de Bronze, concedido pelo Banco Real S.A. devido ter alcançado a cota de abertura de contas correntes estipulada pela Campanha Batalha Real (julho/1999). Diploma de Honra ao Mérito, concedido pelo 28o Batalhão de Infantaria Blindado-NPOR, devido aos bons serviços prestados durante o serviço militar (março/1993). Medalha de Honra ao Mérito, concedido pela direção da Fundação Bradesco, devido ter obtido os melhores resultados durante o curso de técnico em administração (dezembro 1991).. vii.

(6) Congressos. Atividades extra curriculares. •. WorkShop em Terapia Fotodinâmica: Complexo de Moléculas Fotoativas e suas Aplicações. Aspectos Físicos, Químicos, Biológicos e Médicos – Novembro/2002 – São Pedro-SP. • Apresentação de palestra: Determinação do mecanismo de ação da meso-tetrafenilporfirina de índio na fotoxidação de biomoléculas. • Apresentação de pôster: Eficiência da meso-tetrafenilporfirina de índio na fotoxidação de biomoléculas.. •. XXXI Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular – Maio/2002 – Caxambu-MG. • Apresentação de pôster: Analysis of photosensitizing properties of In(III)-meso-tetraphenylporphyrin to use in photodynamic therapy.. •. Representante discente junto a comissão de pós-graduação do Instituto de Química da Unicamp. (2002-2003). •. Representante discente junto a comissão de graduação do Instituto de Química da Unicamp. (1997-1998). viii.

(7) Análise das Propriedades Fotossensibilizantes do In(III)mesotetrafenilporfirina para uso em Terapia Fotodinâmica. Resumo Foi estudada a capacidade da meso-tetrafenilporfirina de índio (InTPP) para atuar como sensibilizador na terapia fotodinâmica (PDT), através da comparação dos valores das constantes de velocidade (k) de fotoxidação do triptofano (Trp), albumina bovina (BSA) e eritrócitos na presença de InTPP ou Photofrin®. O mecanismo de ação do InTPP na fotoxidação de biomoléculas e eritrócitos, através do efeito da azida de sódio (NaN3) e de água deuterada (D2O) sobre a constante de velocidade da reação de fotoxidação foi também estudado. As soluções contendo as biomoléculas foram irradiadas com uma lâmpada de mercúrio, em um período máximo de 60 minutos e suas fotoxidações foram monitoradas pelas determinações das fluorescências. Através de k pode-se verificar que o InTPP foi, em média, 26% mais eficiente em fotoxidar o Trp e a BSA, quando comparado à eficiência do Photofrin®. Os resultados das fotoxidações das soluções de eritrócitos, utilizando-se uma baixa concentração de InTPP ou de Photofrin® (0,2 mg L-1), em um período de irradiação entre 60 a 120 minutos, mostraram que o InTPP é 83 vezes mais eficiente do que o Photofrin®. Para soluções mais concentradas (4,9 e 15,3 mg L-1) observou-se que a hemólise de 50% das hemácias foi mais rápida quando se utiliza o InTPP. No entanto, para estas concentrações, a hemólise atingiu um valor máximo de 80%, provavelmente devido ao favorecimento da agregação do InTPP em um meio contendo hemácias. Os resultados obtidos no estudo das propriedades fotossensibilizantes do InTPP indicam que esta substância é, provavelmente, um potencial fotossensibilizador para uso em PDT. Os resultados também mostraram que a constante de velocidade de fotoxidação de Trp e de BSA aumentou 4 e 13 vezes, respectivamente, na presença de D2O e diminuiu 4 e 3 vezes, respectivamente, na presença de NaN3, indicando que o mecanismo preponderante na fotoxidação de biomoléculas é do tipo II.. ix.

(8) Analysis of photosensitizing properties of the In(III)-mesotetraphenylporphyrin to use in photodynamic therapy. Abstract The use of indium (III)-mesotetraphenylporphyrin (InTPP) as a sensitizer in photodynamic therapy (PDT) was investigated by comparing the rate constants (k) of tryptophan (Trp), bovine albumin (BSA) and erythrocytes photoxidation in the presence of InTPP or Photofrin®. The mechanism involved in the photoxidation of biomolecules and erythrocytes was also studied by seeing how sodium azide (NaN3) and deuterium oxide (D2O) affect the photoxidation rate constant. The solutions of biomolecules were irradiated with a mercury lamp, for a maximum period of 60 minutes and their photoxidations were monitored for measures of fluorescence. It can be verified by was of k that the InTPP was, in average, 26% more efficient to photoxidate Trp and BSA when compared with the efficiency of Photofrin®. Results of erythrocytes solutions photoxidations, using a low concentration of InTPP or Photofrin® (0,2 mg.L1), in the irradiation period of between 60 and 120 minutes, showed that InTPP is 83 times more efficient than Photofrin®. For more concentrated solutions (4,9 and 15,3 mg.L-1), it was observed that haemolysis of 50% of the erythrocytes was faster when the InTPP is used. However, the haemolysis reached a maximum value of 80% for these concentrations, probably because of the favoring of photosensitizer aggregation in the erythrocytes solutions. The results obtained from the study of photosensitizing properties of InTPP indicate that this compound is, probably, a potential photosensitizer to use in PDT. The results showed that the photoxidation rate constant of Trp and BSA increased 4 and 13 times, respectively, in the presence of D2O and decreased 4 and 3 times, respectively, in the presence of NaN3, indicating that the preponderant mechanism in the biomolecules photoxidation is of type II.. x.

(9) ÍNDICE 1 2. 1. INTRODUÇÃO 1.1 Definição 1.2. Histórico. 2. 1.3. Mecanismo. 5. 1.4. Oxigênio singlete. 8. 1.5. Apoptose. 11. 1.6. Necrose tumoral devido ao efeito vascular da PDT e a interferência do. 15. óxido nítrico 1.7. Propriedades de um fotossensibilizador. 17. 1.8. Novos fotossensibilizadores. 19. 1.8.1. 22. As meso-tetrafenilporfirinas e a PDT. 2. OBJETIVO. 24. 3. JUSTIFICATIVA. 24. 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Reagentes e equipamentos. 25 25. 4.2. Determinação do comprimento de onda de excitação e de emissão. 25. 4.3. Estudo do estado de agregação do fotossensibilizador. 26. 4.3.1. Influência da concentração de Tween20 e da porcentagem de. 26. fase aquosa no estado de agregação do InTPP 4.3.2 4.4. Determinação da constante de dimerização. Fotoxidação de biomoléculas. 27 28. 4.4.1. Triptofano. 28. 4.4.2. Albumina bovina. 29. 4.4.3. Cálculo da constante de velocidade. 29. 4.4.4. Sistema utilizado na fotoxidação de biomoléculas. 31. 4.5. Fotobranqueamento do InTPP. 31. 4.6. Hemólise de células vermelhas do sangue. 33. 4.7. Determinação do mecanismo envolvido na fotoxidação de biomoléculas. 35. xi.

