EFEITO DA OBESIDADE SOBRE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E BIOQUÍMICOS NO HIPOTÁLAMO DE CAMUNDONGOS
TUBARÃO 2016
ROSIANE DE BONA SCHRAIBER
EFEITO DA OBESIDADE SOBRE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E BIOQUÍMICOS NO HIPOTÁLAMO DE CAMUNDONGOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Profa. Gislaine Tezza Rezin, Dra.
TUBARÃO 2016
ROSIANE DE BONA SCHRAIBER
EFEITO DA OBESIDADE SOBRE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E BIOQUÍMICOS NO HIPOTÁLAMO DE CAMUNDONGOS
Esta Dissertação foi julgada adequada pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde - Mestrado, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Tubarão, 24 de junho de 2016.
Orientador: Profa. Gislaine Tezza Rezin, Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina
Profa. Éria Cardoso, Dra.
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Santa Catarina
Prof. Luiz Alberto Kanis, Dr. Universidade do Sul de Santa Catarina
Dedico este trabalho à minha família, pelo cuidado e apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS
Sou imensamente grata à todas as pessoas que auxiliaram na construção deste trabalho.
À Profa. Gislaine Tezza Rezin, pela confiança e orientação.
À Profa. Dayani Galato, por me guiar em meus primeiros passos na vida acadêmica. Obrigada pelos ensinamentos, conselhos, dedicação e oportunidades.
À Profa. Fabricia Petronilho e Prof. Luiz Alberto Kanis, pelas contribuições durante o exame de qualificação.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde/Tubarão, pelos ensinamentos.
Ao grupo de pesquisa NeuroImet (núcleo Sepse) e Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício (UNESC), pelo auxílio nas análises bioquímicas.
Aos colegas do grupo NeuroIMet, pelo apoio e dedicação na execução deste trabalho.
Aos amigos e colegas que conquistei durante esses dois anos de mestrado, bem como àqueles de longa data. Muito obrigada pelo companheirismo, incentivo, amizade e momentos de prazer.
Aos meus familiares, minha eterna gratidão! Muito obrigada pelo apoio, pela compreensão e carinho.
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.” (Albert Einstein)
RESUMO
Introdução: A obesidade é uma doença crônica, cuja fisiopatologia envolve alterações nos tecidos periféricos e no Sistema Nervoso Central (SNC). Nesse contexto, diversos pesquisadores buscam compreender qual a influência do consumo de gordura saturada sobre o hipotálamo, estrutura chave no controle alimentar. Objetivo: Avaliar parâmetros inflamatórios, de estresse oxidativo e de metabolismo energético no hipotálamo de camundongos induzidos a um modelo animal de obesidade. Metodologia: Camundongos Swiss machos foram divididos em dois grupos de estudos: grupo controle e grupo obeso. Os animais do grupo controle foram alimentados com uma dieta com quantidades adequadas de macronutrientes (ração normolipídica), enquanto que os animais do grupo obeso foram induzidos a obesidade por meio do consumo de uma dieta rica em gordura saturada (ração hiperlipídica). A indução da obesidade teve uma duração de 10 semanas, e ao término desse período, o modelo da doença foi validado nos animais. Logo em seguida, os camundongos foram mortos, os tecidos de interesse foram dissecados e encaminhados para as análises bioquímicas. Resultados: Os animais do grupo obeso apresentaram maior consumo de calorias e, aliado a isso, apresentaram maior peso corporal, bem como maior peso de gordura mesentérica que os animais do grupo controle. A obesidade cursou com aumento nos níveis de interleucina 1β (IL-1β) e diminuição dos níveis de interleucina 10 (IL-10) no hipotálamo dos animais. Além disso, houve aumento da peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas, aliada ao menor nível de glutationa (GSH) no hipotálamo dos animais obesos. No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa quanto a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) no hipotálamo de ambos os grupos. O grupo obeso apresentou menor atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial, bem como menor atividade da creatina quinase (CK) no hipotálamo. Conclusão: A obesidade cursou com inflamação, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial no hipotálamo, estrutura chave no controle alimentar.
Descritores: Obesidade. Hipotálamo. Inflamação. Estresse Oxidativo. Metabolismo Energético.
ABSTRACT
Introduction: Obesity is a chronic disease whose pathophysiology involves changes in peripheral tissues and in the central nervous system (CNS). In this context, many researchers seek to understand the influence of saturated fat intake on the hypothalamus, a key structure in the food control. Objective: Assess inflammatory parameters of oxidative stress and energy metabolism in the hypothalamus of mice led to an animal model of obesity. Methodology: Swiss mice were divided into two study groups: control group and obese group. The control animals were fed with a diet with adequate amounts of macronutrients (standard diet), while the animals in the obese group were induced to obesity through the consumption of a diet high in saturated fat (high fat diet). Obesity induction had a duration of 10 weeks, and at the end of this period, the disease model was validated in animals. Shortly thereafter, the mice were euthanized; tissues of interest were dissected and taken for biochemical analysis. Results: Animals in the obese group had higher calorie consumption and, allied to this, had higher body weight and higher weight of mesenteric fat, compared to the control group. Obesity presented an increase in the levels of interleukin 1β (IL-1β) and decreased levels of interleukin 10 (IL-10) in the hypothalamus of animals. In addition, there was increased lipid peroxidation and protein carbonylation, coupled with the lower level of GSH in the hypothalamus of obese animals. However, there was no statistically significant difference in the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in the hypothalamus of both groups. The obese group had lower activity of complex I, II and IV of the mitochondrial respiratory chain, as well as lower activity of creatine kinase (CK) in the hypothalamus. Conclusion: Obesity presented inflammation, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in the hypothalamus, a key structure in the food control.
Keywords: Obesity. Hypothalamus. Inflammation. Oxidative Stress. Energy Metabolism.
LISTAS
Lista de abreviaturas
Acetil coenzima A (acetil-CoA).
