Atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos

A Tabela 2 apresenta a atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos determinada pelo método do sequestro do radical livre DPPH.

De modo geral, os carotenoides produzidos nos diferentes meios de cultivo não apresentaram capacidade antioxidante satisfatória, possivelmente os carotenoides obtidos nestes extratos apresentem outro tipo de mecanismo de inibição. O extrato proveniente do M2 com a levedura P. fermentans foi uma exceção, apresentando valores de até 129,6 % inibição.µg^-1, ao final de 180 min de reação.

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Tabela 2 – Atividade antioxidante de extratos carotenogênicos das leveduras estudadas pelo método do DPPH (% inibição.µg^-1) indicam diferença significativa. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p<0,05). *YM: Meio extrato de malte e levedura, M1: glicerol + água de maceração de milho; M2: melaço + água de maceração de milho

Alguns carotenoides não são capazes de inibir o radical livre DPPH, como mostra o estudo realizado por Müller, Fröhlich & Böhm (2011), onde os carotenoides obtidos dos sucos de tomate e cenoura, e óleos de girassol, oliva e nozes, não foram capazes de sequestrar este radical livre. Logo, a atividade antioxidante não está relacionada apenas a concentração de carotenoides, e sim ao tipo de carotenoide extraído.

Foi testada a interação com outro radical, o ABTS, os valores estão demonstrados na Tabela 3. Os extratos carotenogênicos apresentaram mecanismo de inibição compatível com o potencial de oxirredução do ABTS, sendo as máximas atividades antioxidantes demonstradas novamente pelo extrato proveniente do cultivo da P. fermentans, com destaque para o M2 e YM. Este método apresentou valores superiores ao DPPH, mesmo comportamento observado por Prasad et al (2011) que estudaram a capacidade antioxidante de carotenoides do fruto Canarium odontophyllum Miq. Estes foram extraídos da casca, polpa e semente e avaliados os métodos ABTS e DPPH, foram encontrados valores superiores para a interação com o radical ABTS, com 84,5% de inibição para os carotenoides da casca, e 44,5 e 18,3%

de inibição para os da polpa e semente, respectivamente, na concentração de 40 μg/mL. Para o método do DPPH eles obtiveram 30,5; 24,6 e 17,2% para polpa, casca e semente na mesma concentração anterior. Considerando a concentração adicionada em cada experimento, foram convertidos os valores para % inibição.μg^-1 de carotenoides, obtendo para o método ABTS: 21,1; 11,1 e 4,6 para casca, polpa e

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semente, respectivamente. Enquanto para o DPPH: 7,6; 6,1 e 4,3 % inibição.µg^-1 para polpa, casca e semente, respectivamente.

Tabela 3 – Atividade antioxidante de extratos carotenogênicos das leveduras estudadas pelo método do ABTS (% inibição.µg^-1)

Tempo (min) YM M1 M2

R.

mucilaginosa

15 21,6±3,6^cB 12,9±4,0^dB 43,0±5,8^bA 30 24,4±2,6^bcB 25,2±4,0^cB 49,8±5,1^abA 45 26,3±1,2^abcC 36,3±2,8^bB 55,8±4,5^abA 60 27,8±1,1^abC 94,1±3,4^aA 58,7±6,5^aB 75 29,4±1,6^aC 102,3±4,0^aA 61,3±7,4^aB

P. fermentans

15 117,1±1,8^eB 15,8±0,1^eC 261,0±22,3^aA 30 177,9±1,8^dB 20,6±0,4^dC 278,0±18,6^aA 45 220,0±4,4^cB 25,7±0,3^cC 288,1±12,4^aA 60 260,5±11,7^bB 29,3±0,1^bC 290,4±9,1^aA 75 293,5±16,7^aA 31,4±0,5^aB 293,1±3,8^aA