(10) 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Espectros de absorção e de emissão dos fotossensibilizadores 5.2. Estudo do estado de agregação do fotossensibilizador 5.2.1. Influência da concentração de Tween 20 e da porcentagem de. 36 36 39 39. fase Aquosa no estado de agregação do InTPP 5.2.2 5.3. Determinação da constante de dimerização. Fotoxidação de biomoléculas. 42 50. 5.3.1. Fotoxidação de triptofano. 50. 5.3.2. Fotoxidação de albumina bovina. 57. 5.4. Fotobranqueamento do InTPP. 60. 5.5. Hemólise de eritrócitos. 64. 5.6. Determinação do mecanismo envolvido na fotoxidação de biomoléculas. 70. 6. CONCLUSÕES. 76. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 78. xii.

(11) ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 – Mecanismos de fotoxidação de biomoléculas.. 5. Figura 2 – Reações envolvidas na geração de intermediários de oxigênio altamente reativos, como • O2-, H2O2 e • OH.. 6. Figura 3 – Reações do oxigênio singlete com algumas biomoléculas.. 8. Figura 4 – Representação dos orbitais moleculares π*x e π*y relativos às formas 1∆x e 1∆y do oxigênio singlete: os lóbulos sombreados representam o orbital molecular antiligante que possui o par de elétrons.. 9. Figura 5 – Estrutura de alguns fotossensibilizadores pesquisados.. que vem sendo. 21. Figura 6 – Estrutura da meso-tetrafenilporfirina de Ga.. 23. Figura 7 – Sistema utilizado na fotoxidação de biomoléculas.. 31. Figura 8 – (A) Espectros de absorção e de emissão do InTPP (8,5 mg.L-1), em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v). (B) Espectros de absorção e de emissão do Photofrin (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.. 38. Figura 9 – Convolução dos espectros de absorção e emissão do (A) InTPP (8,5 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v), e do (B) Photofrin (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.. 39. Figura 10 – (A) Variações do espectro de fluorescência ou (B) da intensidade de fluorescência em 613 nm do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e diferentes concentrações de Tween® 20. (C) Variações do espectro de fluorescência ou (D) da intensidade de fluorescência em 613 nm do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e diferentes porcentagens de fase aquosa.. 41. Figura 11 – Intensidade de fluorescência relativa versus concentração de InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v).. 42. Figura 12 – Gráfico C/F versus F para determinação da constante de dimerização do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v).. 43. xiii.

(12) Figura 13 – Estrutura da deuteroporfirina IX (A), mesoporfirina IX (B) e do InTPP (C).. 44. Figura 14 – Variação da absorbância do InTPP em função da concentração, em meio tamponado PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, no comprimento de onda 427 nm.. 44. Figura 15 – Formação de dímeros para os derivados de hematoporfirina.. 46. Figura 16 – Conformação do tipo H (face-a-face) para agregados de hematoporfirina.. 47. Figura 17 – Interação entre dímeros de TPP para a formação de oligômeros.. 48. Figura 18 – Formação de dímero através de ponte oxo.. 49. Figura 19 – Espectro de emissão da Lâmpada de Hg e espectro de absorção (A) de InTPP (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v), e (B) espectro de absorção do Photofrin (15,3 mg.L-1) em PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.. 50. Figura 20 – (A) Espectros de absorção e emissão de uma solução 150 µM de triptofano em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20, 5% (v:v) de DMF e 15,3 mg.L-1 de InTPP. (B) Espectros de absorção e emissão de uma solução 150 µM de triptofano em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e 15,3 mg.L-1 de Photofrin®.. 52. Figura 21 – Gráfico ln(F/Fo) versus tempo de irradiação para a fotoxidação de triptofano (150 µM), na presença de (A) InTPP (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, e na presença de (B) Photofrin (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.. 53. Figura 22 – Fotoxidação de Trp (175 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP (A) e Photofrin (B), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). (C) Gráfico da variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação do triptofano em relação a concentração do fotossensibilizador.. 55. Figura 23 – Variação da intensidade de fluorescência de uma solução 100 µM de BSA, durante fotoxidação na presença de tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), InTPP 9,3 mg.L-1 e 5% de DMF.. 57. xiv.

(13) Figura 24 – (A) Espectros de absorção e emissão de uma solução 40 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20, 5% (v:v) de DMF e 15,3 mg.L-1 de InTPP. (B) Espectros de absorção e emissão de uma solução 100 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e 15,3 mg.L-1 de Photofrin®.. 58. Figura 25 – Fotoxidação da BSA (23,5 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP (A) e Photofrin (B), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). (C) Gráfico da variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação da BSA em relação a concentração do fotossensibilizador.. 59. Figura 26 – Fotobranqueamento de uma solução 15,3 mg.L-1 de InTPP, em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, monitorado pela variação da fluorescência do InTPP no comprimento de onda 613 nm.. 61. Figura 27 – Mecanismo do fotobranqueamento de complexos metálicos de meso-tetrafenilporfirina.. 63. Figura 28 – Variação da absorbância da oxihemoglobina na fotoxidação de uma solução 0,5% (v:v) de eritrócitos em tampão PBS pH 7.4, 1% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de 4,8 mg.L-1 de InTPP.. 64. Figura 29 – Porcentagem de hemólise em soluções 0,5% (v:v) de hemácias, em tampão PBS pH 7.4 e na presença de diferentes concentrações de (A) Tween 20 e (B) DMF.. 66. Figura 30 – Porcentagem de hemólise das soluções de eritrócitos (0,5% v:v), devido ação do InTPP ou Photofrin® (0,2-15,3 mg.L-1), em tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF.. 67. Figura 31 – Visualização da hemólise de uma solução 0,5% (v:v) de eritrócitos, em tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de InTPP ou Photofrin® (4,9 mg.L-1).. 70. Figura 32 – Reações de supressão do 1O2 singlete pela ação da NaN3.. 71. Figura 33 – Variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação do Trp (150 µM) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (20 µM), na presença de concentrações variadas (A) de NaN3 e (B) de D2O.. 72. xv.

(14) Figura 34 – Fotoxidação (A) de uma solução 116 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (24 µM), com a presença de NaN3 e fotoxidação (B) de uma solução 23 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (1,1 µM), com a presença de D2O.. 73. Figura 35 – Porcentagem de hemólise de uma solução 0,5% (v:v) de hemácias, em tampão PBS pH 7.4, Tween 20 0,05% (v:v) e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de InTPP (6,4 µM) e D2O.. 74. xvi.

(15) ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 – Ocupação dos orbitais moleculares antiligantes para os estados eletrônicos do O2.. 9. Tabela 2 – Concentração de fotossensibilizador necessária para inibir 50% do crescimento do neurito.. 23. Tabela 3 – Constante de velocidade da fotoxidação do Trp (150 µM) na presença de InTPP ou Photofrin (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v).. 53. Tabela 4 – Valores de k2.α para a fotoxidação de Trp (175 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP e Photofrin, tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v).. 56. Tabela 5 – Valores de k2.α para a fotoxidação da BSA (23,5 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP e Photofrin, tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v).. 60. Tabela 6 – Tempo necessário para que 50% das células vermelhas do sangue sejam hemolisadas pelos fotossensibilizadores.. 69. xvii.