ADP – Adenosina difosfato (do inglês adenosine diphosphate)
AgRP – Proteína relacionada ao Agouti (do inglês agouti-related protein) AMP – Adenosina monofosfato (do inglês adenosine monophosphate)
AMPK – Proteína cinase ativada por AMP (do inglês AMP-activated protein kinase) ARC – Núcleo arqueado (do inglês arcuate nucleus)
ATP – Adenosina trifosfato (do inglês adenosine triphosphate) BHE – Barreira hematoencefálica
CART – Transcrito regulado por cocaína e anfetamina (do inglês cocaine and amphetamine-regulated transcript)
CAT – Catalase
CEUA – Comissão de Ética com Uso de Animais CK – Creatina quinase (do inglês creatine kinase)
CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal DBCA – Diretriz brasileira para o cuidado e a utilização de animais DM2 – Diabetes mellitus tipo 2
DMN – Núcleo dorsomedial (do inglês dorsomedial nucleus) ERN – Espécie reativa de nitrogênio
ERO – Espécie reativa de oxigênio FAD – Flavina-adenina-dinucleotídeo GPx – Glutationa peroxidase GrD – Glutationa Redutase GSH – Glutationa reduzida GSSG – Glutationa oxidada IL-1β – Interleucina 1β IL-6 – Interleucina 6 IL-10 – Interleucina 10
IMC – Índice de massa corporal
LHA – Hipotálamo lateral (do inglês lateral hypothalamic area) MDA – Malondialdeído
NAD – Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo
NF-κB - Fator nuclear kappa B (do inglês nuclear factor-kappaB) NPY – Neuropeptídeo Y
OMS – Organização Mundial da Saúde POMC – Pró-opiomelanocortina
PVN – Núcleo paraventricular (do inglês paraventricular nucleus) PYY – Peptídeo YY
RL – Radical livre
SNC – Sistema nervoso central SOD – Superóxido dismutase
TLR – receptor Toll-like (do inglês Toll-like receptor)
TLR4 – Receptores do tipo Toll-like 4 (do inglês Toll-like receptor 4)
TNF-α – fator de necrose tumoral alfa (do inglês Tumor necrosis factor alpha) VMN – Núcleo ventromedial (do inglês Ventromedial nucleus)
Lista de quadros
Quadro 1 - Combinação das medidas de circunferência da cintura e IMC para avaliar
obesidade e risco de desenvolvimento de comorbidades. ... 12
Lista de figuras Figura 1 - Principais áreas do hipotálamo envolvidas no controle alimentar. ... 15
Figura 2 - Fatores que influenciam na ingestão alimentar. ... 16
Figura 3 - Diagrama de uma mitocôndria. ... 19
Figura 4 - Vias metabólicas para formação de ATP. ... 20
Figura 5 - Transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e geração de ATP pela fosforilação oxidativa.. ... 21
Figura 6 - Geração de ATP pela integração da enzima CK mitocondrial e CK citoplasmática.. ... 23
Figura 7 - Geração de ERO pela cadeia respiratória mitocondrial.. ... 25
Figura 8 - Integração dos sistemas de defesa antioxidante enzimático.. ... 26
Figura 9 - Alterações do tecido adiposo na obesidade. ... 29
Figura 11 - Desenho experimental para indução de obesidade e dosagens bioquímicas no hipotálamo dos camundongos... 36 Figura 12 – Avaliação da ingestão diária de calorias (Kcal) obtdas pelo consumo de ração normolipídica e hiperlipídica pelos camundongos.. ... 44 Figura 13 - Efeito do consumo de dieta hiperlipídica sobre o ganho de peso corporal de camundongos. ... 45 Figura 14 - Efeito do consumo de dieta hiperlipídica sobre a massa de gordura visceral de camundongos. ... 46 Figura 15 - Efeito da obesidade sobre a expressão da citocina IL-1β (A) e citocina anti-inflamatória IL-10 (B) no hipotálamo de camundongos. ... 47 Figura 16 - Efeito da obesidade sobre a peroxidação lipídica - MDA (A) e carbonilação de proteínas (B) no hipotálamo de camundongos... 47 Figura 17 - Efeito da obesidade sobre os níveis de GSH no hipotálamo de camundongos. ... 48 Figura 18 - Efeito da obesidade sobre a atividade da enzima SOD (A) e CAT (B) no hipotálamo de camundongos. ... 48 Figura 19 - Efeito da obesidade sobre a atividade do Complexo I (A), Complexo II (B) e Complexo IV (C) da cadeia respiratória mitocondrial e atividade da CK (D) no hipotálamo de camundongos. ... 49 Figura 20 - A integração entre alterações inflamatórias e metabólicas dos tecidos periféricos com o SNC convergem na perda do controle alimentar. ... 55
Lista de tabelas
Tabela 1 - Composição e valor calórico das dietas normolipídica e hiperlipídica, a cada 1000g... 37 Tabela 2 - Percentual de calorias provenientes dos macronutrientes das dietas utilizadas. ... 38
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 9
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO ... 10
1.1.1 Obesidade: conceito e diagnóstico ... 10
1.1.2 Dados epidemiológicos da obesidade ... 12
1.1.3 Fisiopatologia da Obesidade: aspectos fisiológicos e patológicos do balanço energético ... 13
1.1.3.1 Fisiologia do controle alimentar ... 14
1.1.3.1.1 Geração de ATP: cadeia respiratória mitocondrial e creatina quinase ... 18
1.1.3.1.2 Geração de ATP: radicais livres e defesa antioxidante ... 24
1.1.3.2 Alterações fisiológicas encontradas na obesidade ... 28
1.1.3.2.1 SNC e Obesidade... 32 2. OBJETIVOS ... 34 2.1 OBJETIVO GERAL ... 34 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 34 3. MÉTODOS ... 35 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 35 3.2 ANIMAIS ... 35 3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ... 35 3.3.1 Indução da obesidade ... 36
3.3.1.1 Avaliação do consumo alimentar ... 38
3.3.1.2 Avaliação do peso corporal ... 38
3.3.1.3 Avaliação da gordura visceral ... 38
3.3.2 Avaliação dos níveis de citocinas no hipotálamo ... 39
3.3.3 Avaliação do estresse oxidativo no hipotálamo ... 39
3.3.3.1 Avaliação da peroxidação lipídica ... 39
3.3.3.2 Avaliação dos níveis de carbonilação de proteínas ... 39
3.3.3.3 Avaliação da atividade da enzima antioxidante SOD ... 40
3.3.3.4 Avaliação da atividade da enzima antioxidantes CAT ... 40
3.3.3.5 Avaliação dos níveis de Glutationa (GSH) ... 41
3.3.4 Avaliação do metabolismo energético no hipotálamo ... 41
3.3.4.2 Atividade do complexo II ... 42 3.3.4.3 Atividade do complexo IV ... 42 3.3.4.4 Atividade da CK ... 42 3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 43 3.5 ASPECTOS ÉTICOS... 43 4. RESULTADOS ... 44 5. DISCUSSÃO ... 50 6. CONCLUSÃO ... 57 ANEXO ... 72
1. INTRODUÇÃO
A Organização Mundial da Saúde (OMS) define a obesidade como uma doença crônica, cuja principal característica é o acúmulo excessivo de gordura no tecido adiposo1. Esta doença é de origem multifatorial e está relacionada com o desenvolvimento de inúmeras comorbidades, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), dislipidemia, doenças pulmonares, doenças osteoarticulares, alguns tipos de câncer e problemas psicossociais2.
Dados recentes apontam que o percentual de indivíduos obesos ou com sobrepeso é crescente, bem como o índice de morbidade e mortalidade associado a essa doença1, o que compromete a qualidade de vida e longevidade da população3. Além disso, os gastos com saúde relacionados à obesidade são progressivos, exercendo um forte impacto sobre a economia4-6. Portanto, diante dessas consequências, atualmente, a obesidade tem sido descrita como um problema de saúde pública1,7-9.
Apesar da grande relevância da obesidade, a fisiopatologia dessa doença ainda carece de muitos estudos10. Dados apontam que a obesidade cursa tanto com alterações nos tecidos periféricos11,12, quanto no Sistema Nervoso Central (SNC)13. No entanto, ainda não está completamente esclarecido qual desses tecidos é o primeiro a contribuir para o acúmulo excessivo de gordura no tecido adiposo10.
Até o momento, sabe-se que o acúmulo de gordura promove uma série de modificações no tecido adiposo, incluindo a secreção desregulada de adipocinas11, bem como a infiltração e ativação de macrófagos nesse tecido12. Como consequência, há um aumento na expressão de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio (EROs) pelos macrófagos infiltrados13. Além disso, estudos vem mostrando que a obesidade cursa com alterações mitocondriais em tecidos periféricos, em paralelo com a excessiva produção de ERO pelas mitocôndrias14, conduzindo ao desenvolvimento de diversas doenças relacionados aos danos oxidativos15.
Quanto ao SNC, pesquisas mostram que o comprometimento de estruturas alvo, como por exemplo o hipotálamo16-18, pode conduzir à obesidade ao prejudicar o desempenho das funções exercidas por essa estrutura19,20, contribuindo para o acúmulo excessivo de gordura corporal. Foi demonstrado que ácidos graxos
saturados podem ativar receptores específicos no hipotálamo e, consequentemente, induzir um processo inflamatório nesse local19. Nesse contexto, a ativação de macrófagos residentes do SNC (micróglias) desempenham um importante papel na liberação de citocinas pró-inflamatórias21,22, bem como ERO23, culminando em dano celular24,25. Sabe-se também que a perda da integridade da barreira hematoencefálica (BHE) pode influenciar na progressão da obesidade, visto que células imunes dos tecidos periféricos podem ser recrutadas para o SNC e contribuir com o processo inflamatório no hipotálamo26.
