4 ATIVIDADE FARMACOLÓGICA

Os terpenos estachenona, 12-oxo-estachenona, 13ȕ-hidroxi-atisen-3-ona, ácido acetilaleutitólico, e o alcalóide rhamnifolina, constituintes químicos obtidos através do estudo fitoquímico de Croton rhamnifolius, foram submetidos a testes farmacológicos de tripanocida, leishmanicida e citotoxicidade, realizados no departamento de farmácia da Universidade de Brasília.

Dois dos compostos analisados se apresentaram eficientes em pelo menos um dos testes, o diterpeno de esqueleto atiseno, 13ȕ-hidroxi-atisen-3-ona (1) e o alcaloide de esqueleto indólico, rhamnifolina (2)(Fig. 9).

O primeiro composto foi submetido aos quatro testes, obtendo resultado positivo apenas contra Leishamania amazonensis, apresentando índice de inibição de 50% a 0,2 µg/mL.

O alcaloide rhamnifolina foi submetido a ensaios farmacológicos contra Tripanossoma cruzi, Leishmania amazonensis e citotoxicidade, apresentando resposta positiva nos três testes aplicados.

Figura 9. Constituintes químicos ativos

O OH H (1) (2) 4.1 Farmacologias avaliadas 4.1.1 Tripanocida

O Trypanosoma cruzi é um protozoário, agente etiológico da doença de Chagas. Trata-se de uma infecção transmissível em que o parasita circula no sangue periférico e tecidos, provocando lesões teciduais graves, principalmente no coração e em órgãos

N N

H H

do aparelho digestivo (esôfago e intestino). O T. cruzi possui um ciclo biológico complexo, envolvendo três formas evolutivas (tripomastigota, epimastigota e amastigota) e várias espécies de triatomíneos e de mamíferos, silvestres e domésticos, que atuam respectivamente, como vetores e reservatórios do parasito (PRATA, 2001). O fármaco mais freqüentemente utilizado no tratamento da Doença de Chagas no Brasil é o Benzonidazol (Roche), um derivado nitroimidazólico, com fómula química N-benzil-2-nitro-1- imidazolacetamida, desenvolvido na década de 1960. Esse composto é ativo na fase aguda da Doença de Chagas, curando cerca de 70% dos infectados, mas apresenta eficácia limitada na forma crônica da doença (KIRCHHOFF, 1999).

4.1.2 Leishmanicida

As Leishmanioses são um grupo de doenças polimórficas, causadas por protozoários parasitas pertencentes ao gênero Leishmania (Ordem Kinetoplastida, Trypanosomatidae), que são transmitidos ao homem e a outros mamíferos através da picada da fêmea do inseto Lutzomyia spp. A doença tem apresentações clínicas diversas, podendo acometer a pele, as mucosas e as vísceras. No Brasil, existem sete espécies distintas do parasito: L. braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, L. lansoni, L. shawii, L. naiffi, L. chagasi) (GENARO e MICHALICK, 2005; GENARO e REIS, 2005a). As leishmanias apresentam duas formas evolutivas: a amastigota, que é obrigatoriamente parasita intracelular em vertebrados, e a forma promastigota que se desenvolve no tubo digestivo dos hospedeiros invertebrados. Leishamania amazonensis, espécie destacada por ser responsável por duas formas de interesse clínico: a Leishmaniose cutânea localizada (LCL), caracterizada por lesões geralmente únicas, de caráter benigno, e Leishmaniose cutânea difusa (LCD), caracterizada imunologicamente por uma anergia do hospedeiro e falta de resposta imunitária de base celular.

4.1.3 Citotoxicidade

A citotoxicidade é a propriedade nociva de uma substância em relação às células. Células citotóxicas são células que têm a capacidade de destruir outras células através da libertação de certas substâncias nocivas. Os ensaios de avaliação da citotoxicidade permitem averiguar os efeitos tóxicos ou anti-proliferativos da amostra-teste em culturas celulares.

4.2 Ensaios farmacológicos aplicados em rhamnifolina 4.2.1 Metodologia para análise da atividade tripanocida

A avaliação da atividade tripanocida in vitro realizado sobre formas epismatigotas de T. cruzi, usando o sal tetrazolium MTT como método colorimétrico resultou em IC50 de 19,32 µg/mL (Tab. 2, p. 44), evidenciando uma excelente atividade do composto, que apresentou um menor IC50 quando comparado com descrito para o medicamento benzonidazol (IC50 ~ 50 µg/mL) utilizado para combater a doença de chagas, enfermidade ocasionada pelo protozoário T. cruzi (LIRUSSI, 2004).