(16) Dissertação de mestrado. 1.. André Romero da Silva. INTRODUÇÃO Tumor, sinônimo de neoplasma ou blastoma, é o crescimento anormal dos tecidos,. onde as células doentes com um distúrbio genético passam a se reproduzir mais rapidamente do que as células normais. O tumor é maligno quando seu crescimento é muito acelerado e desorganizado e com tendência a se alastrar a outros órgãos1. Câncer é a designação genérica de qualquer tumor maligno; a palavra câncer é derivada do latim (cancer) e significa caranguejo. O nome é decorrente da facilidade com que este crustáceo tem de se aderir firmemente em qualquer lugar, assim como o tumor se adere ao local do corpo humano em que se desenvolve1. Estimativas da incidência e mortalidade por câncer, realizadas pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA), prevêem para 2002 um total de 246.000 óbitos e 700.000 novos casos no Brasil. O câncer se constitui na terceira causa de mortes em nosso país, perdendo apenas para as causas externas, como acidentes de trânsito, e mortes por doenças do coração 2. Atualmente, os hospitais brasileiros dispõem dos seguintes recursos para o tratamento. do. câncer:. cirurgia,. radioterapia,. quimioterapia,. hormonioterapia. e. imunoterapia, que podem ser usados de forma isolada ou combinados. O tratamento cirúrgico é uma técnica radical que visa à retirada do órgão afetado pelo câncer, ocasionando em muitas situações, alterações fisiológicas nos pacientes como alterações dos processos digestivos e de excreção, sendo sua utilização limitada à localização e às dimensões do tumor. A radioterapia é um método capaz de destruir células tumorais, empregando um feixe de radiações ionizantes, sendo que a resposta do tecido às radiações depende de fatores como a sensibilidade do tumor à radiação, sua localização e o tempo de irradiação do tumor. A quimioterapia é uma técnica baseada na utilização de substâncias químicas que interferem na síntese de enzimas celulares, afetando a função e a proliferação das células normais como das neoplásicas. A hormonioterapia é uma técnica baseada na manipulação. do. sistema. endócrino. estabelecido. para. neoplasias. malignas. hormoniossensíveis. Inicialmente utilizada no câncer de mama, a hormonioterapia foi sendo subseqüentemente aplicada a outros tumores que mostravam hormoniossensibilidade, como os carcinomas tiroidianos e de próstata. A imunoterapia esta baseada na utilização de substâncias que estimulam o sistema imunológico a alterar a resposta biológica do 1.

(17) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. organismo, proporcionando capacidade imunológica de combate às células cancerígenas através da produção de linfócitos e monócitos reguladores do crescimento celular 2. Embora nos últimos anos estas técnicas tenham sofrido um desenvolvimento substancial, permitindo o aumento do tempo de vida dos pacientes com câncer, ainda os pacientes são acometidos de efeitos colaterais, como alopecia (queda de cabelo), alterações gastrintestinais (náuseas, vômitos e diarréia) e adinamia (prostração física), tornando o tratamento muito difícil aos doentes. Diante dos graves efeitos colaterais e da eficiência limitada das terapias tradicionais (cirurgia, quimioterapia e radioterapia) outras alternativas estão sendo constantemente propostas na área da oncologia, a fim de se obter formas mais seletivas de tratamento que possam atuar preferencialmente sobre os tecidos tumorais e causar menos efeitos colaterais. 1,2. . Dentre estas, destaca-se a terapia fotodinâmica (PDT),. uma modalidade relativamente nova no tratamento de câncer 1.. 1.1. Definição A fototerapia é definida como sendo o uso da luz visível ou visível próximo. (infravermelho) como agente terapêutico na medicina clínica, sendo dividida em duas categorias: direta, sem a administração de um fotossensibilizador (o tratamento de icterícia neonatal com feixe de luz na região do azul); e a indireta, onde o efeito é obtido via administração de um fotossensibilizador o qual absorve efetivamente a luz 3,4. Esta última é mais conhecida como PDT, uma técnica usada para o tratamento de câncer que está baseada no uso combinado da administração sistêmica de um fotossensibilizador, o qual é retido preferencialmente pelo tumor, e na iluminação da lesão por meio de uma fonte de luz visível de alta intensidade, a qual fotodestroi o neoplasma através da geração de radicais tóxicos ou através do oxigênio singlete. 3,5. . A PDT também é utilizada para. destruição de vírus, bactérias e fungos 6.. 1.2. Histórico Há mais de 4.000 anos atrás os egípcios deram início a essa terapia, através da. ingestão de plantas (contendo os psoralenos, furo[3,2-g]-coumarina ou ácido 6-hidroxi-5benzofurano-acrílico δ-lactona) e luz solar, para tratar doenças como o vitiligo1. No entanto, considera-se que a fototerapia tenha sido originada em 1890 quando Finsen tratou 2.

(18) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. uma tuberculose cutânea (lupus vulgaris), utilizando-se uma lâmpada de arco-carbono (constituída de dois eletrodos de carbono conectados a um terminal de corrente elétrica e separados por poucos milímetros) e um filtro para radiação infravermelha, fato que rendeu ao pesquisador o prêmio Nobel de 1903 4. Em 1900 Raab relatou que a combinação de alaranjado de acridina e luz poderia destruir microorganismos7. Em 1920 Policard notou que tecidos tumorais eram inerentemente mais fluorescentes do que tecidos normais 5. Ronchese tentou, em 1950, ativar moléculas endogênicas fluorescentes em tecidos tumorais para identificar de forma mais exata as fronteiras do tumor. Entre 1940 e 1960 Figge e Rasmussen-Taxdal administraram porfirinas naturais a pacientes com câncer, na tentativa de se detectar com maior precisão os tumores através da fluorescência7. Na década de 50 Schwartz mostrou que nos experimentos relizados por Meyer-Betz para identificar substâncias fototóxicas bioendogênicas, o príncipio ativo não estava relacionado ao estado monomérico da hematoporfirina (pois esse composto é facilmente eliminado do organismo), mas na realidade tratava-se de uma mistura de diversas substâncias oligoméricas provenientes do método original de síntese e isolamento a partir do sangue 8. Schwartz enriqueceu a mistura de oligômeros e a chamou de derivados de hematoporfirina e Richard Lipson, sob sua orientação, em 1960, investigou o acúmulo preferencial destes oligômeros em tumores implantados em camundongos e ratos, sendo observado que a incidência de luz proporcionava regressão da doença 1. Richard Lipson foi o primeiro a tratar uma paciente com câncer de mama e metástase na região torácica por PDT em 1966. Após Lipson, experimentos usando a PDT no tratamento do câncer foram realizados, em 1972, pela universidade da Califórnia, universidade de San Francisco e pelo instituto do câncer Roswell Park (Buffalo-New York)9. Em 1976, Kelly e Snell trataram um paciente com câncer na bexiga usando derivado de hematoporfirina (Hpd) e luz branca, registrando respostas positivas sobre a técnica 9. Ainda na década de 70, várias preparações de derivados porfirínicos começaram a ser testadas para uso em PDT, culminando com o desenvolvimento do Photofrin II. . (refinamento do Hpd) por Dougherty 1. Então, o grupo da Roswell Park começou a realizar um amplo estudo clínico da PDT para o tratamento de tumores cutâneos em estado de 3.

