Isolamento e identificação dos compostos ativos

a) Obtenção dos extratos dos exsudatos das sementes de S. virgata

Exsudatos coletados de 6000 sementes de S. virgata embebidas em água destilada por 3 dias em placas de Petri (15 cm de diâmetro) foram reunidos, liofilizados e pesados (6 g). As seis mil sementes foram removidas das placas e separadas, com o auxílio de um bisturi, em tegumento, endosperma e embrião. O material separado foi liofilizado, triturado e submetido a extrações com EtOH comercial 80% por 3 vezes (1 g para 200 mL). Os extratos etanólicos foram secos sob pressão reduzida em roto-evaporador (40 °C) e armazenados em temperatura ambiente. Extratos etanólicos também foram obtidos a partir de outras 6000 sementes de S. virgata intactas embebidas por 3 dias nas mesmas condições descritas acima. As sementes foram liofilizadas e trituradas previamente e submetidas à extração com EtOH 80%. Após secura dos extratos etanólicos das sementes intactas, das partes isoladas e dos exsudatos em roto-evaporador, os extratos secos foram retomados em 200 mL de água destilada e submetidos a partições por 3 vezes com o mesmo volume de (200 mL) Hex e posteriormente com AcOEt. As frações orgânicas foram evaporadas sob pressão reduzida em roto-evaporador (40º C). As frações aquosas foram liofilizadas, e os materiais secos obtidos foram extraídos com 200 mL de MeOH por 3 vezes. Os resíduos da extração metanólica foram armazenados a -20º C e a fração metanólica foi evaporada em roto-evaporador a 40º C (Figuras 2, 3 e 4).

b) Isolamento dos compostos ativos

A fração AcOEt (1,18 g) obtida dos exsudatos das sementes foi fracionada em coluna de gel de sílica 60 (0,063-0,200 mm) Merck (80 x 3 cm) utilizando um gradiente de MeOH e diclorometano (DCM) (0% → 100% de MeOH). A eluição foi realizada com 100 ml da mistura

dos solventes nas seguintes proporções de MeOH: 0, 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 50 e 100 %). Foram coletadas 50 frações (20 mL cada), as quais tiveram os seus perfis analisados por cromatografia em camada delgada (CCD) em placas de sílica gel 60 F254 Merck desenvolvidas em DCM: MeOH 9:1, 8:1 e 7:1 (v/v). As placas foram visualizadas sob luz ultravioleta e após análise das mesmas as 50 frações foram reunidas em 10 frações (A-J) (Figura 2). A fração H foi analisada por 1H RMN (item c) e fracionada em um sistema de cromatografia “flash” (Still et al., 1978) em coluna de gel de sílica (25 x 1cm) utilizando como solvente DCM:MeOH (9:1 v/v), sendo coletadas 28 novas frações, as quais foram analisadas novamente por CCD. A fração pura obtida (2) foi analisada por 1H RMN e por espectro de dicroísmo circular (CD) (item c).

A fração AcOEt (670 mg) obtida a partir de extratos etanólicos de sementes intactas de S.

virgata (Figura 3) também foi submetida a separação em coluna de gel de sílica (20 x 2 cm),

utilizando um gradiente de DCM e MeOH (0→100% de MeOH). A eluição foi realizada com 80 mL da mistura dos solventes nas seguintes proporções de MeOH: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30 e 100 %). Sessenta frações (15 mL) foram coletadas e agrupadas em 15 novas frações (FS1- 15), de acordo com os perfis observados por CCD desenvolvidos sob as mesmas condições descritas acima. As frações FS3, FS4 e FS7 obtidas neste processo foram analisadas por 1H RMN (item c).

c) Análises por ressonância magnética nuclear protônica (1H RMN) e espectro de dicroísmo circular (CD)

Compostos ativos presentes nas frações dos exsudatos e extratos das sementes de S.

virgata foram identificados por 1H RMN (Varian INOVA 400-MHz) utilizando MeOH deuterado (CD3OD) como solvente. A atividade óptica da substância isolada (fração 2) foi obtida por

comparações com o espectro de um padrão de (+)-catequina comercial (Sigma). Essas análises foram efetuadas na Universidade Estadual do Colorado (EUA).

d) Análises das frações por HPLC-MS

As frações obtidas dos exsudatos de S. virgata (Figura 2) foram analisadas em coluna C18 Dionex Acclaim (150 x 4,6 mm) em um HPLC-MS constituído por um sistema Dionex de cromatografia líquida de alta resolução (com detector UV- UVD170U) acoplado a um espectrômetro de massas Thermo Finnigan Surveyor MSQ. As amostras foram eluídas usando ácido acético (0,1%) em água (Eluente A) e 0,1% de ácido acético em MeOH (Eluente B) em um gradiente linear de 10% de B (3 min) até 90% de B (45 min) com vazão de 0,7 mL min -1. A detecção no ultravioleta foi de 280 nm. A ionização para as análises de espectrometria de massas foi realizada no modo positivo e negativo utilizando ionização por “electron-spray” com nitrogênio (80 psi), voltagem capilar de 3 kV e voltagem do cone de 70V.