Destaca-se que as estruturas cerebrais são dependentes de uma alta demanda energética para exercer suas funções27. Portanto, o adequado suprimento de adenosina trifosfato (ATP, do inglês adenosine triphosphate) pelas mitocôndrias é de vital importância para o bom desempenho celular28. Da mesma forma, a defesa antioxidante no SNC exerce um papel de extrema importância, visto que as mitocôndrias são grandes produtoras de EROs, as quais podem causar dano oxidativo29. A esse respeito, Ma e colaboradores30 identificaram dano oxidativo e disfunção mitocondrial no cérebro (sem divisão de estruturas) e no plasma de ratos induzidos a obesidade. Além disso, Furukawa e colaboradores31 mostraram que a obesidade em camundongos cursou com redução na atividade de enzimas antioxidantes no tecido adiposo.
Tomados em conjunto, esses dados reforçam a necessidade de conhecer o efeito da obesidade sobre o hipotálamo, visto que essa estrutura desempenha papel central no controle do balanço energético32. Sendo assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar parâmetros inflamatórios, parâmetros de estresse oxidativo e o metabolismo energético no hipotálamo de camundongos induzidos a um modelo animal de obesidade.
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1 Obesidade: conceito e diagnóstico
A obesidade é uma doença crônica, caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal1. Sua etiologia é heterogênea, mas sabe-se que a causa fundamental do seu desenvolvimento se dá por um desequilíbrio entre as calorias
consumidas e as calorias gastas, resultando no armazenamento excessivo de gordura no tecido adiposo1.
O seu diagnóstico pode ser realizado a partir de uma variedade de métodos, sendo que a combinação entre os procedimentos pode oferecer resultados mais fidedignos33. O método mais fiel é aquele que possibilita a identificação dos níveis de risco que o paciente está inserido. Nesse contexto, se pode empregar tanto um diagnóstico quantitativo, o qual se refere à massa corpórea ou à massa de tecido adiposo, quanto um método qualitativo, que se refere ao padrão de distribuição de gordura corporal33.
Usualmente, a obesidade é classificada de acordo com índice de massa corporal (IMC), definido pela relação entre peso e altura do indivíduo (IMC = kg/m2)1. Por meio dessa proporção é possível caracterizar o excesso de peso quando o IMC se encontra entre 25-29,9 kg/m2, bem como caracterizar a obesidade quando o IMC é maior ou igual a 30 kg/m2. Além disso, a partir do IMC é possível caracterizar a obesidade segundo a sua gravidade, sendo que o IMC mais elevado está associado ao maior risco de comorbidades1.
Embora seja amplamente utilizado, a avaliação do IMC apresenta algumas limitações que devem ser lembradas. Dentre elas, as mais importantes são: não distingue massa gordurosa de massa magra33, podendo superestimar o grau de obesidade em indivíduos musculosos, por exemplo; Não reflete, necessariamente, a distribuição da gordura corporal33, o que é muito importante, visto que a gordura visceral (intra-abdominal) é um fator de risco potencial para o desenvolvimento de doenças, independentemente da gordura corporal total34.
Diante disso, a combinação de IMC com medidas da distribuição de gordura pode ajudar a superar essas limitações. Dentre as medidas conhecidas, estão: medição da espessura das pregas cutâneas, bioimpedância, ultrassonografia, tomografia computadorizada, ressonância magnética, relação circunferência abdominal/quadril e medida da circunferência da cintura33, 35.
A avaliação da circunferência da cintura é comumente utilizada e reflete muito bem o conteúdo de gordura visceral33, sendo considerada um bom método diagnóstico em conjunto com o IMC35. O Quadro 1, proposto pela OMS35, resume a avaliação de risco de desenvolvimento de comorbidades, utilizando a combinação entre essas duas medidas. Desse modo, a circunferência da cintura acima do ponto
de corte (Homem: <102 cm e Mulher: <88 cm) somada a elevação do IMC, contribui para o aumento do risco de comorbidades35.
Quadro 1 - Combinação das medidas de circunferência da cintura e IMC para avaliar obesidade e risco de desenvolvimento de comorbidades.
RISCO DE COMORBIDADES IMC Circunferência da cintura Homem: <102 cm Homem: >102 cm Mulher: <88 cm Mulher: >88 cm Baixo peso < 18,5 - - Peso normal 18,5-24,9 - -
Sobrepeso 25-29,9 Aumentado Alto
Obesidade (classe I) 30,0 - 34,9 Alto Muito alto
Obesidade (classe II) 35,0 - 39,9 Muito alto Muito alto
Obesidade (classe III) >40 Extremamente alto Extremamente alto Fonte: Adaptado de OMS35.
1.1.2 Dados epidemiológicos da obesidade
A obesidade tem sido descrita, por diversos autores, como um problema de saúde pública7-9, visto que ela causa consequências negativas à saúde e qualidade de vida dos indivíduos2, além de despender de muito investimento para o seu manuseio4. Ainda, os dados atuais mostram que a obesidade e o sobrepeso estão em progressão, tanto em países desenvolvidos quanto em países em desenvolvimento1.
De fato, a proporção de adultos com sobrepeso ou obesos praticamente duplicou entre 1980 e 2013, sendo um grande contribuinte para a carga global de doenças36. Dados recentes apontam que no ano de 2014, 39% dos adultos acima de 18 anos estavam com sobrepeso, correspondendo a 1,9 bilhões de indivíduos. Destes, 600 milhões (13%) foram classificados como obesos1.
Os números também são alarmantes entre as crianças e adolescentes. Em 2013, 23,8% dos meninos e 22,6% das meninas estavam com sobrepeso ou obesos nos países desenvolvidos, e nos países em desenvolvimento, 12,9% dos meninos e 13,4% das meninas compartilhavam dessa mesma situação36. A OMS destaca ainda que 42 milhões de crianças menores de 5 anos de idade estavam acima do peso ou obesos no ano de 20131.
Recentemente, o Ministério da Saúde divulgou o último relatório sobre a obesidade no Brasil37. Os dados representam os indivíduos acima de 18 anos de idade e apontam uma prevalência de sobrepeso e obesidade de 52,5% e 17,9%, respectivamente. Nesse contexto, dentre as capitais do Brasil, Florianópolis se destaca apresentando o menor percentual de indivíduos obesos do país (14%). No entanto, esse percentual ainda é alarmante, visto que a obesidade é um importante fator de risco para o desenvolvimento de inúmeras outras doenças2.
Em conjunto, o aumento da prevalência da obesidade e suas comorbidades, afetam negativamente a economia mundial38. O impacto financeiro pode ser medido pela perda de anos de vida produtiva (custo indireto) ou pelo próprio investimento no tratamento e manuseio da doença (custo direto)6.
A este respeito, relatório disponibilizado por McKinsey Global Institute38 aponta que o impacto econômico global da obesidade ultrapassa dois trilhões de dólares por ano (ou 2,8% do PIB mundial), perdendo apenas para o impacto global do tabagismo ou de violência armada, guerra e terrorismo. No Brasil, entre os anos de 2008 e 2010, o Sistema Único de Saúde gastou anualmente cerca de R$ 3,6 bilhões com o tratamento da obesidade e suas comorbidades, sendo R$ 2,4 bilhões com o tratamento hospitalar (68%) e R$ 1,2 bilhões (32%) com o tratamento ambulatorial5.
1.1.3 Fisiopatologia da Obesidade: aspectos fisiológicos e patológicos do balanço energético
Com o aumento da proporção de indivíduos obesos, bem como a relação da obesidade com as mais variadas comorbidades3, diversos pesquisadores tem se dedicado na busca da compreensão dos aspectos fisiopatológicos dessa doença 39-41. Sabe-se que a causa fundamental do excesso de peso e da obesidade é um desbalanço entre as calorias consumidas e as calorias gastas1, o qual resulta no armazenamento excessivo de triacilglicerol no tecido adiposo42.
No entanto, apesar das flutuações na ingestão alimentar e gasto energético, em situações normais, a massa adiposa dos animais tende a se manter estável por longos períodos. Isso é possível graças a um sistema biológico homeostático que busca manter o equilíbrio entre o consumo e o gasto de energia, resultando em um armazenamento adequado de substrato no tecido adiposo43.