(19) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. metástase, de mama e outros, usando Photofrin II. . e uma lâmpada que emitia na região. do vermelho 9. Os resultados da primeira fase dos tratamentos clínicos com PDT utilizando-se Photofrin II  foram registrados em 1977 e 1978 9. Posteriormente, no fim da década de 80, a empresa QLT Inc. através de purificações e otimizações do preparado anterior, via processos. de. liofilização,. chegou. ao. medicamento. Photofrin. (éter/éster. de. dihematoporfirina). No ano 2000, a QLT vendeu a marca do seu produto para a Axcan Scandipharm Inc 1. O Photofrin é o único medicamento aprovado pela FDA/EUA (Food and Drug Administration) para o tratamento do câncer com a técnica de PDT (aprovação datada de 22 de dezembro de 1998) sendo vendido no mercado a U$ 2.200/75 mg 1. Entretanto vários autores3,10,11,12 relataram algumas desvantagens deste fotossensibilizador, como a alta sensibilidade do tecido irradiado e fraca absorção da banda na região do vermelho. No Brasil a técnica de PDT vem sendo implantada desde 1999, pela equipe do Dr. Guilherme Cestari Filho, médico do Hospital Amaral de Carvalho em Jaú-SP que foi pioneiro na implantação da terapia fotodinâmica no país, e pela equipe da Prof. Dr. Cacilda da Silva Souza, médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-SP13. Clinicamente, o PDT tem sido principalmente usado para câncer de bexiga, pulmão, cérebro, mama, pescoço, oral, doenças malignas da pele e para cânceres do tratoaerodigestivo, em países como Canadá, Alemanha, Estados Unidos, França, Japão e Brasil. Dados recentes demonstram que o número de pacientes tratados com PDT no ano 2000 foi superior a 15.000 13,14.. 4.

(20) Dissertação de mestrado. 1.3. André Romero da Silva. Mecanismo Existem dois mecanismos de ação dos fotossensibilizadores sobre as biomoléculas:. mecanismo do tipo I e mecanismo do tipo II, conforme representado na figura 1. 3,5,15,16,17. .. Fotoprodutos Biomoléculas. S1. 1. o. O2 + P. T1 3. Tipo II So Fonte Luz. hv v. Fotosensibilizador (P). O2. Fotoprodutos Biomoléculas. S1. Tipo I. 3. O2. .- + P .+. T1 3. O2. So. .+ .- Biomoléculas P + S . . HP + S Figura 1 – Mecanismos de fotoxidação de biomoléculas.. Na figura 1, temos uma representação dos níveis de energia eletrônico/vibracional de um fotossensibilizador, o qual é excitado a um determinado nível de energia após ser irradiado através de uma fonte de excitação. Como os processos de decaimentos não radioativos, sobretudo as relaxações vibracionais (> 1012 s-1), são mais rápidos do que os processos de decaimentos radioativos como fluorescência (106-109 s-1) e fosforescência (10-2-104 s-1), as moléculas excitadas do fotossensibilizador decaem por relaxações vibracionais, em geral, ao primeiro estado singlete excitado S1 (regra de Kasha)18. Deste nível de energia, as moléculas do fotossensibilizador podem decair ao estado fundamental So por fluorescência (transição S1→So do diagrama) e por processos não radioativos como relaxações vibracionais e conversões internas (não representados na figura 1) ou podem 5.

(21) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. sofrer transições não radioativas a um estado triplete excitado via cruzamento intersistemas (transição S1→T1 do diagrama). Neste nível de energia as moléculas do fotossensibilizador podem sofrer decaimentos radiativos como fosforescência (transição T1→So do diagrama) e não radioativos como conversões internas (não representados na figura 1), retornando ao estado fundamental 18. No mecanismo do tipo I, os fotossensibilizadores no estado triplete interagem diretamente com o substrato e/ou solvente, através de reações de transferência de elétrons ou transferência de hidrogênio, gerando íons radicais ou radicais, os quais reagem instantaneamente com o oxigênio, produzindo uma mistura de intermediários de oxigênio altamente reativos, conforme figura 2, como radical superóxido (•O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (•OH), capaz de oxidar uma grande variedade de biomoléculas. O2. e. O2. O2. O2. O2. H2O2. 2H. H2O2 O2. O2 OH. OH. Figura 2 – Reações envolvidas na geração de intermediários de oxigênio altamente reativos, como • O2-, H2O2 e • OH. Substâncias com estruturas facilmente oxidáveis (como phenóis e aminas) ou reduzíveis (como quinonas) em meios polares e anaeróbios, favorecem o mecanismo do tipo I3. Este mecanismo também é favorecido pelo uso de fotossensibilizadores que absorvem na região espectral do ultravioleta, devido aos estados tripletes apresentarem energias relativamente altas, facilitando as reações de transferência de hidrogênio e por conseqüência a formação de radicais19. Processos de transferência de elétrons são claramente. aumentados. sobre. a. excitação. de. fotossensibilizadores. à. estados. singlete/triplete de altas energias, em razão do aumento do caráter doador de elétrons do fotossensibilizador 5. No mecanismo do tipo II, os estados tripletes excitados dos fotossensibilizadores, podem interagir com o estado fundamental do oxigênio (3∑g– O2 ou 3O2) para produzir o oxigênio singlete (1∆g O2 ou 1O2), o qual é citotóxico, através de um processo de 6.

(22) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. transferência de energia não radioativo. O mecanismo de transferência de energia aparenta ser mais eficiente (constantes de velocidade por volta de 2x1010 M-1s-1) quando comparado às constantes de velocidade das reações de transferência de cargas (mecanismo tipo I), usualmente abaixo de 107 M-1s-1. 20,21,22. . Esta transferência de energia dos estados tripletes. de ftalocianinas para o oxigênio, em soluções aquosas, é muito rápida (valores entre 2x109 a 6x109 M-1s-1). 23. . Consequentemente, a energia transferida para outros compostos que. possam competir com o oxigênio é esperado ser de menor importância e o mecanismo do tipo II, é comumente dominante, ocorrendo conforme esquema abaixo 3,17,24,25,26,27,28,29 .. F(So). hv. F(S1) cints F(T1). F(T1) + 3O2. F(So) + 1O2. Biomoléculas + 1O2. Produtos. onde: cints = cruzamento intersistemas F = fotossensibilizador; So, S1 = estado singlete fundamental e excitado, respectivamente; To, T1 = estado triplete fundamental e excitado, respectivamente. O oxigênio singlete pode reagir com lipídeos insaturados (incluindo colesterol) e aminoácidos, como o triptofano, conforme figura 3. Lipídeos insaturados e proteínas são os principais constituintes das membranas biológicas, sendo alvos subcelulares destruídos na PDT. Portanto, estas reações ocasionam alterações da permeabilidade celular, provocando efeitos celulares como edemas, resultando na morte das células3,4.. 7.

(23) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. Lipídios insaturados 1. O2. Produtos. Ene adição. OOH. Colesterol. R. R 1. O2. Ene adição. HO. HO OOH. Triptofano. RNH. RNH CH2. CH. CH2 CH O. COR' 1. O2. O. COR'. C. O. RNH CH2. CH. COR'. Cicloadição. NH. NH. NHCHO. Metionina SMe CH2. OSMe 1. CH2. O2. CH2. CH2. RNHCHCOR'. RNHCHCOR' sulfóxido. Guanina O N. HN H2N. N. NH. 1. O2. O. H2N. NH O. NH H2N. O. CO2. NH. Figura 3 – Reações do oxigênio singlete com algumas biomoléculas.. 1.4. Oxigênio singlete Os três estados eletronicamente excitados imediatamente superiores ao oxigênio. molecular no estado fundamental (3∑g-) são denominados de oxigênio singlete. Segundo a teoria do orbital molecular, a configuração eletrônica do oxigênio no estado fundamental possui dois elétrons desemparelhados nos orbitais moleculares degenerados π*x e π*y. Estes elétrons tendem a possuir o mesmo spin de forma a produzir multiplicidade máxima e 8.

