Atividade seqüestradora de radicais livres com as bicumarinas isoladas das sementes de

Ensaios autográficos de atividade seqüestradora de radicais livres utilizando solução reveladora de DPPH mostraram que muitas frações obtidas por procedimento cromatografia “flash” do extrato do embrião das sementes de H. courbaril possuíam essa atividade. Em ensaios realizados em microplacas, o extrato bruto das sementes (etanólico) e a fração AcOEt derivada desse extrato apresentaram atividade seqüestradora de radical livre com valores de EC50 = 500 e 100 µg mL-1, respectivamente. A bicumarina himenaína apresentou maior atividade, com 50% de atividade seqüestradora do radical livre DPPH nas concentrações de 100µM, enquanto a ipomopsina e escopoletina apresentaram o mesmo efeito em concentrações de 300 e 500 µM, respectivamente (Figura 17). Os valores da EC50 dos padrões quercetina e catequina, utilizados como controle do ensaio, foram de 6 e 7 µM, respectivamente.

Figura 17. Atividade seqüestradora do radical DPPH dos compostos identificados nos extratos das sementes de Hymenaea courbaril. (A) Escopoletina, (B) himenaína e (C) ipomopsina.

0 20 40 60 80 100 10 20 30 60 100 200 300 400 500 600 700 Escopoletina 0 20 40 60 80 100 10 20 30 60 100 200 300 400 500 600 700 Hymenaína A ti v id a d e S e q u e s tr a d o ra d e D P P H ( % ) A ti v id a d e S e q u e s tr a d o ra d e D P P H ( % ) 0 20 40 60 80 100 10 20 30 60 100 200 300 400 500 600 700 Ipomopsina Himenaína A ti v id a d e S e q u e s tr a d o ra d e D P P H ( % ) µM

A

B

C

3.4 DISCUSSÃO

As sementes quiescentes de H. courbaril são grandes, pesando cerca de 5 ± 2 g, e levam cerca de 10 dias para completar o processo de embebição, havendo grande variação temporal na protrusão da radícula. Nos experimentos de atividade fitotóxica, a protrusão da radícula nas sementes de H. courbaril ocorreu de 15-20 dias após início da embebição e em torno de 20-25 dias nos experimentos de bioautografia. Os dados obtidos nos experimentos mostram que as sementes de H. courbaril exsudam substâncias fitotóxicas e antifúngicas durante o período pré e pós-germinativo. Exsudatos coletados aos 10 dias pós-embebição das sementes reduziram significativamente e diferencialmente a germinação e o desenvolvimento da parte aérea e radícula das espécies-teste alface e tomate (Figuras 4 e 5).

As sementes de tomate foram afetadas principalmente quanto à sua germinação e crescimento da radícula, enquanto que em alface houve redução do crescimento do hipocótilo e da radícula. Parvez et al. (2004) estudaram os efeitos fitotóxicos de exsudatos do casca de árvores e de sementes de Tamarindus indica L. (Fabaceae), espécie que também acumula xiloglucano como polissacarídeo de reserva em suas sementes, e observaram que as substâncias fitotóxicas liberadas têm ação espécie-específica.

Os exsudatos coletados aos 30 dias após início da embebição das sementes de H. courbaril foram os que apresentaram maior acúmulo de fitotoxinas, causando efeitos mais drásticos nas espécies-teste. Durante esse período, as sementes de H. courbaril já haviam germinado e iniciado a mobilização do xiloglucano de reserva presente nos cotilédones (Bukeridge et al., 2000). Estes resultados indicam que a exsudação de compostos bioativos pelas sementes de H. courbaril é maior durante o início da mobilização da reservas.

Embora o período em dias entre os experimentos de atividades fitotóxica e antifúngica não coincida (30 dias para os experimentos para atividade fitotóxica e 40 dias nos experimentos com atividade antifúngica), o estádio de desenvolvimento das sementes era praticamente o mesmo, isso porque a embebição das sementes de H. courbaril em meio de cultura MS foi mais lenta, o que ocasionou atraso na protrusão da radícula. Aos 40 dias pós-embebição também foi observada maior exsudação de substâncias antifúngicas (Figura 6). Das quatro substâncias antifúngicas exsudadas, duas foram encontradas apenas após a germinação (Figura 6, Rfs = 0,07 e 0,23) e duas foram liberadas logo no início da embebição das sementes (Figura 6, Rfs = 0,65 e 0,74).