Figura 2. Fluxograma do fracionamento e identificação de compostos ativos encontrados nos exsudatos de Sesbania virgata.

Exsudato bruto

(6g)

Partição com Hex e AcOET Liofilização Extração com MeOH

Hexano (6 mg) Acetato de etila (1,18 g) Metanol (1,5 g)

Coluna de sílica gel (DCM:MeOH) 1 H RMN A (3mg) B (24mg) C (13 mg) D (9,8mg) E (8,4mg) F (11mg) G (134mg) H (110mg) I (177mg) J (167mg) Bioensaio com Arabidopsis thaliana Frações 1...28 1

H RMN _{(cromatografia “flash”)} Coluna sílica gel

Frações 2 e 3(23 e 17 mg) CD espectro Análise por HPLC-MS Análise por HPLC-MS Bioensaio com Arabidopsis thaliana e Oryza sativa CCD CCD CCD Bioensaio com Arabidopsis thaliana 1 H RMN

Figura 3. Fluxograma do fracionamento e identificação de substâncias presentes nos extratos das sementes de Sesbania virgata.

Extrato EtOH 80% das sementes intactas

(17,27 g)

Fração aquosa

Hexano (359 mg) Acetato de etila (670 mg) Metanol (1,45 g)

Coluna de sílica gel (DCM:MeOH)

FS1 (29’mg) FS2 (17 mg) FS3 (3 mg) FS5 (4 mg) FS6 (4,5mg) FS7 (33 mg) FS8 (17,8mg) FS9 (5,2 mg) FS10 (6,6 mg) FS11 (22,7mg ) 1 H RMN FS12 (20 mg) FS13 (20 mg) FS14 (74 mg) FS15 (147mg) FS4 (22 mg) 600 mg CCD 1 H RMN Bioensaio com Arabidopsis thaliana

Evaporação sob pressão reduzida (40º C)

Partição com Hex e AcOEt Liofilização

Figura 4. Fluxograma do fracionamento dos extratos dos diferentes tecidos das sementes de

Sesbania virgata (tegumento, endosperma e embrião).

Extrato EtOH Tegumento (4 g)

Partição com Hex e AcOEt Liofilização

Extração com MeOH

Hexano (63,6 mg)

Extrato EtOH Endosperma (3,11 g)

Extrato EtOH Embrião (9 g) Acetato de etila (141,2 mg) Metanol (4,5 g) Hexano (723,6 mg) Acetato de etila (137,6 mg) Metanol (3,35g) Hexano (43,4 mg) Acetato de etila (8,2 mg) Metanol (1,65 g)

Bioensaios com Arabidopsis thaliana

6000 sementes de Sesbania virgata

Dissecção

Fração aquosa Fração aquosa Fração aquosa Evaporação do EtOH Evaporação do EtOH

Partição com Hex e AcOEt Liofilização

2.2.8 Quantificação de compostos bioativos nos tecidos e nos exsudatos das sementes durante o processo germinativo

Sementes de S. virgata (40 por placa de Petri) foram germinadas e a cada dia entre o início da embebição e término da germinação (1 a 6 dias) as sementes foram removidas das placas de Petri e seus tecidos foram separados em tegumento, endosperma e embrião e estes posteriormente, liofilizados e extraídos com EtOH 80% por três vezes (1g para 200 mL). Após evaporação do EtOH e água em roto-evaporador (40º C), os extratos foram solubilizados em 1 mL de água destilada e extraídos com 1 mL de AcOEt por 4 vezes. Após secos, os extratos foram solubilizados em MeOH e analisados por HPLC-MS (item 2.2.7 c). Os exsudatos obtidos das sementes a cada dia do processo germinativo também foram coletados, liofilizados e submetidos a extrações com AcOEt (4 vezes) e analisados por HPLC-MS (item 2.2.7 d). Os compostos foram quantificados utilizando padrões comerciais de (+)-catequina e quercetina Sigma e cromatografados em mesmas condições descritas acima.