(24) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. assim, um estado de mais baixa energia. Esta é a razão pela qual o estado fundamental do oxigênio é um estado triplete. A tabela 1 apresenta as formas de ocupação nestes orbitais moleculares antiligantes, para o oxigênio no estado fundamental, assim como, para os estados excitados imediatamente superiores 6,22.. Tabela 1 – Ocupação dos orbitais moleculares antiligantes para os estados eletrônicos do O2. Estado Orbital molecular antiligante Energia(a) (KJ.mol-1) 3. ∑g-. 1 1. ∆g. ∆x. [ ↑↓ ] π*x [. {∆ 1. 1 (a). [ ↑ ] π*x [ ↑ ] π*y. [. y. ∑g+. 0. ] π*y. 92,4. ] π*x [ ↑↓ ] π*y. 92,4. [ ↑ ] π*x [ ↓ ] π*y. 159,6. relativa ao estado fundamental. Destes estados, os que possuem energia intermediária (1∆x e 1∆y; 92,4 KJ.mol-1) são. os responsáveis pela reatividade química do oxigênio singlete. A simetria dessas moléculas, diferente da do estado fundamental, lhes confere um considerável tempo de vida quando comparado com a forma de mais alta energia (1∑g+; 159,6 KJ.mol-1), que possui a mesma simetria do estado fundamental. Os estados 1∆x e 1∆y são degenerados e possuem uma distribuição eletrônica onde os elétrons que ocupam um dos orbitais antiligantes π* se encontram em um dos planos mutuamente perpendiculares, conforme figura 4 6.. y. y x. y. y x. x. (1 x. x. (1 y. (. (. Figura 4 – Representação dos orbitais moleculares π*x e π*y relativos às formas 1∆x e 1∆y do oxigênio singlete: os lóbulos sombreados representam o orbital molecular antiligante que possui o par de elétrons. 9.

(25) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. Por serem degenerados, os estados 1∆x e 1∆y são, por conveniência, representados como sendo o estado 1∆g. O orbital molecular vazio no estado 1∆g garante ao oxigênio singlete um caráter eletrofílico, favorecendo sua participação em reações químicas, principalmente, no caso em que os substratos possuem sítios ricos em elétrons 6. O tempo de vida do oxigênio singlete em solução é extremamente sensível a natureza do solvente e varia de 4 a 100.000 µs 6. A desativação do 1O2 na maioria dos solventes é ocasionada por processos colisionais, onde há conversão de energia eletrônica do 1O2 em energia vibracional da molécula do solvente, devido ao acoplamento dos modos vibracionais dos ligantes terminais das moléculas dos solventes com as transições eletrônicas e vibrônicas do 1O2 30. O tempo de vida do 1O2 em água é cerca de 2-3µs e em água deuterada, situa-se em torno de 70 µs. 6,31. . Entretanto em sistemas biológicos o. oxigênio singlete apresenta tempo de vida extremamente baixo, inferior a 250 ns, difundindo-se menos do que 0,1 µm no meio celular. Como o diâmetro das células humanas variam entre 10 a 100 µm, o local de geração primária. do 1O2 na célula. determina qual a estrutura subcelular pode sofrer a ação do oxigênio singlete 5,6,32. Os sítios cistidil, histidil, metionil, triptofil e tirosil são severamente destruídos nas maiorias das enzimas e proteínas. De forma notável, os aminoácidos localizados mais na região superficial da proteína, são rapidamente fotoxidados comparados aos resíduos de aminoácidos localizados mais internamente na proteína. Se a proteína é completamente desnaturada, todos os aminoácidos suscetíveis a fotoxidação (cisteina, histidina, metionina, triptofano e tirosina) podem ser destruídos pelas espécies citotóxicas5. A maioria das proteínas estão ligadas a outras proteínas ou às moléculas de DNA ou RNA, portanto modificações fotoquímicas em sítios de ligações resultam na danificação das funções das proteínas e enzimas, como a inibição do transporte de glicose e aminoácidos e da perda da atividade biocatalítica 5. Embora seja grande o número de alvos subcelulares que podem sofrer a ação da PDT, como mitocôndrias, lisossomos e retículos endoplasmáticos, verifica-se geralmente, que os núcleos não são fotodestruídos. Isto é importante, em vista do fato que se podem excluir possíveis riscos mutagênicos ao DNA que levariam à formação de células cancerígenas 5. Os passos envolvidos na regressão tumoral compreendem a necrose maciça do tumor após 72h da exposição à luz; formação de ferida sobre a área depois de 3-4 dias da 10.

(26) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. fototerapia, desaparecimento da ferida e completa regressão tumoral dentro de 7-13 dias, seguido pela cura da pele e crescimento dos pelos após 3 semanas, sem formação de cicatrizes ou perda do tecido irradiado 13,33. Células cancerígenas não apresentam mecanismos de morte celular programada (apoptose), fato que provoca o crescimento descontrolado de células tumorais. Pesquisas têm demonstrado que a PDT pode reativar o mecanismo de morte celular programada, quando fotossensibilizadores localizados em organelas subcelulares como mitocôndrias, provocam a liberação de enzimas envolvidas na apoptose. 4,5,7. . Argawal et. al.34. demonstraram que fosfolipases C e A2, enzimas que hidrolisam fosfolipídios para produzir precursores de ácido araquidônico (fonte de hormônios como prostaglandinas e tromboxanos) e que estão envolvidas na apoptose celular, são ativadas depois da utilização do Photofrin  como fotossensibilizador .. 1.5. Apoptose Necrose e apoptose são dois caminhos pelos quais as células eucarióticas podem. morrer. A necrose é caracterizada por processos não mediados pelo ATP, como os danos vasculares nos tecidos tumorais ocasionados pela PDT enquanto que a apoptose é caracterizada por processos mediados pelo ATP como a ativação de caspases que são proteases que catalisam uma série de reações hidrolíticas, provocando a clivagem e inativação de proteínas que protegem as células da morte. 5,7. . Danos genéticos subletais. sinalizam às células para morrer apoptoticamente enquanto que danos severos destroem a habilidade das células em produzir ATP matando-as por necrose 7 . A apoptose é caracterizada por uma série de modificações celulares que podem ser vistas pelo microscópio, incluindo a condensação de cromatina e a formação de corpos apoptóticos. Pode-se avaliar se a morte celular ocorreu apoptoticamente através da avaliação de padrões eletroforéticos de DNA extraídos de células. O DNA extraído de células que morreram por apoptose formam um padrão “escada” por causa que o DNA está clivado dentro de múltiplos fragmentos chamados de corpos apoptóticos 7. O termo apoptose foi introduzido em 1972, sendo uma palavra de origem grega que significa cair em pedaços (fall off), sendo um processo fisiológico essencial para o controle do desenvolvimento e evolução do tecido. Inúmeros fenômenos biológicos se devem a este 11.

