Atividade do complexo II

A atividade do complexo II foi medida pelo método descrito por Fischer e colaboradores156_{, pela diminuição da absorbância do 2,6-dicloroindofenol em 600} nm. A técnica procede da seguinte forma: Uma alíquota da amostra foi adicionada em um tubo do tipo eppendorf junto com tampão fosfato de potássio (K2HPO4 62,5 mM), Succinato de sódio 250 mM e 2,6-dicloroindofenol 0,5 mM. Após 20 minutos em banho maria 30ºC, foi adicionado à essa mistura uma alíquota de azida sódica 100 mM, rotenona 2 mM e DCIP 0,5 mM, seguido da leitura no espectrofotômetro durante 5 minutos. Os resultados foram expressos em nmol/min x mg de proteína.

3.3.4.3 Atividade do complexo IV

A atividade do complexo IV foi determinada de acordo com a técnica descrita por Rustin e colaboradores157_{. Primeiramente, a amostra passa por uma diluição em} tampão SETH. Em seguida, uma alíquota dessa amostra diluída é misturada a 5 ml de Lauril maltosídeo 125 mM e 70 ml Citocromo C 1%. A atividade do complexo IV é calculada pela diminuição da absorbância causada pela oxidação do citocromo c reduzido, medido em 550 nm. Os resultados foram expressos em nmol/min x mg de proteína.

3.3.4.4 Atividade da CK

O meio de incubação para dosagem da CK foi composto por fosfocreatina e ADP, conforme previamente descrito por Hughes158_{. A técnica baseia-se na} capacidade da CK presente na amostra cerebral quebrar a fosfocreatina adicionada à solução, gerando ATP. A formação de creatina foi medida espectrofotometricamente em 540 nm. Os resultados foram expressos em nmol/min x mg de proteína.

3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada com auxílio do programa estatístico GraphPad Prism®, versão 6.01. As análises foram determinadas pelo Teste t Student, o qual comparou o grupo controle com o grupo obeso. A significância estatística foi considerada para valores de p<0,05.

3.5 ASPECTOS ÉTICOS

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Sul de Santa Catarina, sob os seguintes protocolos: 15.002.4.01.IV. (Anexo A), 15.001.4.01.IV. (Anexo B) e 15.005.4.01.IV. (Anexo C). Além disso, a utilização dos animais seguiu a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos (DBCA)159_{, aprovada por} meio da Portaria do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) nº 465 (23/05/2013).

4. RESULTADOS

No presente estudo, os animais foram induzidos à obesidade por meio do consumo de uma dieta rica em lipídios, por um período de dez semanas. Pode-se observar que os animais representantes do grupo obeso tiveram maior consumo de calorias que os animais do grupo controle (Figura 12), o que esteve relacionado com o aumento nos níveis de adiposidade.

C o n s u m o a li m e n ta r (K c a l) C o n t r o l e O b e s o 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

*

Figura 12 – Avaliação da ingestão diária de calorias (Kcal) obtdas pelo consumo de ração normolipídica e hiperlipídica pelos camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Média (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

A fim de validar o modelo da doença nos animais, foi realizado uma comparação da média do peso corporal do grupo controle com o grupo obeso. Pode- se observar que houve diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos, sendo que os animais do grupo obeso apresentaram maior peso corporal (Figura 13).

Figura 13 - Efeito do consumo de dieta hiperlipídica sobre o ganho de peso corporal de camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Média (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

Além disso, foi avaliado o peso da gordura visceral, o qual incluiu a soma da gordura epididimal, gordura mesentérica e gordura retroperitoneal. Os resultados mostram que, quando avaliado isoladamente, não houve diferença estatisticamente significativa na gordura epididimal e retroperitoneal entre os animais do grupo controle e grupo obeso. Por outro lado, os animais do grupo obeso apresentaram maior massa de gordura mesentérica que o grupo controle. Quando comparado a massa de gordura visceral dos dois grupos, pode-se observar que o grupo obeso apresentou maior peso de gordura visceral que o grupo controle (Figura 14), validando dessa forma o modelo animal de obesidade.