4.2.2 Metodologia para análise da atividade contra Leishmania amazonensis

A análise da atividade contra Leishmania amazonensis foi realizado sobre as duas

formas do parasito da espécie: promastigotas e amastigotas.

Atividade in vitro sobre formas promastigotas de L. amazonensis apresentou para o composto, inibição de 100% do crescimento dos parasitos a 100 µg/mL. Para determinação do IC50, foram utilizadas concentrações decrescentes, variando entre 50 e 0,02 µg/mL. Foi observada a inibição de 50% dos promastigotas a 0,88 µg/mL (Tab. 2, p. 44).

Para a atividade in vitro sobre formas amastigotas de L. (L.) amazonensis foi

realizado o teste de rhamnifolina em macrófagos peritoneais infectados com formas amastigotas que exibiu o potencial anti-leishamia do composto. Após a contagem de parasitos em cada macrófago, foi observado que após 24h de exposição ao composto, houve redução significativa da carga parasitária em todas as concentrações testadas. O IC50 apresentado foi de 12,48 µg/mL (Tab. 2, p. 44).

4.2.3 Metodologia para análise da atividade citotóxica

A análise da atividade citotóxica de rhamnifolina sobre células de mamíferos, através de células da linhagem NIH3T3 foram incubadas com o composto ativo para observação dos efeitos citotóxicos. Após 24h de tratamento, a avaliação da viabilidade celular com MTT permitiu observar que a concentração citotóxica de 50% (CC50) foi igual a 164,94 µg/mL. Abaixo da concentração não foi notado nenhum efeito nocivo. A partir da determinação do índice de seletividade (SI), foi confirmada a seletividade da atividade de rhamnifolina sobre formas promastigotas (SI=187) e amastigotas de L. amazonensis (SI=13) (Tab. 2). A linhagem celular NIH3T3 possui alta inibição de contato estabelecida a partir de culturas de embriões de camundongo NIH Swiss. As células são úteis para estudos de transfecção e transformação de DNA.

Tabela 2. Atividade dos compostos isolados contra formas promastigotas (P) e

amastigotas (A) de Leishmania amazonensis, citotoxicidade em células NIH3T3 e atividade contra a forma epismatigotas (E) de Trypanosoma cruzi.

Compostos

Leishmanicida _{Citotoxicidade} Tripanocida IC50 (P) (µg/mL) IC50 (A) (µg/mL) CC50 (µg/mL) SI em NIH3T3 IC₅₀ (E) (µg/mL) (P) (A) Rhamnifolina 0,88 12,48 164,94 187,43 13,22 19,32 13-ȕ-hidroxi-atisen-3-ona 0,2 -- -- -- -- --

A rhamnifolina e a 13-ȕ-hidroxi-atisen-3-ona tiveram seu potencial leishmanicida avaliado sobre formas extracelulares flageladas, as promastigotas e formas intracelulares, as amastigotas, de Leishmania (Leishmania) amazonensis.

Os dois compostos apresentaram atividade expressiva sobre promastigotas, apresentando a capacidade de reduzir em 50% a quantidade de parasitos viáveis (IC50) nas concentrações de 0,88 e 0,2 µg/mL, respectivamente. Foi possível observar ainda que a houve alta especificidade de ação para a rhamnifolina. Nos ensaios de citotoxicidade desse

composto, a concentração testada que resultou em 50% de células NIH3T3 viáveis (CC50) foi igual a 164,94 µg/mL. É possível observar que o Índice de Seletividade (IS) obtido indica a capacidade da substância ativa em atuar sobre as formas promastigotas em concentração cerca de 187 vezes menor do que a necessária para causar efeitos tóxicos medidos no CC50.

Em relação à atividade da rhamnifolina sobre amastigotas, observou-se IC50 igual e 12,48 µg/mL. Trata-se de uma atividade promissora, que pode ser melhorada por meio de semi-síntese de derivados potencialmente mais ativos. O IS procurado, em geral deve estar acima de 10, para garantir especificidade da ação biológica. Portanto, o valor obtido de 13,22 demonstra um perfil satisfatório de baixa citotoxicidade dessa substância.

Essa amostra foi testada ainda sobre formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi, com IC50 igual a 19,32 µg/mL. Embora ambos parasitos em teste sejam protozoários, é possível verificar que houve maior especificidade de ação sobre Leishmania.