Por outro lado, Begg e Woods32 destacam que a ingestão alimentar nem sempre é determinada pela necessidade, mas também envolve o hábito, aprendizagem, palatabilidade, conveniência ou oportunidade que o indivíduo tem de comer. Portanto, pode-se dizer que a perda da homeostase energética depende de fatores fisiológicos, genéticos, ambientais e comportamentais40.
1.1.3.1 Fisiologia do controle alimentar
O controle alimentar se dá a partir da interação de uma série de sinais nutricionais, hormonais e metabólicos entre os tecidos periféricos e o SNC40,44. Esses sinais garantem o equilíbrio energético e a ingestão alimentar a curto e longo prazo, ajudando a regular o volume e frequência das refeições, bem como o gasto e armazenamento de energia45,46. Nesse contexto, o hipotálamo desempenha o papel central32,45-47.
O hipotálamo está localizado no diencéfalo e é composto por núcleos específicos que respondem às alterações na disponibilidade de alimentos e estoque de energia45,46. O controle hipotalâmico se dá por meio de sua “comunicação” com o estômago, intestino, pâncreas, fígado, tecido adiposo e tronco cerebral, integrando esses sinais à ações fisiológicas que mantem a homeostase18,46,47.
As principais áreas do hipotálamo envolvidas no controle alimentar são o núcleo arqueado (ARC – do inglês arcuate nucleus), hipotálamo lateral (LHA, do inglês lateral hypothalamic area), núcleo paraventricular (PVN, do inglês paraventricular nucleus), núcleo ventromedial (VMN, do inglês ventromedial nucleus) e núcleo dorsomedial (DMN, do inglês dorsomedial nucleus)43,45,46. Esses núcleos estão representados na Figura 1.
Figura 1 - Principais áreas do hipotálamo envolvidas no controle alimentar. PVN - núcleo paraventricular; LHA - hipotálamo lateral; DMN - núcleo dorsomedial; VMN - núcleo ventromedial; ARC - núcleo arqueado; 3V – terceiro ventrículo.
Fonte: Adaptado de López e colaboradores48.
O ARC desempenha papel crucial no controle alimentar e é representado por um grupo de neurônios em forma de arco, localizados ao lado da base do terceiro ventrículo (3V)49. Esta área possui uma BHE semipermeável e, portanto, está estrategicamente posicionada para detectar as flutuações hormonais e nutricionais na corrente sanguínea46. O ARC é composto por duas subpopulações de neurônios, as quais atuam de maneira oposta: uma subpopulação expressa o neuropeptídeo Y (NPY) e a proteína relacionada ao Agouti (AgRP, do inglês agouti-related protein)46. Ambos são potentes estimuladores do apetite e contribuem para o aumento da ingestão alimentar45. A outra subpopulação libera melanocortinas derivadas da pro-opiomelanocortina (POMC) e um neuropeptídio denominado transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART, do inglês cocaine and amphetamine-regulated transcript)46, responsáveis pela supressão do apetite49. Esses neuropeptídeos não são os executores finais da regulação do apetite, visto que projeções neuronais dessas duas áreas se comunicam com as demais áreas hipotalâmicas (neurônios de 2ª ordem)50, que exercem controle mais direto sobre a ingestão alimentar45. O LHA, por exemplo, produz dois neuropeptideos orexígenos (orexinas), que estimulam a ingestão de alimentos51. Nesse contexto, NPY atua estimulando a secreção dessas orexinas, enquanto que as melanocortinas causam a sua inibição51. Além disso, os sinais vindos dos tecidos periféricos sinalizam o hipotálamo, em especial o ARC, sobre o estado nutricional do organismo, contribuindo também para o controle alimentar32.
A curto prazo, a ingestão alimentar é basicamente regulada pelo trato gastrointestinal em resposta à presença de nutrientes46. Nesse contexto, a grelina e o peptídeo YY (PYY) atuam de forma oposta para garantir o equilíbrio entre a ingestão alimentar e o jejum46 (Figura 2).
Figura 2 - Fatores que influenciam na ingestão alimentar. NPY – neuropeptídeo Y; RNPY – receptor do neuropeptídeo Y; POMC – pró-opiomelanocortina; RM – receptor de melanocortinas; RLep – receptor de leptina; RIns – receptor de insulina; RGre – receptor de grelina; PYY – peptídeo YY, RPYY – receptor do peptídeo YY; CART – Transcrito regulado por cocaína e anfetamina; AgRP – Proteína relacionada ao Agouti.
A grelina é conhecida como um hormônio da fome e é secretada pelo estômago antes da refeição, decaindo após a ingestão alimentar46. Ela atua estimulando o apetite ao ativar os neurônios secretores de NPY53. Em resposta a ingestão de alimentos, células endócrinas que revestem o intestino delgado e grosso, secretam o hormônio peptídico PYY. O nível de PYY aumenta após a refeição, mantendo-se elevado por algumas horas. Ele alcança o hipotálamo por meio da corrente sanguínea e inibe os neurônios de NPY estimulantes de apetite no ARC, conduzindo assim, a saciedade32,46.
Outro órgão de extrema importância para a homeostase energética é o tecido adiposo. Além de sua clássica função de armazenamento de triacilgliceróis, ele também atua como órgão endócrino, secretando uma série de hormônios que são coletivamente chamados de adipocinas54.
As adipocinas desempenham diversas funções no organismo54,55, participando do metabolismo dos lipídios e da glicose, pressão sanguínea, inflamação, comportamento alimentar e coagulação56. Sendo assim, a produção e secreção adequada dessas adipocinas estão relacionadas com o bom funcionamento de tecidos como músculos, fígado, vasos sanguíneos e cérebro54,56.
O tecido adiposo secreta uma adipocina chamada de adiponectina56. Ela circula no sangue e tem efeito potente sobre o metabolismo dos ácidos graxos e carboidratos no fígado e no músculo, sendo importante fator para o controle da homeostase energética28. Além disso, a adiponectina possui função anti-inflamatória, atuando tanto na inibição de citocinas pró-inflamatórias quanto induzindo a produção de fatores anti-inflamatórios, incluindo a interleucina 10 (IL-10)57.
Dentre as adipocinas, a leptina representa um hormônio chave na regulação do apetite, visto que atua como fator de sinalização entre o tecido adiposo e o SNC58. Ela é codificada pelo gene ob, expresso principalmente nos adipócitos, e sua concentração plasmática reflete a reserva de gordura59. Os receptores de leptina são expressos predominantemente no ARC e ao alcançá-los, a leptina inibe a expressão do NPY e AgRP e estimula neurônios que expressam POMC58,60. Como resultado, há supressão do apetite, com consequente redução da ingesta alimentar.
Assim como a leptina, a insulina leva a diminuição da ingestão alimentar. Esse hormônio é secretado pelas células β do pâncreas, sendo transportado através da BHE. A insulina age em receptores expressos em neurônios do ARC, mas também em outras regiões do cérebro, como o LHA 61. Além da função clássica na
regulação do metabolismo da glicose, a insulina possui ações centrais no controle do balanço energético semelhantes às da leptina, ou seja, convergem na diminuição da ingestão alimentar56.
O mecanismo pelo qual esses dois hormônios (insulina e leptina) atuam envolve a regulação da atividade da proteína cinase ativada por AMP (AMPK – do inglês AMP-activated protein kinase)62. Vale lembrar que a hidrólise de ATP, gera adenosina difosfato (ADP – do inglês adenosine diphosphate) e depois uma reação catalisada pela adenilato-cinase produz adenosina monofosfato (AMP – do inglês adenosine monophosphate)28. Nesse sentido, a medida que o ATP for consumido, há um aumento na produção de AMP. Portanto, a concentração AMP representa um indicador sensível sobre o estado energético da célula28.