G o rd u ra v is c e ra l (g ra m a s ) Go rdu ra v isc era l Go rdu ra m es en téri ca Go rdu ra e pid idim al Go rdu ra r etr op eri ton ea l 0 2 4 6 C o n tr o le O b e s o

*

*

Figura 14 - Efeito do consumo de dieta hiperlipídica sobre a massa de gordura visceral de camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Média (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

O hipotálamo dos animais foi utilizado para a avaliação de parâmetros inflamatórios, de estresse oxidativo e de metabolismo energético. Quanto aos parâmetros inflamatórios, os dados mostram que os animais do grupo obeso tiveram aumento nos níveis de IL-1β e diminuição nos níveis de IL-10 no hipotálamo, quando comparado ao grupo controle (Figura 15).

Figura 15 - Efeito da obesidade sobre a expressão da citocina IL-1β (A) e citocina anti-inflamatória IL-10 (B) no hipotálamo de camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Média (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

Os resultados referentes aos parâmetros de estresse oxidativo mostraram que os animais do grupo obeso tiveram maior dano oxidativo no hipotálamo que os animais do grupo controle. Isso pode ser observado tanto pela maior peroxidação de lipídios (MDA) quanto pela maior carbonilação de proteínas no hipotálamo dos animais do grupo obeso (Figura 16).

Figura 16 - Efeito da obesidade sobre a peroxidação lipídica - MDA (A) e carbonilação de proteínas (B) no hipotálamo de camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Média (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

Além disso, pode-se observar que os animais alimentados com dieta hiperlipídica mostraram diminuição significativa nos níveis de GSH no hipotálamo, quando comparado ao grupo controle (Figura 17). Em contrapartida, não houve diferença estatisticamente significativa na atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT no hipotálamo dos camundongos entre os grupos controle e obeso (Figura 18). N ív e is d e g lu ta ti o n a r e d u z id a (u M o ls d e G S H / m g d e p ro te ín a s ) C o n t r o le O b e s o 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0

*

Figura 17 - Efeito da obesidade sobre os níveis de GSH no hipotálamo de camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Média (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

Figura 18 - Efeito da obesidade sobre a atividade da enzima SOD (A) e CAT (B) no hipotálamo de camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Media (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

Por fim, foi avaliado o efeito da obesidade sobre o metabolismo energético no hipotálamo dos camundongos. Os animais alimentados com dieta hiperlipídica mostraram inibição da atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial no hipotálamo. Além disso, os animais do grupo obeso também tiveram diminuição da atividade da CK no hipotálamo, quando comparado ao grupo controle (Figura 19).

Figura 19 - Efeito da obesidade sobre a atividade do Complexo I (A), Complexo II (B) e Complexo IV (C) da cadeia respiratória mitocondrial e atividade da CK (D) no hipotálamo de camundongos. Os dados foram expressos como média ± Erro Padrão da Media (n=5). *Diferente do grupo controle; p<0,05.

5. DISCUSSÃO

Muitos estudos vêm demonstrando que a obesidade está relacionada com o desenvolvimento de diversas comorbidades2,3,15_{, o que reflete no aumento da} mortalidade e piora da qualidade de vida das pessoas1,2_{. Em vista disso, há um} crescente interesse na busca pela compreensão dos aspectos fisiopatológicos dessa doença39-41_.

A fim de investigar a influência da obesidade sobre parâmetros inflamatórios e bioquímicos no hipotálamo de camundongos, o presente estudo fez uso de um modelo animal de obesidade. A ração hiperlipídica forneceu um grande aporte de calorias aos animais do grupo obeso. Após 3 semanas consumindo essa dieta com alto teor de lipídios, os animais já apresentaram maior peso corporal que os animais representantes do grupo controle. A diferença estatística se manteve até o término do experimento.

Além da diferença no peso corporal entre os animais do grupo controle e grupo obeso, no presente estudo, os animais obesos também apresentaram maior massa de gordura mesentérica. Um perfil semelhante foi descrito por Ma e colaboradores30_{, onde o tratamento com elevado teor de gordura saturada (40%) por} 10 semanas provocou rápido ganho de peso corporal e acúmulo de gordura (epididimal, perirenal e omental) em ratos.

Lipídios de cadeia saturada estão relacionados com o excesso de adiposidade160_{. Esse tipo de gordura, comumente encontrada em carnes vermelhas,} carne suína, derivados do leite e comidas processadas, podem desempenhar um efeito imediato sobre os marcadores inflamatórios na circulação161_{, estando} relacionado com a resistência à insulina e desregulação de enzimas metabólicas162_. Com base nisso, diversos autores utilizam dieta rica em gordura saturada para induzir obesidade em roedores16,19,134,160_.