(27) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. mecanismo de morte celular controlado pela célula, como metamorfose de larvas de anfíbios (perda da cauda de girinos), atrofia de tecidos em organismos adultos por razões fisiológicas ou patológicos (atrofia de rins devido à obstrução de ductos excretores) e a eliminação das membranas interdigitais presentes na formação da mão durante a embriogênese 35,36. Embora a PDT possa ocasionar a morte celular por necrose ou apoptose, ou uma combinação destes, a terapia fotodinâmica tem demonstrado ser altamente eficiente em induzir apoptose, quando baixas concentrações de fotossensibilizadores são utilizadas em comparação as concentrações necessárias para produzir necrose 36. Quatro componentes genéricos devem ser considerados em relação ao mecanismo apoptótico: as caspases, os complexos sinalizadores de morte celular, as mitocôndrias e as proteínas da família Bcl-2. Caspases: As reações hidrolíticas centrais dos processos apoptóticos são catalizadas por uma família de proteases chamadas de caspases, as quais apresentam um sítio ativo de cisteína. Caspases são sintetizadas como pro-enzimas que são ativadas por clivagens, ou em modo autolítico ou por outras caspases. Caspases são freqüentemente classificadas como enzimas inicializadoras ou efetoras dos processos apoptóticos, dependendo da sua atuação se no estímulo de sinais iniciais ou na última etapa de destruição celular via apoptose. 36. . Caspases efetoras clivam e inativam proteínas que. protegem as células da apoptose, como as proteínas reparadoras do DNA, poli(ADPribose) polimerase, proteínas que inibem as caspases ativadoras de DNase (nuclease responsável pela fragmentação do DNA) ou as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 36. Complexos sinalizadores de morte celular: A apoptose é rapidamente induzida pela ativação de complexos sinalizadores de morte celular (DISCs – death-inducing signaling complexes) na membrana plasmática. DISCs são formados quando ligantes extracelulares interagem com os receptores das superfícies celulares pertencentes a superfamília de genes receptores ricos em cisteína, chamados TNF (do inglês tumor necrosis factor). Os receptores da morte Fas (também chamados CD95 ou Apo1) e TNFR1 (também chamados p55 ou CD120a) são os dois receptores mais bem caracterizados pela literatura. Os complexos (Fas-ligante) são importantes para eliminação de linfócitos T ativados (T-4), responsáveis pelo combate a infeções, e para induzir o ataque de linfócitos T citotóxicos 12.

(28) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. (T-8) sobre as células cancerígenas. As ligações entre Fas e seu ligante também causam a formação de domínios de morte intracelular, devido à ligação entre receptores, levando a formação de clusters que agem como receptores de procaspases como a procaspase-8, a qual é ativada por processo de auto-clivagem. A caspase-8 ativa uma cascata de caspases efetoras como a caspase-3, levando a célula à apoptose. Alternativamente a caspase-8 pode clivar uma proteína da família Bcl-2, chamada de Bid, promovendo apoptose mitocondrial 36. . Mitocôndrias: A mitocôndria vem sendo considerada como a organela central dos. processos apoptóticos. Sinais oriundos dos receptores da superfície da célula ou de sítios danificados, convergem sobre a mitocôndria, levando a permeabilização de ambas as membranas mitocondriais, dissipação do potencial transmembrana da membrana interna e liberação de proteínas relacionadas a apoptose tais como citocromo c, derivados mitocondriais ativadores de caspases e certas procaspases a partir do espaço intermembranas 36. Tem sido proposto que a liberação de proteínas indutoras de apoptose e que o colapso do potencial transmembrana mitocondrial resultam da abertura de largos canais de condução conhecidos como poros de transição de permeabilidade, os quais são formados pelo contato de sítios das membranas mitocondriais internas e externas. O potencial através da membrana mitocondrial interna é uma conseqüência do bombeamento de prótons para o lado citoplasmático da membrana usando-se a energia de transporte de elétrons. Sobre condições normais, a passagem de moléculas e íons através da membrana mitocondrial interna é fortemente regulada. Em resposta às variações no estado de oxiredução, pH e concentração local de ATP/ADP e íons, tais como Ca2+ e Mg2+, os poros de transição de membrana regulam a permeabilização da membrana. Abrindo-se um canal seletivo na membrana interna, permite-se o equilíbrio entre a matriz e o espaço intermembranas, portanto dissipando o gradiente de H+ através da membrana interna e colapsando a cadeia respiratória. Outra possível conseqüência da abertura de poros de transição de permeabilidade é a alteração do volume mitocondrial. Desde que as cristas da membrana mitocondrial interna tem uma larga área superficial quando comparadas a membrana mitocondrial externa, a expansão da matriz mitocondrial causa a ruptura da membrana externa e, conseqüentemente, a liberação de proteínas presentes no espaço intermembranas que ativam as caspases dentro do citosol 36. 13.

(29) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. Proteínas da família Bcl-2: Estas proteínas regulam a morte celular induzida por muitos estímulos apoptóticos, primariamente em nível de mitocondrias. 37. . Membros anti-. apoptóticos desta larga família de proteínas incluem Bcl-xL e Bcl-w e entre os membros pro-apoptóticos incluem Bax, Bad e Bid. Na ausência de sinais de morte, os membros da família Bcl-2 pró-apoptóticos são freqüentemente “sequestrados” por proteínas citoplasmáticas ou são associados às membranas. A atividade destas proteínas é regulada através de vários mecanismos, incluindo os níveis de “sequestros”, clivagens e fosforilações. A Bid (proteína pró-apoptótica), por exemplo, é clivada por caspase-8, gerando uma proteina (t-Bid) a qual transloca-se a mitocondria para se integrar à membrana mitocondrial, provocando a liberação do citocromo c (proteína envolvida na cadeia respiratória). O citocromo c liga-se a procaspase-9, ocasionando a auto clivagem e ativação desta caspase a qual ativa a caspase-3, desencadeando uma cascata de caspases que leva a apoptose celular 36. Deve-se salientar que a resposta apoptótica das células aos agentes danificadores do DNA, tais como a radiação ionizante, é controlada pelo gene supressor de tumores p53. Este gene provoca o acúmulo da proteína p53, a qual retarda o ciclo celular, a fim de que as mutações possam ser reparadas. Caso o reparo não seja possível, a proteína induz a célula ao suicídio, via apoptose, prevenindo a proliferação de danos genéticos que poderiam levar ao câncer. 36,44. . Fisher et al.. 38. fizeram uma comparação das respostas da. ação do PDT sobre diversas células tumorais de humanos, onde a presença da função do gene p53 foi avaliada através do acúmulo da proteína p53. Células leucêmicas promielocíticas de humanos expressaram maior sensibilidade à morte celular por PDT, utilizando-se o Photofrin e Sn-etiopurpurina, do que células HL60 nas quais o gene p53 foi inativado 38. Inúmeras pesquisas tem demonstrado que a PDT conduz à morte celular via processos apoptóticos. 5,7,39. . Kessel et. al.40 registraram perda imediata do potencial. transmembrana mitocondrial após uso da PDT sobre células leucêmicas P388, utilizandose os porficenos como fotossensibilizador. Similarmente, fotossensibilizadores localizados nas mitocôndrias como hipericina ou hipocrelina, também induzem ao rápido colapso do potencial transmembrana desencadeando o processo apoptótico. Ativação de caspases tais como 2, 6, 7 e 8 foram registradas após a liberação de citocromo c, utilizando-se o 14.