As atividades detectadas nos exsudatos das sementes de H. courbaril podem estar relacionadas à presença das bicumarinas e de escopoletina. Os extratos dos exsudatos e sementes de H. courbaril mostraram-se muito tóxicos a A. thaliana e as bicumarinas isoladas também exerceram fitotoxicidade, especialmente quando co-aplicadas. Cumarinas têm sido descritas como potentes aleloquímicos. Abenavoli et al. (2001) mostraram que cumarinas simples foram capazes de afetar a forma e a função de raízes de trigo (Triticum turgidum ssp. durum Desf.). Foi observado também que essas cumarinas podem causar inibição irreversível da germinação de trigo, por reduzir a entrada de água, a capacidade de retenção de eletrólitos e o consumo de oxigênio das sementes (Abenavoli et al., 2004). Monocumarinas e bicumarinas sintéticas também foram relatadas como moléculas reguladoras do crescimento de plantas, sendo capazes de inibir o crescimento de plântulas de ervilha (Pisum sativum L.), pepino (Cucumis sativa L.) e trigo, entretanto, o efeito das bicumarinas ensaiadas foi inferior ao das cumarinas simples (Alexieva et

al. 2002). Neste trabalho, o efeito da aplicação conjunta de ipomopsina e himenaína não variou

com o aumento da concentração aplicada em plântulas de A. thaliana, sugerindo que as concentrações utilizadas possivelmente estão fora da linearidade do efeito dose-resposta dessas substâncias.

As bicumarinas isoladas não inibiram o crescimento de leveduras e fungos filamentosos. Na literatura não foram encontrados relatos que atribuem atividade antifúngica às bicumarinas. Algumas das atividades biológicas reportadas para essas substânciass incluem a anti-HIV, anticoagulante, antiinflamatória e propriedades inibidoras de enzimas (Khan et al. 2004; Borges

et al., 2005; Choudhary et al., 2006; Su et al. 2006). Embora as bicumarinas isoladas não tenham

atividade antifúngica, a cumarina escopoletina é uma das substânciass responsáveis pela atividade antifúngica dos exsudatos das sementes de H. courbaril, uma vez que essa substância foi detectada nos exsudatos pelas análises de GC-MS e que 5 e 10 µg de padrões comerciais de escopoletina inibiram o crescimento do fungo C. sphaerospermum no ensaio de bioautografia (dados não mostrados). Em algumas espécies, escopoletina tem sido descrita como uma fitoalexina capaz de inibir o crescimento de vários fungos e bactérias patogênicas (Ahl-Goy et al. 1983, Valle et al., 1997). Em plantas de tabaco, a indução de escopoletina e escopolina (conjugado glicosilado de escopoletina) foi observada durante a resposta de hipersensibilidade (HR) e a resistência localizada adquirida (LAR) durante a infecção pelo vírus TNV (Costet et al., 2002). Em raízes de Argyreia speciosa Sweet, essa hidroxicumarina também foi encontrada e apresentou forte atividade inibidora do crescimento do fungo Alternaria alternata (Fr.) Kiessler e também mostrou toxicidade em raízes de plântulas de trigo (Shukla et al., 1999). Em Helianthus

annuus L., escopoletina causou inibição do crescimento do fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.),

um patógeno capaz de infestar vários órgãos da planta (Urdangarín et al.,1999).

Escopoletina também é conhecida pelas suas propriedades antioxidantes e têm sido muito utilizada para a quantificação de peróxido de hidrogênio em plantas (Levine et al., 1994). As características antioxidantes da escopoletina conferem a ela papel importante nos mecanismos de defesa vegetal. Em células de folhas tabaco, a produção desta cumarina contribui para o controle

do estresse oxidativo gerado pela resposta de hipersensibilidade induzida por um eliciador glicoprotéico derivado do fungo Phytophthora megasperma Drechs (Costet et al. , 2002).

Apesar da sua comprovada atividade antioxidante, neste estudo a escopoletina não apresentou eficácia no seqüestro dos radicais DPPH apresentando alto valor de EC50 (500 µM, Figura 17). O mesmo valor de concentração efetiva para essa cumarina no seqüestro do DPPH foi mencionado por Abreu et al. (2008). Os dímeros de escopoletina foram mais eficazes, principalmente a himenaína com valor de EC50 de 100 µM.

Apesar da atividade seqüestradora das bicumarinas não ser tão potente quanto à dos padrões de flavonóides utilizados (catequina e quercetina), a grande quantidade dessas substâncias encontradas nos extratos das sementes de H. courbaril sugere papel na proteção das células do embrião das sementes a danos causados por radicais livres. As frações FH4 e FH10, provenientes do fracionamento em coluna “flash”, encontravam-se muito enriquecidas com himenaína e ipomopsina, respectivamente. O rendimento dessas frações somados ao rendimento das substâncias isoladas totalizaram 119 mg de himenaína e 54 mg de ipomopsina, representando cerca de 25% do extrato de onde foram isoladas.