S. pararoseus

15 3,6±1,9^eB 6,6±1,3^dA 5,3±0,8^dA 30 17,6±0,5^dA 13,6±1,9^cdB 9,8±0,4^cdC 45 35,7±2,3^cA 21,0±3,1^bcB 15,0±1,8^bcB 60 52,9±2,8^bA 28,2±4,8^abB 19,7±2,7^abC 75 59,6±1,6^aA 32,0±6,0^aB 22,2±4,1^aB

*média ± desvio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna, para cada levedura, indicam diferença significativa. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p<0,05). *YM: Meio extrato de malte e levedura, M1: glicerol + água de maceração de milho; M2: melaço + água de maceração de milho

A Figuras 1 mostra a capacidade dos extratos carotenogênicos em reduzir o ferro, dado pelos valores de absorvância, admitindo que maiores valores de absorvância resultem em o maior potencial de redução.

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Figura 1 - Absorvância dos extratos carotenogênicos obtidos pelas biomassas de S.pararoseus (a), P. fermentans (b) e R. mucilaginosa (c) pelo método FRAP.

YM, M1; M2

Com relação a S. pararoseus (Figura 1a), o extrato que apresentou superior atividade de reduzir o ferro, foi o produzido a partir do meio YM. E os meios utilizando os coprodutos agroindustriais, nesse caso, resultaram em 50% da atividade do meio YM. O extrato proveniente do cultivo da P. fermentans (Figura 1b) no meio M2 novamente se destacou com relação a atividade antioxidante, com valor final superior a 1,0. Já os extratos provenientes dos meios alternativos não provocaram alterações no meio reacional.

Os extratos da R. mucilaginosa (Figura 1c) apresentaram capacidade inferior aos extratos das demais leveduras. Logo, os carotenoides extraídos não possibilitaram a redução do ferro, nas condições estudadas, apresentando absorvâncias inferiores a 0,4.

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O papel dos antioxidantes na dieta ajuda a combater os radicais livres em excesso em nosso corpo. Ao fazê-los, os antioxidantes são sacrificados para proteger as biomoléculas de serem oxidadas, e assim o antioxidante terá cumprido sua função.

(HUANG, OU & PRIOR, 2005). É de fundamental importância estabelecer uma relação entre os níveis de antioxidantes potentes e o nível de estresse oxidativo Cabe salientar que os métodos analisados neste trabalho são de caráter in vitro, necessitando de análises in situ para que estes carotenoides possam ser produzidos e incorporados eficazmente à dieta, sem que haja danos aos tecidos biológicos.

4. Conclusão

As leveduras estudadas apresentaram atividade antioxidante. R. mucilaginosa apresentou uma quantificação de carotenoides totais de 1068,5 μg.L^-1 em YM, superior aos demais meios e leveduras estudados. Com relação aos meios alternativos, a levedura S. pararoseus se destacou, com 634,5 e 830,3 μg.L^-1 para o meio M1 e M2, respectivamente. O extrato proveniente da levedura P. fermentans em meio M2 se mostrou mais promissor com relação a atividade antioxidante pelos métodos estudados com valores de 129,6 e 293,1 % inibição.µg^-1 para DPPH e ABTS, respectivamente, e valores superiores a 1,0 de absorvância pelo método FRAP.

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Artigo 4

Carotenoides produzidos pelas leveduras Phaffia rhodozyma, Pichia fermentans, Rhodotorula mucilaginosa e Sporidiobolus pararoseus em coprodutos de

agroindústrias de alimentos

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Carotenoides produzidos pelas leveduras Phaffia rhodozyma, Pichia fermentans,

Rhodotorula mucilaginosa e Sporidiobolus pararoseus em coprodutos de agroindústrias de alimentos

CIPOLATTI, E.P.; FURLONG, E.B.; BURKERT, J.F.M.

