Os dados relativos à identificação, à idade, ao sexo, ao fototipo cutâneo, cor dos olhos e dos cabelos, presença de sardas e nevos e o tipo de exposição solar foram obtidos no momento da aplicação do questionário específico em pacientes e controles, pelo pesquisador responsável pelo estudo (Anexo 1).
Os pacientes e controles foram classificados de acordo com o fototipo cutâneo, cor dos olhos e cor dos cabelos. O fototipo foi definido usando critérios já definidos por Fitzpatrick que considera a cor e o grau de sensibilidade da pele quando exposta ao sol. Indivíduos com fototipo I possuem pele clara, se queimam com facilidade e nunca se bronzeiam; fototipo II são indivíduos com pele clara, se queimam com facilidade e bronzeiam-se pouco; fototipo III indivíduos com pele morena, se queimam e bronzeiam-se de forma moderada; fototipo IV indivíduos de pele morena que se queimam pouco e bronzeiam-se com facilidade; fototipo V indivíduos de pele morena que se queimam pouco e sempre se bronzeiam; e fototipo VI indivíduos de pele negra que nunca se queimam quando expostos ao sol (Fitzpatrick, 1988). Foram considerados portadores de olhos claros os indivíduos com olhos azuis e verdes e portadores de olhos não claros aqueles com olhos castanhos e pretos. Foram considerados portadores de cabelos claros os indivíduos com cabelos loiros e ruivos naturais e indivíduos com cabelos castanhos e pretos naturais foram classificados como portadores de cabelos não claros (Fitzpatrick, 1988).
Foram considerados portadores de nevos aqueles com pelo menos um nevo melanocítico maior que 2 mm de diâmetro em qualquer área do corpo (exceto no couro cabeludo, púbis e região perineal, que não foram avaliadas ao exame físico). Os pacientes
foram categorizados de acordo com protocolo de identificação da International Agency for
Research on Cancer (IARC) em: sem nevos ou com poucos nevos (≤ 20), e com moderado
número de nevos ou muitos nevos (>20) (English e Mac Lennan, 1990). Foram classificados como portadores de efélides, os indivíduos que apresentam manchas hipercrômicas pequenas (até 5 mm de diâmetro) e de limites bem nítidos (Gandini et al., 2005).
Indivíduos expostos ao sol por mais de duas horas ao dia e por mais de 10 anos foram considerados expostos ao sol, sendo a exposição classificada como intermitente (exposição solar relacionada a atividades recreativas em menos de 50% na semana ou férias) ou crônica (atividade laboral ou domiciliar em mais de 50% do tempo sob a exposição solar), e sem exposição (não enquadramento nas definições anteriores) (Gordon
et al., 2015)
O diagnóstico de MC foi realizado por exame histopatológico realizado em cortes de fragmentos do tumor incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina. Os dados da localização primária (classificados em cabeça, tronco, dorso e membros), espessura de Breslow (classificados em ≤ 1,5 mm ou >1,5 mm) e níveis de Clark foram coletados do laudo do exame anatomopatológico.
O estágio do tumor foi determinado com base nos resultados obtidos do exame histológico da peça cirúrgica, dos exames de imagem e da dosagem da lactato desidrogenase (LDH). Os exames de imagem realizados foram a radiografia do tórax, ultrassonografia do abdome, ressonância magnética ou computed tomography (CT) do tórax e ou abdome, positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), e ainda ressonância magnética de crânio e cintilografia óssea em casos com suspeita clínica de infiltração de sistema nervoso central ou óssea, para a definição da presença ou ausência de metástases distantes. O estágio do tumor foi classificado de acordo com os critérios do
American Joint Comitee on Cancer (Edge et al., 2010). Essas informações foram obtidas
dos prontuários médicos pelo pesquisador do estudo.
2. Terapêutica
Ampliação de margem cutânea foi realizada quando a excisão inicial foi um procedimento apenas diagnóstico (Gillgren et al., 2011). A pesquisa de linfonodo sentinela teve indicação em pacientes com índice de Breslow maior que 1 mm, porém
não foi um procedimento obrigatório pois sua realização não melhora a curva de sobrevida específica em estudo prospectivo e randomizado (Morton et al., 2014).
O tratamento adjuvante com interferon alfa 2b (IFN alfa 2b) constitui modalidade terapêutica com questionável benefício na sobrevida global (SG) de pacientes com MC (apenas 11% de aumento) (Mocellin et al., 2010), mas com ganho real na sobrevida livre de recidiva (SLR) (aumento de 18%), especialmente em esquemas de longa duração (1 a 5 anos) e com doses intermediárias ou altas do fármaco (Mocellin et al., 2010). Por serem tratamentos com alta toxicidade, utilizamos em nosso serviço a estratégia de discutir os riscos e benefícios do tratamento adjuvante com cada paciente, cabendo uma decisão conjunta médico-paciente, sobre a sua realização. A discussão do tratamento adjuvante com IFN alfa 2b ocorreu em especial com pacientes com linfonodos acometidos ou com tumores com índice de Breslow maior que 4 mm (Kirkwood et al., 1996).
Os pacientes com metástase única ou recidiva operável foram submetidos à remoção cirúrgica com objetivo de ressecção completa do tumor (Sondak & Guibney 2014). Aqueles com recidivas inoperáveis ou com metástases múltiplas receberam a monoquimioterapia com dacarbazina (Sasse et al., 2007).
A radioterapia foi utilizada no tratamento local de pacientes com impossibilidade cirúrgica, pois apresenta pouco impacto no tratamento do MC, tendo apenas papel paliativo, principalmente em lesões com sangramentos, metástases ósseas ou cerebrais (Burmeister et al., 2012).