As espécies reativas de oxigênio (EROs) estão envolvidas em muitos processos fisiológicos das sementes. Muitos processos metabólicos são ativados durante a germinação ou infecção por patógenos gerando EROs, tais como o radical hidroxila (•OH), o ânion superóxido (O2-), o radical peroxila (ROO•) e peróxido de hidrogênio (H2O2), os quais podem ocasionar

danos ao DNA ou podem causar a oxidação de lipídeos e proteínas (Bailly, 2004). Dessa forma, as substâncias antioxidantes presentes nas sementes de H. courbaril podem conferir um caráter protetor às células, estabilizando ou desativando radicais livres antes que eles ataquem seus alvos biológicos (Bailly et al., 2004).

Muitos trabalhos relatam a presença de terpenos em H. courbaril (Nogueira et al., 2002; Imamura et al., 2004), mas não havia estudos dos metabólitos secundários produzidos por suas sementes. A molécula de ipomopsina foi previamente descrita, uma única vez em I. aggregata (Arisawa et al., 1984). As cumarinas simples são substâncias comumente encontradas nas plantas superiores, mas as bicumarinas são compostos raros, especialmente as que possuem uma ligação carbono-carbono como a ipomopsina (Liu et al., 2007). Bicumarinas foram encontradas em espécies de: Thymelaeaceae, Lasiosiphon eriocephalus Grant (Sengupta & Das, 1978),

Edgeworthia gardneri Meissen (Majumber et al., 1974), Edgeworthia chrysantha Lindl. (Baba et al., 1990), Daphne oleoides Schreber (Riaz et al., 2001), D. giraldii Nitsche (Li et al., 2005) e D. genkwa Siebold & Zucc. (Park et al., 2006); de Rutaceae, Boenninghausenia albiflora Reichb &

Meissner (Joshi et al., 1989), Toddalia asiatica (L.) Lam. (Tsai et al., 1997) e Ruta Montana L. (Kabouche et al., 2003); e de Balsaminaceae, Impatiens balsamina L. (Panichayupakaranant et

al., 1998). Em Fabaceae, bicumarinas também foram encontradas em Coronilla cretica L., Coronilla elegans Panc. e Coronilla orientalis Mill. (Malikov & Saidkhodzaer, 1998).

A presença de escopoletina, dímeros de escopoletina e também ácido ferúlico no embrião das sementes de H. courbaril indica a ativação da via de biossíntese destes compostos nas sementes. Muitos passos da via de biossíntese das cumarinas permanecem desconhecidos (Bourgaud et al., 2006, Harbone, 1999).

Os dados obtidos nesse estudo evidenciaram a ocorrência de metabólitos secundários importantes nos processos de defesa contra patógenos, nas interações planta-planta e no processo de proteção aos danos causados por espécies reativas de oxigênio. A ocorrência de escopoletina e bicumarinas nas sementes de H. courbaril abre perspectivas de estudos das rotas biossintéticas dessas substâncias nessa espécie e são exemplos da diversidade química dos produtos naturais encontrados no gênero Hymenaea.

3.5 CONCLUSÕES

Com os dados obtidos neste trabalho pode-se concluir que as sementes de H. courbaril são ricas em cumarinas e bicumarinas que são liberadas durante o processo germinativo, cujas atividades biológicas sugerem que elas desempenhem um papel protetor das sementes mediante as circunstâncias de estresse oxidativo, além de possuir potencial inibidor do crescimento de fungos e plantas podendo conferir vantagens adaptativas para o desenvolvimento dessa espécie.

3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O ciclo de vida das plantas compreende a embebição de água pelas sementes, a emergência da radícula, o desenvolvimento da raiz, o crescimento, a floração e a formação de sementes. A germinação e o desenvolvimento inicial de plântulas são períodos críticos, onde a sobrevivência pode ser afetada por vários fatores como disponibilidade de luz, água, nutrientes, assim como a presença de patógenos, herbívoros e simbiontes. A presença de mecanismos adaptativos efetivos nas espécies vegetais durante essa fase de desenvolvimento garante o sucesso do seu estabelecimento inicial.