(30) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. fotossensibilizador Verteporfina sobre células cancerígenas do tipo HeLa ou células endoteliais de humanos 41. Originalmente alguns pesquisadores. 42,43. pensavam que a destruição do tecido. tumoral estivesse unicamente associada a retenção do fotossensibilizador pelo tumor em uma concentração adequada e de uma dose de luz para produzir quantidades letais de oxigênio singlete e assim danificar a célula, em geral, via destruição da membrana plasmática. Entretanto, resultados experimentais. 4,5,7,9. tem demonstrado que danos. vasculares ocasionados pela PDT podem matar as células tumorais por falta de oxigênio e nutrientes.. 1.6. Necrose tumoral devido ao efeito vascular da PDT e a interferência do óxido. nítrico A quebra da membrana celular causa a liberação de fosfolipídios, os quais são facilmente atacados por fosfolipases, gerando ácido lisofosfatídico que é um precursor do ácido araquidônico. Este ácido é o mais importante precursor de eicosanoídes (compostos constituídos por cadeias de 20 carbonos) como prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos, os quais são responsáveis por efeitos fisiológicos como: a resposta inflamatória, a produção de dor e febre, a indução de coágulos de sangue, o controle da pressão sanguínea e de várias funções reprodutivas como a indução às dores do parto 44. Enquanto a ciclooxigenase, um complexo multienzimático, catalisa a conversão do ácido araquidônico em tromboxanos (A2, B) e prostaglandinas (PGD2, PGE2), a 5lipoxigenase converte o ácido a leucotrienos (B4, C4, D4) e hidroxiácidos. Juntos, estas substâncias iniciam uma reação inflamatória aguda. Prostaglandinas primeiramente causam uma vasodilatação de arteríolas terminais e danificam o endotélio e as células musculares lisas que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. As fissuras criadas entre as células endoteliais levam a um edema local pelo aumento de efluxo de água, macromoléculas e células do sangue, como neutrófilos, leucócitos e macrófagos, dentro do tecido tumoral. Tromboxanos e leucotrienos danificam as células por vasoconstrição. Além disso, os tromboxanos promovem agregações de plaquetas (células sangüíneas responsáveis pela coagulação do sangue), levando a formação de coágulos sanguíneos. A 15.

(31) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. isquemia (ausência de circulação arterial num orgão ou região) finalmente cria uma área de hipoxia (ausência de oxigênio), iniciando o processo necrótico por falta de nutrientes 5. Entretanto, estes eventos são providos de alta sensibilidade a NO. O óxido nítrico (NO) é reconhecido como o maior efetor molecular de diversos processos fisiológicos e patológicos, como controle da ativação de linfócitos T e do desenvolvimento do cérebro embrionário, sendo um importante neurotransmissor. 45,46,47. .. Tem se tornado evidente que este gás, produzido por muitas células no corpo humano, não apenas controla importantes funções do crescimento tumoral, como tem influência sobre terapias do câncer, em especial, aquelas mediadas pela geração de espécies reativas de oxigênio, como a terapia fotodinâmica 48. Koberlik et. al.48 estudaram a influência de inibidores de NO sintase [Nω-nitro-Larginina (L-NNA) e o éster metílico de Nω-nitro-L-arginina (L-NAME)] no grau de destruição das células tumorais após o tratamento de PDT em camundongos cujos tumores são caracterizados pela elevada produção de NO (RIF e SCCVII) ou pela baixa produção de NO (EMT6 e FsaR). Os resultados mostraram que estes dois grupos tumorais respondem diferentemente ao tratamento de modulação de NO. Os tumores caracterizados pela alta produção de NO, foram mais eficientemente destruídos pela PDT quando os inibidores foram adicionados ao meio reacional. O fluxo sanguíneo regular nestes tumores aparentemente são mantidos pela constante vaso dilatação exercida pelo NO em razão do forte impacto dos inibidores L-NNA e L-NAME no grau de destruição do tumor. Deve-se ressaltar que o óxido nítrico tem um importante papel na restituição do fluxo sanguíneo, inibido devido aos processos inflamatórios desencadeados pela terapia fotodinâmica, desde que os vasos afetados não tenham sido completamente danificados. Por outro lado, o grau de destruição dos tumores que apresentam baixa produção de NO (EMT6 e FsaR) não foi afetado significativamente na presença de inibidores de óxido nítrico indicando que a perfusão sanguínea destes tumores é independente do NO48. Segundo koberlik et. al.48 o NO pode facilitar ou inibir a progressão do tumor, dependendo do genótipo tumoral e/ou do seu nível de produção pelos tumores. A facilidade em promover a progressão tumoral está associada à característica vasodilatadora do NO, que permite o fluxo sangüíneo nas células tumorais, assim como à sua capacidade de induzir angiogênesi (induzir a formação de novos vasos). Sob altas concentrações 16.

(32) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. (micromolar) o NO é citotóxico, podendo inibir a progressão tumoral em razão da inibição do citocromo c oxidase e consequentemente do processo respiratório, resultando no aumento de elétrons oriundos da cadeia respiratória e no favorecimento da superprodução de radicais superóxidos. Estes radicais, que também podem ser gerados durante a PDT, atuam diretamente na destruição celular, através da indução de stress oxidativo sobre o tecido endotelial, ou indiretamente, através da interação entre o radical superóxido e o óxido nítrico, havendo a geração do íon peroxinitrito (ONOO-), um potente oxidante e agente nitrosante capaz de reagir com proteinas, DNA, lipídios e uma variedades de outras moléculas48,49. Óxidos nitrogenados tais como o dióxido de nitrogênio (NO2) e o trióxido de dinitrogênio (N2O3) podem resultar de uma autoxidação do NO, sendo agentes nitrosantes potentes de aminas primárias e secundárias, possibilitando a desaminação de bases de DNA, desencadeando uma série de processos que levam a apoptose celular 48,49.. 1.7. Propriedades de um fotossensibilizador A escolha de um fotossensibilizador deve dar preferência a uma substância que. apresente pequena ou nenhuma toxidade no escuro, sendo cinética e termicamente estável para conferir a substância um adequado tempo de vida necessário às reações de transferência de elétrons (mecanismo tipo I) e as reações de transferência de energia (mecanismo tipo II) 3. Definido como o tempo médio que uma molécula gasta em seu estado triplete excitado, o tempo de vida do estado triplete (τT) limita o tempo disponível para a colisão entre o 3O2 e o estado triplete do fotossensibilizador. Dessa forma, quanto maior o tempo de vida do estado triplete, e desde que a energia do estado triplete seja > 94 KJ.mol-1 (energia envolvida na transição 3O2→1O2), maior será a eficiência da transferência de energia do fotossensibilizador para o 3O2 e maior será o rendimento quântico de oxigênio singlete (citotóxico), aumentando-se a eficiência fotodinâmica do fotossensibilizador 3,5,19. Deve-se ressaltar que fotossensibilizadores com baixo rendimento quântico de fluorescência apresentam maior probabilidade de decaimentos não radioativos, possibilitando um aumento do rendimento quântico do estado triplete.. 17.

