Avaliação biológica in vitro

Nesta fase do estudo, foram avaliados os compostos 2b e 3b, assim como os seus percursores, isto é, a progesterona e o propionato de testosterona. A avaliação biológica dos mesmos pode ser dividida em dois momentos principais: os ensaios para avaliação in vitro da citotoxicidade em duas linhas tumorais e os ensaios em linha celular com sobrexpressão da P-gp, incluindo o ensaio in vitro de citotoxicidade e o ensaio de acumulação intracelular da rodamina 123, método indireto para determinar a capacidade de inibição da P-gp.

3.2.1. Avaliação in vitro da citotoxicidade

3.2.1.1. Linhas celulares e condições de cultura

A linha celular humana Prostate Cancer, 3 (PC-3), obtida de metastização óssea de um adenocarcinoma prostático de grau IV, foi adquirida à American Type Culture Collection (ATCC). É não hormono-dependente, exibindo baixa atividade da enzima 5α-testosterona redutase, o que reduz a probabilidade de interferência com os compostos em estudo, e possui um elevado potencial metastásico. As células, usadas nas passagens 37-38, foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% da mistura de antibióticos com 10000 unidades/ml penicilina G e 100 mg/ml estreptomicina (sp).

usadas nas passagens 29-30, foram cultivadas em meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-

High glucose (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de FBS e 1% de mistura de

antibióticos/antimicótico com 10000 unidades/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina e 25 µg/ml de anfotericina B (ab).

A linha celular Madin-Darby canine kidney (MDCK) tipo II transfectada com o gene humano MDR1 humano codificante da P-gp (MDCK-MDR1) corresponde a células caninas obtidas do túbulo distal renal e foi adquirida ao Netherlands Cancer Institute (Amsterdão, Holanda) e a sua utilização resultou de uma colaboração com a Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra. As células, usadas nas passagens 20-21, foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de FBS e 1% de mistura de antibióticos sp.

As células foram mantidas em frascos de cultura com área de crescimento de 75 cm2 _{a 37ºC}

em estufa com atmosfera humidificada de 5% de dióxido de carbono. O meio foi renovado a cada 2-3 dias, até se alcançar uma confluência de cerca de 85%, no caso das células PC3 e MCF-7, e de 90-95% no caso das células MDCK-MDR1. Antes da incubação dos compostos, as células viáveis foram contadas por meio de uma câmara de Neubauer, usando o reagente

trypan-blue e diluídas convenientemente em meio de cultura completo.

Os meios de cultura, o FBS, as soluções de antibióticos e o verapamilo, usado como composto de referência, foram adquiridos à Sigma-Aldrich.

3.2.1.2. Preparação das soluções de compostos

Todos os compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma Aldrich, Inc. St. Louis, USA) às concentrações de 10 mM e 5 mM e conservados a 4ºC. A partir destas soluções- mãe, foram preparadas as soluções com as concentrações em estudo, em meio de cultura completo, antes da sua incubação em cada ensaio. A concentração máxima de DMSO usada nos ensaios foi de 1%, que estudos anteriores demonstraram não ter efeitos relevantes sobre a proliferação celular (dados não apresentados).

Para os ensaios sobre as linhas celulares PC-3 e MCF-7 foram incubados os compostos 2a, 2b, 3a e 3b, nas concentrações 0,01 µM, 0,1 µM, 1,0 µM, 10 µM, 50 µM e 100 µM, de forma a

construir curvas de dose-resposta e determinar o IC50. Para os ensaios na linha celular MDCK-

MDR1 foram preparadas soluções de 10 µM e 50 µM para os compostos 1a, 2a, 2b e verapamilo, de forma a realizar-se um screening para avaliar a possibilidade de realizar o estudo de acumulação intracelular de rodamina 123 nessas células.

3.2.1.3. Ensaio MTT

A citotoxidade in vitro foi avaliada pelo método de MTT (Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, USA). Após se alcançar a confluência celular adequada, as células foram semeadas em placas de 96 poços (Nunc, Apogent, Dinamarca), colocando-se um volume de 200 µl de suspensão celular a

aderir e crescer durante 48 horas, para as PC-3 e MCF-7, e 4 dias, para as MDCK-MDR1. O seu meio foi então substituído pelas várias soluções dos compostos em estudo e incubou-se durante cerca de 48 horas, para as células PC-3 e MCF-7, e 4 horas, para as células MDCK- MDR1. Cada composto foi testado em quadruplicado e com repetições independentes e os poços com células não tratadas (apenas meio com DMSO 1%) foram usados como controlo negativo. Após o tempo de incubação, o meio foi aspirado, as células foram lavadas com 100

µl de PBS (pH 7,4; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM em água

desionizada) e 100 µl de solução de MTT (5 mg/ml), preparada em meio incompleto, foi adicionado a cada poço, incubando-se durante 4 horas a 37ºC. O meio de MTT foi então removido e os cristais de formazano formados foram dissolvidos em 200 µl/poço de DMSO, a temperatura ambiente. A absorvância foi lida a 570 nm, usando o leitor espetrofotométrico de microplacas Bio-rad xMark®. Os resultados foram apresentados como a percentagem da

viabilidade celular relativamente à do controlo não tratado, através da seguinte fórmula: [(AT

- AB) / (AC – AB)] x 100, sendo AT a absorvância do poço com composto, AC a absorvância do

controlo e AB a absorvância do branco. A comparação entre os grupos foi analisada pelo teste

t de Student, para identificar diferenças significativas entre as médias; as diferenças foram

consideradas estatisticamente significativas para um valor de p < 0,05. Os valores de IC50,

definido como a concentração de composto que inibe 50% do crescimento celular, foram determinados recorrendo ao software GraphPad Prism5, mediante cálculos de ajuste sigmóide.

3.2.2. Ensaio de acumulação intracelular da rodamina 123

As células MDCK-MDR1 foram semeadas em placa de 96 poços a uma densidade inicial de 1,3 x

104 _{células/ml e cultivadas durante 4 dias. À confluência de 90-95%, o meio foi removido, as}

células foram lavadas com 200 µl de PBS e os compostos 2a, 3a, 3b e verapamilo, nas concentrações de 10 µM e 50 µM preparados em meio incompleto, foram adicionados, seguindo-se uma incubação durante cerca de 30 minutos em estufa a 37ºC. Após esse período, foi adicionada a solução de rodamina 123 a uma concentração de 5 µM em DMSO, preparada a partir de uma solução inicial de 5 mM em DMSO (por sua vez também preparada de uma solução stock de 20 mM), e incubou-se durante 2 horas. A acumulação de rodamina 123 nas células foi então parada através de duas lavagens com PBS frio e as células foram lisadas com 100 µl de solução aquosa de Triton X-100 0,1% a temperatura ambiente. A fluorescência dos lisados foi medida através de espetrofluorímetro Spectramax Gemini XS, com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de emissão de 538 nm. As concentrações de rodamina 123 foram então determinadas pelo uso de uma reta de calibração previamente preparada com padrões de rodamina 123 (7 padrões de calibração preparados em Triton X-100 1%, com as seguintes concentrações: 0,025 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,5 µg/ml e 5 µg/ml) e comparadas com os controlos negativo (células não