Sesbania virgata e Hymenaea courbaril são duas espécies de Fabaceae com

comportamentos ecológicos distintos. S. virgata é uma espécie pioneira de desenvolvimento rápido, perene, que produz grande quantidade de sementes, enquanto H. courbaril é uma espécie perene e clímax tardia que apresenta crescimento lento. As sementes das duas espécies diferem entre si também em vários aspectos morfológicos, anatômicos e bioquímicos. S. virgata apresenta como reserva o galactomanano presente na parede celular das células endospérmicas, o qual é rapidamente degradado por ação de hidrolases após a germinação das sementes (Buckeridge & Dietrich, 1996). O xiloglucano presente nas paredes celulares das células cotiledonares das sementes de H. courbaril também funciona como uma reserva pós-germinativa, entretanto, o xiloglucano é degradado lentamente em um período de aproximadamente dois meses após a germinação das sementes (Tiné et al., 2000). Estudos realizados por Santos & Buckeridge (2004) indicaram que o xiloglucano de reserva exerce um papel importante no estabelecimento das plântulas de H. courbaril, especialmente em ambientes com escassez de luz, como por exemplo, no sub-bosque das florestas onde essa espécie ocorre.

Os resultados obtidos neste trabalho relativos à química micromolecular das sementes e sobre a atividade biológica das substâncias identificadas adicionam informações importantes a outros estudos já realizados com essas espécies de Fabaceae. Os dados obtidos mostram que independentemente das diferenças ecológicas, estruturais e bioquímicas, as sementes de S.

virgata e H. courbaril apresentam substâncias fitotóxicas e antifúngicas, as quais estão presentes

e/ou são liberadas no início da embebição das sementes, e que podem contribuir para a proteção ao ataque de patógenos e a danos ocasionados pela geração de radicais livres e para inibir o crescimento de outras espécies vegetais potencialmente competidoras durante os estádios iniciais de crescimento.

Embora não tenham sido elucidados todos os metabólitos ativos, as substâncias majoritárias presentes nos exsudatos e tecidos das sementes foram caracterizadas. As sementes das espécies estudadas apresentam substâncias ativas tanto no tegumento e embrião. As sementes de S. virgata acumulam no tegumento principalmente flavonóides e proantocianidinas e provavelmente acumulam, o alcalóide sesbanimida A no embrião. As sementes de H. courbaril apresentam no tegumento grande quantidade compostos com alta polaridade. Alguns testes realizados com extratos cromatografados e revelados com vanilina sulfúrica demonstraram que existem proantocianidinas (taninos) neste tecido (dados ao mostrados), entretanto esses compostos parecem muito polimerizados, diferentemente do observado para S. virgata que contém grande quantidade de (+)-catequina livre. O embrião das sementes de H. courbaril possui grande quantidade de cumarinas, especialmente as bicumarinas, que são substâncias raras, as que atualmente têm sido estudadas devido às suas propriedades e atividade biológicas relevantes (Choudhary et al., 2006; Su et al. 2006; Borges et al., 2005; Khan et al., 2004).

Exceto a sesbanimida A, as demais substâncias isoladas das sementes desse trabalho são compostos fenólicos que são derivados da via dos fenilpropanóides. Muitos sinais trocados entre

os organismos presentes na rizosfera das raízes de plantas e sementes germinantes são derivativos dessa rota biossintética (Hirsch et al., 2003). O papel impactante sobre comunidades vegetais do flavonóide catequina foi anteriormente discutido neste trabalho. Estudos recentes mostram a dinâmica desse flavonóide em solos naturais, sendo que em alguns desses solos ele é capaz de exercer fitotoxicidade quando liberada na forma de pulsos de concentrações muito abaixo das quantidades exsudadas pelas plantas, cerca de 40 µg L -1(Inderjit et al. 2008). As cumarinas também podem ter atividade fitotóxica (Abenavoli et al., 2001, 2004).

Dessa forma, os dados sobre a fitotoxicidade dessas substâncias e a atividade antifúngica e antibacteriana de alguns dos metabólitos isolados de sementes de S. virgata e H. courbaril sugerem a que elas podem participar ativamente de eventuais interações planta-planta e planta- microrganismos que germinam em condições naturais, contribuindo para a permanência e sobrevivência de suas plântulas no meio ambiente. Adicionalmente, esse estudo abre perspectivas para novas investigações no que se refere ao entendimento de como essas substâncias podem ser reconhecidas por outras plantas e por patógenos, contribuindo para a compreensão da dinâmica, regulação e estabelecimento da rede de sinais entre diferentes plantas. Além disso, os estudos com a atividade dos oligossacarídeos de galactomanano são um exemplo de que as plantas são