A regulação de AMP é feita pela AMPK, a qual ativa a fosforilação de proteínas alvo e altera o metabolismo de uma série de tecidos, incluindo o aumento da expressão dos neuropeptídios NPY e AgRP no hipotálamo28. A AMPK pode ser ativada por AMP elevada ou ATP reduzida28, enquanto que a inibição de AMPK acontece pela ação da leptina (expressão de POMC) no ARC e no PVN63. Além disso, AMPK também pode ser inibida em outras áreas hipotalâmicas, frente a ação da insulina ou pela alta concentração de glicose62,63. Sendo assim, a ativação ou inibição da AMPK influencia o comportamento de alimentação, com o intuito de regular os níveis de ATP no tecido28, desempenhando um papel central na regulação da homeostase energética no hipotálamo62,63.
Vale destacar que as células demandam de um aporte contínuo de energia para exercer suas funções28. Portanto, todas as ações envolvidas no controle alimentar dependem da síntese adequada de ATP64. Nesse contexto, as mitocôndrias desempenham um importante papel no metabolismo energético28.
1.1.3.1.1 Geração de ATP: cadeia respiratória mitocondrial e creatina quinase
As mitocôndrias são organelas de formato oval, compostas por uma membrana externa e uma membrana interna. Portanto, há dois compartimentos na mitocôndria: espaço intermembranas, que fica entre as membranas interna e externa; e a matriz mitocondrial, a qual é delimitado pela membrana interna65 (Figura 3).
Figura 3 - Diagrama de uma mitocôndria. Fonte: Adaptado de Yusoff e colaboradores65.
A membrana externa é repleta por poros, sendo permeável a maioria dos metabólitos. Já a membrana interna é impermeável a maioria dos íons e moléculas polares65. As únicas espécies que conseguem cruzar a membrana interna, o fazem a partir de transportadores específicos. Além disso, a membrana interna dobra-se em uma série de pregas, chamadas de cristas, e nela estão alojados os complexos da cadeia respiratória (I, II, III e IV) e a ATP-sintase, também chamada de complexo
V28,66.
A matriz mitocondrial contém o complexo da piruvato desidrogenase e as enzimas do ciclo de krebs, a via da β-oxidação de ácidos graxos e as vias de oxidação de aminoácidos28. A glicose, ácidos graxos e os aminoácidos, em combinação com oxigênio, levam a formação de ATP67. As etapas desse mecanismo estão representadas na figura a seguir (Figura 4).
Figura 4 - Vias metabólicas para formação de ATP. NADH - Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo; FADH2 – Flavina-adenina-dinucleotídeo; ADP – adenosina difosfato; ATP- adenosina trifosfato.
Fonte: Rogge68.
A formação de ATP acontece por três estágios principais: primeiramente as macromoléculas (glicose, ácido graxo e aminoácidos) são oxidadas para produzirem fragmentos de 2 carbonos, acetil coenzima A (CoA). Posteriormente, a acetil-CoA entra no ciclo de Krebs, onde é completamente oxidada por meio da ação de uma série de enzimas, liberando água (H2O), dióxido de carbono (CO2), pequena quantidade de ATP e muitos elétrons28.
Os elétrons provenientes do ciclo de Krebs são doados à aceptores universais: nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (NAD+) ou flavina-adenina-dinucleotídeo (FAD) – formando coenzimas reduzidas ricas em energia (NADH e FADH2+, respectivamente)28. O NADH e FADH2 representam dois importantes transportadores, os quais levam os elétrons provenientes da oxidação dos macronutrientes até a cadeia respiratória mitocondrial28 (Figura 5).
Figura 5 - Transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e geração de ATP pela fosforilação oxidativa. NAD+ - Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo; FAD – Flavina-adenina-dinucleotídeo; Cit. C – citocromo C; Q – coenzima Q; ATP- adenosina trifosfato; ADP – adenosina difosfato; Pi – fosfato inorgânico.
Fonte: Adaptado de Yusoff e colaboradores65.
O NADH transporta elétrons das reações catabólicas até seu ponto de entrada na cadeia respiratória: o complexo I. Já os elétrons doados pela coenzima FADH2 tem a entrada na cadeia de transporte de elétrons pelo complexo II. Ambos os complexos (I e II) possuem enzimas especializadas em transportar os elétrons até o próximo ponto da cadeia: a ubiquinona (ou também chamada de coenzima Q)28.
Essa coenzima é um transportador móvel de elétrons e tem a capacidade de transportar os elétrons doados pelo complexo I, bem como pelo complexo II até o próximo constituinte da cadeia respiratória, o complexo III. Após alcançar o complexo III, esses elétrons são carreados por outro transportador móvel, o citocromo c, até o complexo IV, tendo como aceptor final o oxigênio (O2)28. Desse modo, o O2 sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de H2O69.
Além disso, os complexos da cadeia respiratória atuam como uma bomba de prótons, ou seja, o transporte de elétrons através dos complexos é acompanhado pelo fluxo de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas28. Essa transferência de prótons através da membrana interna produz tanto um gradiente químico quanto um gradiente elétrico entre os dois compartimentos (matriz mitocondrial e espaço intermembranas)28. A energia gerada por esse gradiente de prótons é suficiente para impulsionar a síntese de ATP, a partir da fosforilação de ADP, pelo complexo enzimático denominado ATP-sintase28 (Figura 5).
Outra fonte de produção de ATP acontece a partir da enzima creatina quinase (CK- do inglês creatine kinase)70,71, localizada em tecidos com alta demanda energética, tais como cérebro, coração e músculo esquelético72. Esta enzima é representada por cinco isoenzimas, sendo três citoplasmáticas e duas mitocôndrias71.
As isoenzimas citoplasmáticas são compostas por dois tipos de subunidades: M e B. Essas isoenzimas são conhecidas como CK-MM, encontrada no músculo esquelético; CK-BB, encontrada no cérebro e CK-MB, encontrada no músculo cardíaco72. Ainda, existem as isoenzimas mitocondriais presentes no espaço intermembranas da mitocôndria, chamadas de CK-Mi ubíqua e CK-Mi sarcomérica72,73. Essas isoenzimas são semelhantes cineticamente, porém se diferem na capacidade de unir-se a organelas subcelulares ou proteínas74.
Resumidamente, a CK é responsável por catalisar reversivelmente a reação entre a fosfocreatina e ADP, formando creatina e ATP, o qual será utilizado pelas células75. Além disso, a CK também catalisa a transformação do ATP, formado na fosforilação oxidativa, em ADP e fosfocreatina, a qual sai da mitocôndria enquanto uma nova creatina entra75 (Figura 6).
Figura 6 - Geração de ATP pela integração da enzima CK mitocondrial e CK citoplasmática. PCr – fosfocretina; Cr – creatina; ATP – adenosina trifosfato; CK – creatina quinase; ADP – adenosina difosfato; CK-Mt – creatina quinase mitocondrial. Pi – fosfato inorgânico.
Fonte: Adaptado de Baird e colaboradores76.
A fosfocreatina é exportada da mitocôndria para os locais de consumo de energia no citoplasma. Desse modo, a CK citoplasmática age sobre a fosfocreatina, formando o ATP e liberando a molécula de creatina que voltará à mitocôndria para sofrer redução novamente72,73,77.
Sendo assim, a interação entre CK (citoplasmáticas e mitocôndrias) e a fosforilação oxidativa são de fundamental importância para homeostasia energética celular. Esse equilíbrio entre a produção e gasto de ATP desempenha papel crucial na fisiologia normal dos tecidos, em especial do SNC, devido a sua grande demanda energética28.
Vale destacar que a geração de ATP pela cadeia respiratória mitocondrial cursa com a produção de radicais altamente reativos que podem danificar as células27. Portanto, esse processo deve ser cuidadosamente controlado pela defesa antioxidante a fim de evitar danos oxidativos às macromoléculas78.