O presente trabalho buscou estudar a influência do consumo de uma dieta hiperlipídica (52,4% de calorias provenientes de gordura saturada) sobre três diferentes parâmetros neuroquímicos no hipotálamo de camundongos. Os dados encontrados apontam que a obesidade dos animais refletiu na instalação de um quadro inflamatório, aliado ao aumento do dano oxidativo e disfunção mitocondrial no hipotálamo.

Os animais do grupo obeso mostraram diminuição nos níveis de IL-10 no hipotálamo, quando comparado aos animais alimentados com dieta normolipídica. Esse achado vai ao encontro da literatura, visto que em estudo conduzido por Wang e colaboradores160_{, também houve diminuição na expressão de IL-10 no hipotálamo} dos animais obesos (dieta com 50% de gordura saturada). Além disso, Van de Sande-Lee e colaboradores163 _{mostraram aumento significativo nos níveis de IL-10} no líquor de indivíduos obesos, após perda de peso devido à cirurgia bariátrica. Ainda, eles relataram que o aumento da IL-10 foi acompanhado por alterações nos padrões de ressonância magnética, especialmente no hipotálamo.

No presente estudo, também foi observado que os animais do grupo obeso mostraram maior expressão de IL-1β no hipotálamo. A IL-1β é uma citocina envolvida no processo inflamatório, ela medeia a regulação positiva de muitas citocinas inflamatórias, tais como TNF-α, por meio da sinalização do receptor de IL- 1β, seguido da ativação da via fator nuclear kappa B (NF-kB – do inglês nuclear factor-kappaB)164_{. Estudo conduzido por De Souza e colaboradores}165 _{mostrou que} ratos alimentados com uma dieta hiperlipídica (45% de calorias provenientes de lipídio) por 16 semanas, apresentaram aumento significativo na expressão de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1β, bem como proteínas de resposta inflamatória no hipotálamo. Moraes e colaboradores134 _{encontraram resultados} semelhantes, porém a indução da obesidade teve uma duração de 8 semanas e a ração hiperlipídica foi composta por 36% de gordura saturada. Os resultados desse estudo mostraram aumento na expressão das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-6, aumento de proteínas envolvidas na resposta inflamatória, presença de marcadores de ativação de células gliais, bem como a presença de marcadores apoptóticos no hipotálamo134_{. Apesar das diferenças metodológicas, diversos estudos convergem à}

mesma conclusão: a obesidade cursa com inflamação

hipotalâmica16,19,134,145,160,166,167_.

Por outro lado, as evidências disponíveis até o momento não mostram com clareza em que momento os parâmetros inflamatórios no hipotálamo são alterados. A inflamação sistêmica promoveria a inflamação no hipotálamo ou um insulto inicial no hipotálamo levaria ao comprometimento do controle alimentar com consequente acúmulo de gordura? A este respeito, Thaler e colaboradores16 _{mostraram que os} animais submetidos ao consumo de uma dieta rica em gordura (60% de calorias provenientes de lipídio), não apresentaram a expressão de genes de citocinas

inflamatórias no fígado e tecido adiposo antes das 4 semanas de indução de obesidade. Em contrapartida, a inflamação no hipotálamo ficou claramente evidente após os 3 primeiros dias de consumo da dieta. Assim, eles sugerem que o efeito do consumo de uma dieta rica em gordura influencia primeiramente o hipotálamo, seguido da inflamação sistêmica, a qual pode levar semanas10,16_{. No presente} estudo, é possível afirmar que a obesidade cursou com a presença de inflamação hipotalâmica, no entanto, não é possível sugerir quando essa desregulação teve início.

Conforme já demonstrado na literatura, uma dieta rica em gordura pode comprometer a BHE132_{, facilitando a entrada de células imunes no SNC}26_{, inclusive,} ácidos graxos de cadeia saturada podem dar início a uma inflamação no hipotálamo19_{. Nesse sentido, destaca-se que tanto uma alimentação rica em gordura} quanto as alterações periféricas provenientes do acúmulo de gordura corporal estão associadas com a ativação da micróglia22,167 _{e que a expressão dessas citocinas} ocorre predominantemente nesses tipos celulares135_{. Em artigo de revisão}168_{, os} autores ressaltam que a ativação da via de NF-kB pelo TNF-α, em células da glia, é um fenômeno chave para os efeitos prejudiciais dessa citocina. Vale destacar que todos esses mecanismos, incluindo infiltração de leucócitos e ácidos graxos livres no SNC, bem como ativação celular no SNC, contribuem para a produção de ERO167_, com consequente dano oxidativo108_.