(33) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. A absorção e o espalhamento de luz, pelos tecidos, aumentam quando se diminui o comprimento de onda do feixe de radiação incidente. Portanto, os fotossensibilizadores que apresentam forte absorção na região final do vermelho do espetro visível (640-700nm), são mais eficientemente excitados in vivo, pois nesta faixa do espectro eletromagnético a absorção e o espalhamento de luz por parte dos tecidos são menores, resultando no aumento do número de moléculas excitadas do fotossensibilizador. Como a penetração efetiva da luz nos tecidos tumorais dependem da absorção ótica. de cromóforos. bioendogênicos e do espalhamento da luz pelo tecido, o desenvolvimento de lasers com alto grau de monocromaticidade e coerência, na faixa de comprimento de onda também chamada de “janela terapêutica”, permite que a fotoxidação dos tecidos tumorais não seja apenas superficial, aumentando portanto, a eficiência do fotossensibilizador 3,23,50. Raramente tem sido empregadas lâmpadas de xenônio, as quais requerem o emprego de filtros adequados para a seleção do comprimento de onda de irradiação e um sistema ótico bastante eficiente a fim de dirigir a radiação ao local a ser irradiado com o mínimo de perdas 6. Lasers no estado sólido tipo Nd:YAG têm sido empregados mais recentemente, entretanto o problema nesse caso é o elevado preço de custo . Uma alternativa de custo intermediário seria a utilização dos lasers de diodo os quais cobrem praticamente todo o espectro visível e infravermelho próximo podendo assim atender boa parte dos agentes fototerapêuticos já existentes no mercado. Com o emprego de agentes fototerapêuticos de segunda geração, em virtude de sua elevada absortividade molar, o uso de diodos emissores de luz (LEDs) tem também se tornado viável, possibilitando uma maior redução no custo dos procedimentos 6,13. Alguns aparatos têm sido desenvolvidos de modo a melhorar a eficiência do tratamento em casos específicos. No tratamento do câncer de bexiga, por exemplo, tem-se empregado um difusor esférico, o qual é montado na extremidade do feixe de fibras ópticas introduzida no paciente através de um endoscópio: isto melhora a distribuição de luz no interior da bexiga 6,13. A partir de uma certa concentração os fotossensibilizadores passam a se agregar, levando a diminuição do tempo de vida da fluorescência e fosforescência, devido ao aumento dos decaimentos não radioativos por conversão interna o que torna mais difícil a transferência de energia do fotossensibilizador do estado triplete excitado para o 3O2. 51,52. ,. diminuindo a eficiência do fotossensibilizador. Os valores de pH, variações de 18.

(34) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. temperatura, estruturas moleculares, a natureza do íon metálico central e os grupos funcionais. periféricos. substituídos. nos. fotossensibilizadores,. podem. influenciar. grandemente a agregação 53,54. Alguns derivados porfirínicos exibem alta afinidade por lipoproteínas de baixa densidade (LDL) do fluxo sangüíneo e como extensamente documentado, tecidos em metástase. possuem alta concentração de receptores deste tipo de lipoproteína (em. comparação às células normais). Esta propriedade promove um maior acúmulo do fármaco no tecido doente, de maneira que tem sido aceito que a seletividade tumoral aumenta com o caráter lipofílico do agente fotossensibilizante 1,4,5. As substâncias fotoativas devem ser suficientemente anfifílicas para penetrarem nas membranas intra e extracelulares, a fim de atingir mais rapidamente os tecidos tumorais 17,32. . Para fotossensibilizadores hidrofóbicos é necessário o uso de suspensões micelares,. lipossomos ou adição de grupos polares para permitir sua penetração nas membranas 7.. 1.8. Novos fotossensibilizadores Apesar de diversos tipos de compostos fotossensíveis terem sido intensamente. investigados, o primeiro a ser aprovado pela FDA para o tratamento de câncer através da PDT foi um derivado de hematoporfirina (Photofrin) produzido pela QLT Inc. e atualmente vendido pela Axcan Scandipharm Inc., o qual apresenta outras variantes comerciais como Photosan, Photogem e Photocarcinorin 1. O Photofrin, considerado como um fotossensibilizador de primeira geração, é uma mistura de derivados de hematoporfirina que ministrado de forma intravenosa, acaba sendo absorvido principalmente pelos tecidos tumorais na ordem de micrograma por grama de tecido. Somente o fígado e o baço é que acumulam doses comparáveis aos tumores, não sendo metabolizada pelo organismo humano. Sua excreção é lenta, sendo bifásica: uma porcentagem maior da droga tem tempo de vida de cerca de 12 horas enquanto que a droga restante desaparece depois de 8-10 dias. A excreção lenta do Photofrin é responsável pela fotossensibilidade que ocorre em pacientes por várias semanas depois do tratamento com PDT 4. Em geral, o protocolo padrão empregado em terapia de tumores, envolve a administração intravenosa do agente fototerapêutico (cerca de 1,5 a 5 mg/Kg de massa 19.

(35) Dissertação de mestrado. André Romero da Silva. corporal). Estas quantidades são ínfimas se comparadas às doses mínimas que podem induzir efeitos tóxicos em seres humanos (300-500 mg/Kg). O início do tratamento ocorre entre 24 a 72 horas após a administração do agente fototerapêutico, onde o tumor é irradiado com fontes que emitem na região do visível e do infravermelho próximo, com uma fluência de radiação incidente entre 100 e 200 mJ.cm-2, de modo a evitar o sobreaquecimento dos tecidos, o que reduziria a seletividade do processo 4,6. Entretanto, vale ressaltar que as concentrações utilizadas de medicamento e as características do laser (tipo, dosagem de potência e tempo de iluminação) dependem da droga que está sendo aplicada e da espécie e gravidade da doença tratada 1,4,13. Embora o Photofrin represente um importante progresso na pesquisa de novas terapias oncológicas, envolvendo pequenos efeitos colaterais, há algumas desvantagens a serem citadas. Mais especificamente: 1) o Photofrin tem pequena absorção na região da “janela terapêutica” limitando sua eficiência na PDT; 2) sua excreção lenta pelo organismo, devido ao fato do mesmo ser retido em vários tipos de tecidos normais como pele e fígado, por períodos de 4-6 semanas, resulta em uma prolongada fotossensibilidade do tecido irradiado, exigindo que o paciente permaneça ao abrigo do sol por vários dias; 3) é constituído por uma mistura complexa de derivados de hematoporfirinas, de maneira que o isolamento e purificação da droga não é simples nem barato, se constituindo em um fotossensibilizador pouco acessível economicamente (75mg de Photofrin custam U$ 2.200) 4,6,13. Com o objetivo de se diminuir os itens acima citados e de se aumentar a destruição dos tecidos irradiados é que inúmeros fotossensibilizadores vem sendo sintetizados e estudados. O fato das porfirinas serem bons geradores de oxigênio singlete e que esta forma ativa de oxigênio é responsável, em geral, pela eficiência da PDT, faz com que novos derivados porfirínicos sejam pesquisados 4. Especial atenção tem sido dada ao grau de hidrofobicidade e hidrofilicidade destes novos fotossensibilizadores, uma vez que o esqueleto porfirínico é essencialmente hidrofóbico e a hipótese que a localização tumoral poderia ser modulada pela introdução de substituintes polares, tem estimulado a síntese de estruturas com ácidos sulfônicos, ácidos carboxílicos, hidroxil e sais quaternários de amônio como substituintes 4. Pesquisadores. 7,55,56. têm sintetizado fotossensibilizadores. conjugados a fosfolipídios, proteínas ou polissacarídeos a fim de aumentar a capacidade de 20.