Resumo

O objetivo deste trabalho foi iniciar uma metodologia de identificação e quantificação de carotenoides em extratos provenientes de cultivos submersos com Sporidiobolus pararoseus, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia fermentans e Phaffia rhodozyma nos meios alternativos: M1 (glicerol (4,8 g.L^-1) + água de maceração de milho (35,6 g.L^-1)) e M2 (melaço (6,0 g.L^-1)+ água de maceração de milho (36,5 g.L^-1)) e no meio convencional YM (g.L^-1): 3 de extrato de levedura, 3 de extrato de malte, 5 de peptona, 10 de glicose, a 25ºC, 180 rpm em 168 h de cultivo. A biomassa foi seca a 35ºC e padronizada a 125 mm.A ruptura celular foi realizada com dimetilsulfóxido, e extração com acetona, seguida por adição de NaCl (20%) (p/v) e éter de petróleo, e filtrado em sulfato de sódio anidro, e quantificado a 474 nm. O extrato carotenogênico para análise em CLAE-UV foi saponificado e concentrado em rotaevaporador a 35ºC, ressuspendido em acetonitrila:metanol (70:30, v/v), e os carotenoides foram separados em coluna de C18, eluidos por gradiente de eluição. A fase móvel foi constituída por acetonitrila e metanol, e determinados a 450 nm, tendo uma curva padrão para estimativa de cada carotenoide. O conteúdo de carotenoides totais nos extratos variaram de acordo com o meio e levedura utilizados, para R. mucilaginosa e P.

rhodozyma o meio mais promissor foi o YM com 1068,5 e 940,8 µg.L^-1, respectivamente . Para S. pararoseus foi o M2 (830,3 µg.L^-1) e para P. fermentans, o M1 (201,6 µg.L^-1). As leveduras estudadas foram capazes de sintetizar carotenoides com importantes funções biológicas, como precursores de vitamina A e antioxidantes.

P. rhodozyma se destacou pela produção de astaxantina em meio contendo água de maceração de milho e melaço (M2) (3390 μg.L^-1), correspondendo a 75 % dos carotenoides identificados neste meio. Também apresentou elevada quantificação de β-caroteno (1133 μg.L^-1). A maior produção de luteína foi obtida pela levedura S.

pararoseus, com máximo no meio contendo água de maceração de milho e glicerol (M1) (93 μg.L^-1).O carotenoide β-caroteno foi produzido em maior quantidade pela R.

mucilaginosa em meio YM (4430 μg.L^-1). Nos meios alternativos, esta levedura também foi capaz de sintetizar β-caroteno, 820 e 750 μg.L^-1 para M1 e M2, respectivamente. P. fermentans, nos meios alternativos, foi capaz de sintetizar astaxantina, 317 e 366 μg.L^-1 para o meio M1 e M2, respectivamente, o que não ocorreu no meio YM. O método validado apresentou linearidade entre 0,1 e 7 μg.mL^-1 para astaxantina e β-caroteno, e entre 0,05 e 6 μg.mL^-1 para luteína, com boa precisão e repetitividade.

Palavras chave: leveduras, cromatografia, extrato carotenogênico

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Abstract

The aimed of this study was to initiate to identification and quantification carotenoids in extracts from submerged cultures with Sporidiobolus pararoseus, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia fermentans and Phaffia rhodozyma the alternative medium:

M1((glycerol (4.8 g.L^-1) and corn steep liquor (35.6 g.L^-1)) and M2 (molasses (6.0 g.L^-1) and corn steep liquor (36.5 g.L^-1)) and the standard medium YM (g.L^-1): 3 yeast extract, 3 malt extract, 5 peptone, 10 glucose, at 25ºC, 180 rpm in 168 h of culture. The biomass was dried at 35ºC and standardized at 125 mm. The cell disruptiom is conducted with dimethylsulfoxide and extraction with acetone, followed by addition of NaCl (20 %) (w/v) and petroleum ether and filtered through anhydrous sodium, and quantified at 474 nm. The carotenogenic extract to HPLC-UV analysis was saponified and concentrated in rota evaporador at 35ºC, resuspended in acetonitrile:methanol (70:30, v/v), and the carotenoids were separated in C18 column, eluted by gradient elution. The mobile phase consisted of acetonitrile and methanol, and determined at 450 nm with a standard curve for each estimate of carotenoid. The total content of carotenoids in the extracts ranged according to the medium and yeast used, for R.