Os dados do presente estudo indicam que os animais do grupo obeso tiveram maior dano oxidativo no hipotálamo, tanto em proteínas quanto em lipídios, que os animais do grupo controle. Alguns aspectos contribuem para vulnerabilidade do cérebro ao dano oxidativo: (1) alta taxa metabólica e consumo de oxigênio, (2) altos níveis de ácidos graxos poli-insaturados que podem ser facilmente oxidáveis e (3) elevado teor de metais no SNC, permitindo a geração ERO por meio da reação Fenton83_.

O aumento de compostos oxidantes no cérebro é de grande preocupação, visto que a exposição crônica à ERO no cérebro pode causar grande dano nas membranas celulares, levando a perda da integridade e viabilidade celular169,170_{. Há} poucos estudos mostrando a influência do consumo de gorduras saturadas no hipotálamo, por outro lado, diversos estudos relacionam o consumo de uma dieta rica em gordura com danos no hipocampo e associam isso ao déficit de memória e danos cognitivos140,171-173_.

Em contraste à grande produção de ERO, o SNC dispõe de baixos níveis de enzimas antioxidantes, comparado à outros órgãos (baixa atividade de CAT e SOD e moderada atividade da GPx)139_{. No presente estudo, a obesidade não causou} alteração na atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT no hipotálamo dos animais. No entanto, os animais obesos apresentaram menores níveis de GSH no hipotálamo. Freeman e colaboradores140 _{também avaliaram a influência do consumo} de dieta rica em gordura (60% de calorias provenientes de lipídios) sobre a defesa antioxidante no cérebro e observaram que não houve alteração na atividade das enzimas SOD e CAT no hipocampo e córtex pré-frontal, já a GPx mostrou diminuição da sua atividade no córtex cerebral.

Vale lembrar que a GSH é usada como substrato pela GPx, na eliminação do H2O2, além de atuar na detoxificação de aldeídos reativos (como o MDA) que são gerados durante a peroxidação lipídica90_{. Portanto, a manutenção da atividade da} GPx e níveis adequados de GSH são de fundamental importância para evitar danos oxidativos92_{. A ação da GSH é ainda mais relevante na mitocôndria, visto a grande} produção de ERO que ocorre nesse local92_{. A este respeito, evidências mostram que} a depleção da GSH mitocondrial contribui para a susceptibilidade ao estresse oxidativo92_{. Wullner e colaboradores}174 _{mostraram que em neurônios do cerebelo, a} depleção de GSH mitocondrial e citoplasmática resultou num aumento da geração de ERO, bem como o comprometimento da função mitocondrial174_{. Essas} informações são consistentes com os nossos resultados, visto que os animais obesos apresentaram depleção nos níveis de GSH em conjunto com a menor atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial.

Está bem descrito na literatura que as mitocôndrias desempenham um papel central no metabolismo energético, sendo que sua principal função é converter os macronutrientes, provenientes da dieta, em ATP67_{. Nesse sentido, pode-se afirmar} que o adequado desempenho mitocondrial é de vital importância para as células68_. Apesar dessa grande relevância do metabolismo energético para as células, poucos estudos têm investigado essa questão no hipotálamo. Já foi observado que a alimentação rica em gordura está relacionada com a disfunção mitocondrial em neurônios hipotalâmicos, conduzindo a diminuição da sensibilidade aos níveis de glicose175_.

Demais estudos tem mostrado o efeito da dieta hiperlipídica sobre outras áreas cerebrais ou mesmo cérebro completo (sem divisão). Por exemplo, Ma e

colaboradores30 _{induziram obesidade em ratos, por meio do consumo de uma dieta} hiperlipídica (40% de calorias provenientes de lipídios), também por um período de 10 semanas, e identificaram elevada produção de ERO e disfunção mitocondrial no tecido cerebral desses animais. A disfunção mitocondrial no cérebro tem sido associada com doenças neurodegenerativas, como a doença de alzheimer29,133,173_. Além disso, foi descrito que a produção de ATP, evidenciada pela cadeia respiratória mitocondrial e CK, foi significativamente menor no músculo esquelético de participantes obesos e diabéticos, quando comparado com participantes magros176_. No presente estudo, também houve diminuição da atividade da CK no grupo dos animais obesos, sugerindo que esses animais tiveram diminuição na produção de ATP no hipotálamo.