1.1.3.1.2 Geração de ATP: radicais livres e defesa antioxidante
A produção de radicais livres (RLs) constitui um processo fisiológico e contínuo que, em proporções adequadas, desempenham funções importantes nos processos biológicos79. Por outro lado, a produção excessiva desses compostos pode conduzir a danos oxidativos às macromoléculas celulares, como os ácidos nucléicos, proteínas e lipídios estruturais80, acarretando em efeitos deletérios aos sistemas biológicos15. Frente a isso, os sistemas de defesa antioxidantes desempenham a função de neutralizar esses compostos reativos, evitando o dano celular78. Quando existe um desequilíbrio entre a produção de RL e a defesa antioxidante do organismo, se instala um processo denominado estresse oxidativo81.
RL é definido como qualquer átomo ou molécula que possui um número ímpar de elétrons em sua última camada de configuração69 e por conta dessa instabilidade, eles tendem a buscar elétrons de outros compostos, gerando um novo radical no seu lugar82. Os mecanismos de geração de RL ocorrem, normalmente, nas mitocôndrias, membranas celulares e no citoplasma82.
A cadeia respiratória mitocondrial representa a principal fonte de RL27. Cerca de 2% a 5% do O2 metabolizado nas mitocôndrias são desviados para outra via metabólica, e reduzidos de forma univalente, dando origem às EROs69. Esses compostos reativos representam a mais importante classe de RL69. As principais EROs incluem o radical superóxido (•O2-) e o radical hidroxil (•OH), bem como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Este último representa um metabólito de O2 parcialmente reduzido, pois não tem elétrons desemparelhados em sua órbita mais externa79.
Quando a taxa de entrada de elétrons na cadeia respiratória e a taxa de transferência de elétrons através da cadeia não são coordenadas, elétrons ficam livres para reduzir o O2 de forma univalente, gerando o radical •O2-. Ao sofrer um processo de dismutação, o radical •O2- leva a formação do H2O2. Na presença de Fe2+ ou Cu+, a reação de Fenton e a reação de Haber-Weiss levam a formação do radical •OH, contra o qual não existe defesa enzimática, além de ser altamente danoso e reativo às biomoléculas83 (Figura 7). Além disso, o •O
2- pode reagir com o óxido nítrico (NO•), gerando espécies reativas de nitrogênio (ERNs), também potencialmente reativas82.
Figura 7 - Geração de ERO pela cadeia respiratória mitocondrial. SOD – superóxido dismutase; MnSOD – superóxido dismutase manganês; CuZnSOD – Superóxido dismutase cobre zinco; GPx – glutationa peroxidase. GSH – glutationa reduzida; GSSG – glutationa oxidada; GR – glutationa redutase; NAD – Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo; FAD – Flavina-adenina-Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo; Q – coenzima Q; C – citocromo C; ADP – adenosina difosfato; ATP – adenosina trifosfato.
Fonte: adaptado de Yu e colaboradores84.
Um alvo clássico dos RLs são os ácidos graxos poli-insaturados, presentes nas membranas celulares e em lipoproteínas. Esse processo de oxidação de membrana é chamado de lipoperoxidação e como resultado, as membranas sofrem alterações na fluidez e na permeabilidade85. Consequentemente, há perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e formação de produtos citotóxicos (como o malondialdeído - MDA), culminando com a morte celular86.
Outro alvo comum dos RL são aminoácidos específicos presente em proteínas. Esse processo de oxidação resulta na formação de carbonilas, tióis oxidados, entre outras modificações que alteram a função normal da proteína87. A formação da proteína carbonilada é um fenômeno comum durante a oxidação,
portanto, sua quantificação pode ser usada para medir a extensão do dano oxidativo87.
As EROs possuem meia vida curta, são altamente reativas, reagindo facilmente com moléculas que se localizam em torno do seu sítio de formação. Nesse contexto, o sistema de defesa antioxidante desempenha a importante função de neutralizar as EROs78. As enzimas antioxidantes atuam basicamente de três formas: impedindo a formação, o ataque às estruturas celulares e através do reparo das lesões causadas pelas ERO88. O sistema de defesa é, essencialmente, dividido em sistema enzimático e sistema não-enzimático.
O sistema de defesa enzimático inclui as enzimas antioxidantes Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (CAT), Glutationa Peroxidase (GPx) e Glutationa Redutase (GrD). Essas enzimas agem por meio de mecanismos de prevenção, impedindo e/ou controlando a formação de RL e espécies não-radicais, envolvidos com a ocorrência de dano oxidativo69. Além disso, elas atuam de forma integrada, garantindo o equilíbrio adequado entre os sistemas de defesa enzimáticos88 (Figura 8).
Figura 8 - Integração dos sistemas de defesa antioxidante enzimático. SOD – superóxido dismutase; CAT – catalase; GPx – glutationa peroxidase; GrD – glutationa redutase; GSH – glutationa reduzida; GSSG – glutationa oxidada.
Existem três isoformas de SOD, a Mn-SOD mitocondrial, a Cu/Zn-SOD citoplasmática e a SOD extracelular78. Elas constituem a primeira linha de defesa enzimática contra a produção intracelular do ânion •O2-. Apesar desse RL não ser altamente danoso, ele pode extrair elétrons de diversos componentes celulares, causando reações em cadeia de RL. Nesse contexto, SOD catalisa a dismutação do •O2- em O2 e H2O2 (Equação 1)83.
Equação 1: •O2- + •O2- + 2H + SOD H2O2 + O2
A remoção H2O2 também é de extrema importância, uma vez que por meio das reações de Fenton ou Haber-Weiss acontece a geração do radical OH•83. Nesse contexto, a enzima CAT desempenha a função de converter o H2O2 recém formado em H2O e O2 (Equação 2). Essa enzima está localizada em organelas subcelulares, conhecidas como peroxissomas, que contêm várias enzimas produtoras de H2O2, e também no citosol89.
Equação 2: 2H2O2 CAT O2 + 2H2O
Além disso, o composto H2O2 também pode ser convertido em H2O pela ação da enzima GPx. A glutationa reduzida (GSH) atua como doadora de elétrons, sendo convertida em glutationa oxidada (GSSG) pela ação da GPx (Equação 3). Por fim, a enzima GrD converte a GSSG em GSH novamente, evitando dessa forma seu efeito oxidante90. A enzima GPx também reduz peróxidos lipídicos a lipídios alcoólicos e está presente no citoplasma em concentrações milimolares, bem como na matriz mitocondrial91,92.
Equação 3: 2GSH + H2O2 GPx GSSG + 2H2O
Semelhante às enzimas, a defesa antioxidante não enzimática atua de forma a combater os efeitos prejudiciais dos RL. Dentre esses compostos, se destacam os antioxidantes de origem dietética, tais como: vitaminas (ácido ascórbico, α-tocoferol e β-caroteno), minerais (zinco, cobre, selênio e manganês) e compostos fenólicos (flavonoides)93. Além de possuírem potencial de óxido-redução, estes antioxidantes também modulam a expressão gênica que codifica proteínas envolvidas em
mecanismos intracelulares de defesa contra processos oxidativos de estruturas celulares94.
1.1.3.2 Alterações fisiológicas encontradas na obesidade
Nas sociedades primitivas, onde a disponibilidade de alimento era escassa e as atividades diárias exigiam alta demanda energética, a eficiência em acumular calorias na forma de gordura tinha valor de sobrevivência95. No entanto, o atual estilo de vida sedentário aliado a abundante disponibilidade de alimentos com alto valor energético tem contribuído para o acúmulo excessivo de gordura, com consequências negativas à saúde1.
Quando a ingestão alimentar ultrapassa a necessidade do organismo, a via lipogênica é ativada, acarretando no armazenamento de triacilglicerol no tecido adiposo28. Nesse contexto, o tecido adiposo responde inicialmente com o aumento do tamanho de seus adipócitos e, ao atingirem o seu tamanho máximo, essas células se dividem. Sendo assim, na obesidade, o tecido adiposo é caracterizado pelo aumento do tamanho dos adipócitos (hipertrofia), bem como o aumento no número dessas células (hiperplasia)96.