mucilaginosa and P. rhodozyma the most promising was the YM with 1068.5 and 960.8 µg.L^-1, respectively. For the S. pararoseus was the M2 (830.3 µg.L^-1), and for P.

fermentans, the M1 (201.6 µg.L^-1). The yeasts studied were capable of synthesizing carotenoids with importante biological functions, as precursors of vitamin A and antioxidants. P. rhodozyma was the largest producer of astaxanthin in a medium with corn steep liquor an molasses (M2) (3390 μg.L^-1), corresponding to 75 % of the identified carotenoids in this medium. Also showed high quantification of β-carotene (1133 μg.L^-1). The highest yield of lutein was obtained by the yeast S. pararoseus, with a maximum in the medium containing corn steep liquor and glycerol (M1) (93 μg.L^-1).

The carotenoid β-carotene was produced in greater quantity by R. mucilaginosa in YM medium (4430 μg.L^-1). In the alternative medium, this yeast was capable of synthesizing β-carotene, 820 and 750 μg.L^-1 for the M1 and M2, respectively. P.

fermentans, in the alternative medium, was able to synthesize astaxanthin, 317 and 366 μg.L^-1 for M1 and M2, respectively, did not occur in YM medium. The validated method was linear between 0.1 and 7 μg.mL^-1 for β-carotene and astaxanthin, and between 0.05 and 6 μg.mL^-1 for lutein, with good precision and repeatability.

Keywords: yeasts, chromatography, carotenogenic extract

102

1. Introdução

Carotenoides são amplamente utilizados na indústria, devido a sua atividade pró-vitamínica A e as propriedades antioxidantes, que resultam em benefícios para a saúde, tais como o fortalecimento do sistema imunológico e a diminuição do risco de doenças degenerativas, como certos tipos de câncer, doenças cardiovasculares, degeneração macular e catarata (VALDUGA et al, 2009; ).

A produção biotecnológica de carotenoides para a aplicação industrial, através de micro-organismos tem sido assunto de destaque nos últimos anos, pois a grande maioria dos carotenoides utilizados industrialmente é obtida por via química ou por extração de plantas e algas (TATSCH, 2008; VALDUGA, 2005). No entanto, considerando que alguns compostos secundários resultantes de processos químicos podem ter efeitos colaterais indesejáveis ao serem consumidos (FRENGOVA &

BESHKOVA, 2009), há um aumento na demanda por carotenoides obtidos naturalmente por processos biotecnológicos.

Considerando que os extratos carotenogênicos de origem microbiana ainda são pouco conhecidos quanto a seus diferentes tipos químicos, é fundamental avaliar o perfil destes para melhor estabelecer suas aplicações industriais, nutricionais e funcionalidades. Nem sempre um elevado conteúdo de carotenoides totais garante a satisfação dos níveis de precursores de vitamina A, além disso, determinados benefícios à saúde se devem a um tipo específico de estrutura, bem como a estabilidade frente a processos oxidativos. Para determinar carotenoides a partir de outras fontes convencionais, os métodos de cromatografia líquida de fase reversa tem se mostrado promissores. No entanto, a aplicação destes requer uma prévia avaliação dos indicativos de eficiência do processo cromatográfico

Dentre deste contexto, este trabalho teve como objetivo iniciar o estudo de identificação e quantificação de carotenoides em extratos provenientes de cultivos submersos com S. pararoseus, R. mucilaginosa,S. pararoseus e Phaffia rhodozyma em meio convencional (YM) e em meios contendo resíduos de agroindústrias, bem como a validação do método cromatográfico utilizado.

2. Material e métodos

No documento Obtenção de carotenoides microbianos com atividade antioxidante a partir de coprodutos agroindustriais (páginas 91-102)