Vale destacar que inadequada produção de ATP pelas mitocôndrias também desempenha importante papel na progressão da obesidade. Níveis diminuídos de ATP podem ativar a ação da enzima AMPK28 _{e já foi observado que altas} concentrações de AMPK no hipotálamo contribui para o aumento da expressão dos neuropeptídios NPY e AgRP, estimulando dessa forma, a hiperfagia e o ganho de

peso62,177_{. A leptina atua inibindo a ação da AMPK no hipotálamo}62_{. Nesse sentido,}

autores ressaltam que o comprometimento na produção de ATP pela cadeia respiratória mitocondrial levaria a contínua estimulação de AMPK no hipotálamo, requerendo níveis elevados de leptina para suprimir o efeito dessa enzima sobre a expressão dos neuropeptídios NPY e AgRP62,177_{. De fato, indivíduos obesos} apresentam níveis séricos aumentados de leptina, no entanto, não há resposta esperada de diminuição de apetite97,161_{. Com base nisso, sugere-se que a disfunção} mitocondrial, a qual cursa com diminuição de ATP, levaria o indivíduo a ingerir mais alimentos do que o necessário, conduzindo ao armazenamento de gordura e progressão da obesidade.

Tomados em conjunto, todas essas informações indicam que a inflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial compreendem um complexo mecanismo que se retroalimentam e que culminam em dano celular. A figura 20 esquematiza a ligação entre esses processos, sugerindo como acontece a progressão da obesidade.

Figura 20 - A integração entre alterações inflamatórias e metabólicas dos tecidos periféricos com o SNC convergem na perda do controle alimentar. BHE – barreira hematoencefálica; SNC – sistema nervoso central; ATP – adenosina trifosfato; ERO – espécie reativa de oxigênio.

O consumo de uma dieta com alto teor de lipídios afeta tanto os tecidos periféricos (dados da literatura) quanto o hipotálamo (dados mostrados). Segundo Thaler e colaboradoes10_{, possivelmente o hipotálamo recebe inicialmente um insulto} (por ácido graxo de cadeia saturada) e inicia um processo inflamatório local. A inflamação cursa com a liberação de citocinas pró-inflamatórias18,19 _{e ERO}30_{. As} EROs são conhecidas por afetar negativamente as membranas celulares, proteínas e DNA83_{, nesse contexto, as mitocôndrias são altamente susceptíveis ao dano} oxidativo. O comprometimento da cadeia respiratória mitocondrial leva a diminuição na produção de ATP em conjunto com o aumento na produção de ERO pela própria cadeia respiratória mitocondrial120,121_{. O resultado disso é um ciclo que se repete,} contribuindo também para o aumento da inflamação local. Nesse contexto, a integração entre esses três processos pode causar dano celular no hipotálamo, levando à perda da sensibilidade no controle alimentar e acúmulo de gordura corporal17,166_.

Os tecidos periféricos, especialmente o tecido adiposo, também sofrem alterações devido ao excesso de alimento. Dentre elas, destacam-se a presença de parâmetros inflamatórios98,99,102_{, parâmetros de estresse oxidativo}31,109-113 _e disfunção mitocondrial14,122,123_{. É sabido que alterações inflamatórias nos tecidos} periféricos podem comprometer a BHE e isso já foi visto na obesidade26,132_{. Como} consequência, há infiltração de células imunes no SNC26_{, acarretando na produção} de citocinas pró-inflamatórias e ERO nesse local. Além disso, células imunes residentes do SNC (micróglias) respondem a todas essas alterações, levando a progressão da inflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial. Sendo assim, sugere-se que a consequência das modificações dos tecidos periféricos é a progressão do dano no hipotálamo, bem como em outras áreas cerebrais.

É importante salientar que o desenvolvimento da obesidade é multifatorial1_, não dependendo exclusivamente do desbalanço entre as calorias ingeridas e gasto de energia. No entanto, pode-se sugerir que o efeito da alimentação sobre o hipotálamo exerce papel central no desenvolvimento e progressão da obesidade.

6. CONCLUSÃO

A partir dos resultados do presente estudo, pode-se concluir a obesidade cursou com a presença de processo inflamatório, presença de estresse oxidativo e