Essas alterações do tecido adiposo estão diretamente relacionadas com a expressão e secreção desregulada das adipocinas11, influenciando então a fisiologia normal de diversos órgãos57. Por exemplo, observa-se que a obesidade cursa com níveis aumentados de leptina. No entanto, os altos níveis circulantes desse hormônio não induzem a resposta esperada de diminuição do consumo alimentar, sugerindo mecanismos de resistência quanto a ação desse hormônio97. Em contraste com o aumento na liberação de leptina, observa-se a diminuição na liberação de adiponectina com o aumento do peso, o que contribui fortemente para a resistência à insulina57.
Vale destacar que a obesidade não se restringe às alterações dos adipócitos, visto que o tecido adiposo compreende outros tipos celulares, incluindo os fibroblastos, células endoteliais e macrófagos57. Nesse sentido, já foi observado que a obesidade cursa com uma grande infiltração e ativação de macrófagos no tecido adiposo, tanto em animais quanto em humanos98,99 (Figura 9).
Figura 9 - Alterações do tecido adiposo na obesidade. Fonte: Adaptado de Ouchi e colaboradores57.
Os macrófagos já residentes do tecido, ou M2 (ativados alternativamente), expressam citocinas anti-inflamatórias, como por exemplo a IL-10, e estão relacionados com o reparo do tecido lesado100. Em contrapartida, os macrófagos recrutados ou M1 (ativados classicamente), produzem uma série de citocinas pró-inflamatórias13, caracterizando a obesidade como um estado de inflamação crônica de baixo grau12,99,101,102. Os macrófagos M1 são principalmente encontrados em torno de adipócitos mortos, formando elementos morfológicos característicos, denominados “estrutura semelhante à coroa”103. Eles expressam citocinas pró-inflamatórias, incluindo o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α – do inglês tumor necrosis factor alpha), interleucina 6 (IL-6), interleucina 1β (IL-1β), entre outras13,57,104.
Além do aumento de citocinas pró-inflamatórias na circulação, como consequência do recrutamento de macrófagos para o tecido adiposo branco105, há evidências que os ácidos graxos saturados, consumidos em excesso na dieta, podem ativar vias imunitárias inatas por meio da ligação e ativação do receptor Toll-like (TLR – do inglês Toll-like receptor) expressos na superfície de adipócitos e macrófagos106. A elevação dessas citocinas estão diretamente relacionadas com o aumento da resistência à insulina em tecidos periférico107, contribuindo dessa forma para o desenvolvimento de DM2 em indivíduos obesos11,41,56,57,101,107.
Destaca-se ainda que os mecanismos envolvidos no processo inflamatório presente na obesidade estão relacionados com a produção de EROs nos tecidos
periféricos108. Nesse sentido, estudos vem apontando que a elevação do IMC está diretamente relacionada com a presença de marcadores de estresse oxidativo sistêmico109-113, sendo que o tecido adiposo contribui fortemente para isso114. Particularmente, o tecido adiposo visceral tem importante papel na secreção de moléculas pró-inflamatórias e ERO na obesidade115.
Estudo desenvolvido por Furukawa e colaboradores31 mostrou que no tecido adiposo de animais obesos houve uma depleção das enzimas antioxidantes, bem como o aumento na expressão de NADPH oxidase, família de enzimas responsáveis pela produção do ânion •O2-116. Destacou ainda que o aumento do estresse oxidativo no tecido periférico desses animais esteve diretamente relacionado com a secreção desregulada de adipocinas31.
Além disso, a expansão do tecido adiposo acarreta em baixo suprimento sanguíneo, tendo como consequência a hipóxia tissular117. Além de contribuir para a necrose tecidual, a hipóxia celular promove um desequilíbrio no transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial, levando a uma maior produção de ERO pelas mitocondrias117.
Vincent e Taylor108 destacam outros mecanismos que contribuem para a produção de ERO em tecidos periféricos na obesidade, incluindo o aumento da atividade muscular para transportar o excesso de peso e a hiperglicemia, a qual gera um estado de estresse oxidativo ao aumentar o gradiente de prótons na mitocôndria. Os principais componentes geradores de EROs da cadeia respiratória mitocondrial são os complexos I e III (Figura 10), sendo que a produção de RL aumenta no caso de um bloqueio na transferência de elétrons118.
Figura 10 - Produção de ERO e dano oxidativo mitocondrial. CRM – cadeia respiratória mitocondrial; mRNA – RNA mitocondrial; mtDNA – DNA mitocondrial; CoQ – coenzima Q; Cit C – citocromo C; ATP – adenosina difosfato; Mn SOD – superóxido dismutase manganês; CAT – catalase; GPx – glutationa peroxidase. Fonte: Adaptado de Forbes-Hernández e colaboradores119.
A Figura 10 representa um ciclo vicioso, visto que as ERO geradas na mitocôndria podem causar dano oxidativo no próprio DNA mitocondrial, bem como prejudicar a expressão de proteínas essenciais para o bom funcionamento da cadeia respiratória mitocondrial120,121. O resultado disso é o aumento na produção de ERO, seguido da progressão da disfunção mitocondrial. Além disso, as ERO podem prejudicar as membranas celulares, culminando em morte celular119.
A este respeito, estudo de Bonnard e colaboradores14 mostrou que houve alterações mitocondriais, bem como aumento na produção de ERO no tecido muscular de camundongos após o consumo de uma dieta rica em gordura e sacarose. Ainda, estudos apontam que pacientes com obesidade e diabetes apresentam disfunção mitocondrial em tecidos como fígado e músculo esquelético122,123, contribuindo não somente para a depleção na síntese de ATP, mas também para a produção das EROs.
1.1.3.2.1 SNC e Obesidade
Vale ressaltar que a obesidade não cursa apenas com modificações do tecido periférico16. Alterações no hipotálamo estão diretamente relacionadas com o desenvolvimento de obesidade124-129, visto que ele desempenha papel chave no controle alimentar43. Portanto, um dano à essa estrutura, seja ele funcional, estrutural, genético ou iatrogênico, pode ocasionar a desregulação do controle energético e, consequentemente, o acúmulo anormal de gordura corporal17.
Sabe-se que o cérebro é cuidadosamente protegido por uma BHE, a qual é predominantemente formada por junções apertadas entre as células endoteliais130. A BHE tem como principal função controlar a entrada de nutrientes e células, incluindo células do sistema imunológico periférico, para o SNC. No entanto, determinadas áreas do cérebro, mais notavelmente uma parte do hipotálamo, não estão completamente protegidas pela BHE131 – chamadas de regiões circunventriculares. O hipotálamo depende de sua interação com sangue, para captar os sinais enviados pelo tecido periférico sobre o status alimentar131, sendo assim, ele se torna mais vulnerável às alterações nocivas encontradas no sangue130.
Além disso, sob condições clínicas como um estado inflamatório, a BHE pode perder a sua integridade estrutural, tornando-se permeável à entrada de células imunitárias periféricas no SNC26,132. A este respeito, Buckman e colaboradores26 mostraram que a obesidade induzida por dieta com alto teor de gordura, em camundongos, levou ao aumento do recrutamento de monócitos para o SNC. Consequentemente, pode haver um aumento na expressão de citocinas pró-inflamatórias e produção de ERO pelas células imunitárias, contribuindo para o agravamento do dano neuronal26.
Um apanhado de evidências sugere que uma dieta rica em gordura saturada leva a inflamação hipotalâmica, tendo como consequência a neurodegeneração10,133,134. Milanski e colaboradores19 mostraram que ácidos graxos com cadeia saturada são capazes de ativar receptores do tipo Toll-like 4 (TLR4, do inglês Toll-like receptor 4) no hipotálamo, sinalizando a expressão de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, citocinas dos tecidos periféricos podem atuar no cérebro e induzir a produção de citocinas local. Nesse contexto, a ativação de células gliais, em especial a micróglia, desempenham um importante papel135.
Micróglia são macrófagos residentes do SNC e desempenham funções na mediação de resposta inflamatória136,137. Elas contribuem para a função normal cerebral138, no entanto, quando ativadas cronicamente, esses tipos celulares podem representar uma grande fonte de dano neuronal24. Ao serem ativadas, as micróglias liberam citocinas pró-inflamatórias21 e ERO23 e a exposição prolongada dos neurônios à esses compostos pode causar disfunção neuronal e contribui para o dano tecidual22,25.
Destaca-se que o cérebro apresenta algumas particularidades que o torna mais exposto aos danos causados pelo estresse oxidativo83. A primeira delas refere-se ao fato dessa estrutura possuir um alto teor de ácidos graxos insaturados, os quais são facilmente peroxidáveis83. Além disso, o cérebro demanda de uma grande quantidade de ATP para desempenhar suas funções28, o que também o torna um grande produtor de ERO139, além de possuir elevado teor em ferro e ascorbato em algumas regiões do SNC, permitindo a geração ERO por meio da reação Fenton e Haber-Weiss83. Em contrapartida, o cérebro possui níveis diminuídos da enzima antioxidante CAT, sendo mais exposto aos danos provocados pelas EROs139.
Com relação ao estresse oxidativo no SNC, estudo de Ma e colaboradores30 demonstrou elevada formação de ERO, bem como disfunção mitocondrial no plasma e cérebro (tecido cerebral total, sem divisão de estruturas cerebrais) de animais induzidos a obesidade por dieta rica em gordura. Porém, esse achado não foi visto em animais resistentes a dieta. Freeman e colaboradores140 também demonstraram que a obesidade induzida por dieta aumenta os níveis de estresse oxidativo no tecido cerebral, estando altamente relacionado com o nível de adiposidade. Além disso, estudos apontam que a obesidade está associada ao comprometimento da função cognitiva, ao prejudicar regiões como córtex pré-frontal141 e hipocampo142. Por outro lado, a relação da presença de marcadores inflamatórios, estresse oxidativo e disfunção mitocondrial especificamente no hipotálamo de animais obesos não está completamente esclarecida. Sendo assim, há uma necessidade de mais estudos que avaliem o efeito de uma dieta rica em gordura saturada sobre esses parâmetros no hipotálamo.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da obesidade sobre parâmetros inflamatórios, de estresse oxidativo e metabolismo energético no hipotálamo de camundongos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Quantificar os níveis das interleucinas IL-1β e IL-10 no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica;
Determinar os níveis de peroxidação lipídica (MDA) no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica;
Quantificar os níveis de carbonilação de proteínas no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica;
Avaliar a atividade da enzima antioxidante SOD no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica;
Avaliar a atividade da enzima CAT no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica;
Quantificar os níveis de GSH no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica;
Avaliar a atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica;
Avaliar a atividade da enzima CK no hipotálamo de camundongos induzidos à obesidade por dieta hiperlipídica.
3. MÉTODOS
3.1 TIPO DE ESTUDO
Estudo quantitativo, do tipo experimental.
3.2 ANIMAIS
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) machos, da linhagem Swiss, procedentes do biotério da Universidade Federal de Santa Catarina. Os animais possuíam 40 dias de idade, pesando aproximadamente 30g no início do experimento. Os mesmos foram alojados individualmente em gaiolas para camundongos, de modo a evitar brigas entre eles. Além disso, foram mantidos em ambiente climatizado, com ciclos de luminosidade de 12 horas e temperatura de 23±3°C.
3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os animais foram divididos em dois grupos de estudo: grupo controle e grupo obeso. O grupo controle foi alimentado com ração normolipídica, enquanto que o grupo obeso foi submetido a um modelo animal de obesidade por dieta hiperlipídica. Ambos os grupos foram compostos por um total de 30 camundongos, totalizando 60 animais para a realização deste estudo.
A indução da obesidade teve uma duração de dez semanas e ao término desse período, o modelo da doença foi validado nos animais. Logo em seguida, eles foram mortos e os tecidos de interesse foram dissecados para as análises bioquímicas. O desenho experimental está representado na Figura 11.
Figura 11 - Desenho experimental para indução de obesidade e dosagens bioquímicas no hipotálamo dos camundongos.
3.3.1 Indução da obesidade
Diversos modelos de obesidade são baseados no consumo de dieta padronizada143. A escolha por este tipo de modelo de obesidade é bastante apropriada, visto que se aproximam da gênese dessa doença em humanos, considerando o padrão de alimentação atual1.
A fim de avaliar as alterações neuroquímicas em camundongos obesos, o presente estudo fez uso de uma dieta rica em lipídios. Este modelo de indução de obesidade apresenta validade de face e validade de construção, uma vez que animais alimentados com dieta hiperlipídica apresentam ganho de peso, bem como alterações metabólicas144, mimetizando a doença dos humanos. Também apresenta validade preditiva, visto que camundongos obesos perdem peso após tratamento com fármaco convencional (sibutramina)144.
O protocolo para indução da obesidade, bem como a composição das dietas foram baseados em estudos prévios145,146. O grupo controle foi alimentado com dieta normolipídica (contendo 10% de calorias provenientes de lipídios com cadeia insaturada) e o grupo obeso recebeu uma dieta hiperlipídica, a qual forneceu mais calorias (5.358 Kcal/Kg) (Tabela 1) e teve maior percentual de gordura que a dieta
normolipídica (contendo um total de 59% de calorias provenientes de lipídios, sendo 52,4% correspondente à gordura saturada) (Tabela 2). Ambas as rações foram adquiridas da empresa PRAGSOLUÇÕES Biociências, especializada em desenvolvimento e produção de dietas padronizadas para experimentação animal.
Tabela 1 - Composição e valor calórico das dietas normolipídica e hiperlipídica, a cada 1000g.
Ração normolipídica Ração hiperlipídica
Ingredientes g/kg kcal/kg g/kg kcal/kg
Amido de milho 427,5 1710 115,5 462 Caseína 200 800 200 800 Sacarose 132 528 132 528 Amido dextrinizado 100 400 100 400 Óleo de soja 40 360 40 360 Banha de porco - - 312 2808 Celulose 50 - 50 - Mix de minerais 35 - 35 - Mix de vitaminas 10 - 10 - L-Cistina 3 - 3 - Bitartarato de colina 2,5 - 2,5 - Butil hidroxitolueno 0,028 - 0,028 - Total 1000,028 3798 1000,028 5358
Tabela 2 - Percentual de calorias provenientes dos macronutrientes das dietas utilizadas.
Macronutrientes (%Kcal) Ração controle Ração hiperlipídica
Carboidratos 69 % 26 %
Proteínas 21 % 15 %
Lipídios 10 % 59 %
Todos os animais tiveram livre acesso à água e comida durante o experimento, o qual teve dez semanas de duração. Durante esse período, o consumo alimentar foi mensurado diariamente, e ao término das dez semanas de experimento, a obesidade dos animais foi confirmada por meio da avaliação do peso corporal e peso da gordura visceral.
3.3.1.1 Avaliação do consumo alimentar
A avaliação do consumo alimentar foi realizada com base na diferença entre a quantidade de ração oferecida aos animais e a quantidade restante na gaiola, após vinte e quatro horas. Esses dados foram expressos em forma de calorias consumidas, levando em consideração o total de calorias correspondente de cada dieta (normolipídica = 3.798Kcal/Kg; hiperlipídica = 5.358Kcal/Kg) (Tabela 1).
3.3.1.2 Avaliação do peso corporal
O peso corporal dos animais foi monitorado durante todo o período de indução de obesidade. Essa avaliação aconteceu uma vez por semana, com a utilização de balança digital eletrônica.
3.3.1.3 Avaliação da gordura visceral
Após a morte do animal, a cavidade abdominal foi aberta, seguida da dissecação do tecido adiposo das regiões mesentérica, epididimal e retroperitoneal. Em seguida, as amostras foram limpas e pesadas em balança analítica de alta