A SLP foi definida como a data da ampliação de margem e a data da primeira progressão ou recidiva, ou óbito de causas decorrente da doença. A SG foi definida como o intervalo entre a data do diagnóstico e a data do óbito por qualquer causa ou data do último segmento.
3. Genotipagem em larga escala (GELE)
As etapas de extração do DNA de amostras de leucócitos do sangue periférico dos pacientes e dos controles, digestão enzimática, PCR, purificação, fragmentação e marcação foram realizadas nas instalações do Laboratório de Genética do Câncer da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP.
As etapas de hibridização, lavagem e escaneamento das lâminas de microarranjos foram realizadas na plataforma de GELE da empresa Affymetrix® disponível no Laboratório Nacional de Biociências do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e
Materiais de Campinas, São Paulo; na plataforma disponível no Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento do Grupo Fleury de São Paulo, São Paulo; e no Laboratório Multiusuário de Genética Molecular do Câncer da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, de Campinas, São Paulo. A referida plataforma de GELE é composta de um forno de hibridização, estação de lavagem e escaner acoplados a um computador.
Foram utilizadas 206 lâminas (103 para pacientes e 103 para controles) com microarranjos de DNA contendo 906.000 SNPs (Genome Wide Human SNP Array 6.0) e o kit de reagentes compatíveis (Genome Wide Human SNP Nsp/Sty Assay Kit 6.0). Os procedimentos para a identificação dos SNPs foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante, descrito sucintamente abaixo.
3.1. Extração do DNA a partir dos leucócitos
O DNA genômico foi obtido de amostras de sangue periférico dos pacientes com MC e dos controles com a utilização do kit de extração de DNA QIAamp DNA Blood Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). A concentração do DNA foi determinada por meio de espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA). O DNA foi diluído em tampão TE (0,01 mM ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), 10 mM Tris HCl, pH 8,0) para 50 ng/μl e foi armazenado a -20 ºC até o próximo passo.
3.2. Digestão com a enzima StyI, ligação a adaptadores e amplificação
Os DNAs dos pacientes e controles foram submetidos à digestão com a enzima StyI para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada uma reação de 5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10X), 0,2 μl de albumina bovina sérica (BSA) (100 X, 10 mg/ml) e 1,0 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi incubadas no termociclador (Eppendorf, Hamburg, Germany) por duas horas a 37 ºC e 20 minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos com a reação de 0,75 μl de adaptador StyI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10 X) e 2,0 μl da enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores StyI foram submetidos a três PCRs realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10 X), 20 μl de potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5 mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30 segundos), a 60º C (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Foram obtidos fragmentos de 250 a 1100 pares de bases (pb). A presença dos fragmentos foi analisada por eletroforese em gel de agarose 2% (Figura 3A). Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
3.3. Digestão com a enzima NspI, ligação a adaptadores e amplificação
Os DNAs dos pacientes e controles também foram submetidos à digestão com a enzima NspI para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada uma reação de 5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10 X), 0,2 μl de BSA (100 X, 10 mg/ml) e 1 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi incubada no termociclador por duas horas a 37 ºC e 20 minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos com a reação de 0,75 μl de adaptador NspI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10X) e 2 μl da enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores NspI foram submetidos a quatro PCRs realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10X), 20 μl de potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5 mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30 segundos), a 60 ºC (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Os fragmentos de 250 a 1100 pares de bases (pb) foram analisados em eletroforese em gel de agarose 2% (Figura 3B). Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
Figura 3. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma cutâneo e controles. Produtos da amplificação dos fragmentos obtidos das digestões com a enzima StyI (A) NspI (B) de DNA genômico visualizados em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio, para a hibridização em lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA de 100 pares de bases (pb), estão representados nas colunas L. Os fragmentos de 250 a 1100 pb, que correspondem à amplificação dos fragmentos da digestão enzimática, estão representados nas demais colunas. Os resultados obtidos de controles negativos estão representados nas colunas B.
3.4. Reação dos produtos das PCRs, purificação e quantificação
Os produtos das PCRs das enzimas StyI e NspI foram misturados. A reação compreendeu 100μl do produto de cada uma das três PCRs da enzima StyI e 100 μl do produto de cada uma das quatro PCRs da NspI. Em seguida, os produtos misturados (volume final de 700 μl) foram purificados por meio do método de precipitação de ácidos nucléicos com isopropanol. A purificação consistiu na adição de 12 μl de EDTA 0,5 M em cada amostra, seguida de incubação por 10 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, foram adicionados 200 μl de acetato de amônio 7,5 M e 700 μl de isopropanol em cada amostra, em seguida, elas foram centrifugadas a 2.250 RCF (força centrífuga relativa) por 30 minutos e apenas o precipitado foi mantido. A ele, foram acrescentados 1,6 ml de etanol 75%, com posterior homogeneização e centrifugação a 2.250 RCF por 5 minutos. Após, o sobrenadante foi retirado por inversão cuidadosamente
do tubo e o precipitado de ácidos nucleicos foi ressuspenso em 55 μl de tampão de eluição, com agitação vigorosa durante 30 minutos. A concentração dos ácidos nucleicos foi determinada em espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA), por leitura da densidade óptica no comprimento de onda de 260 nanômetros. As amostras com concentrações entre 450-600 μg/μl foram armazenadas a -20 ºC até o próximo passo.
3.5. Fragmentação dos produtos das PCRs
Foram adicionados 5 μl do tampão de fragmentação aos 45uL dos produtos purificados de cada amostra. Em seguida, foram adicionados a cada amostra 14,4 μl da enzima DNase I (2,5 U), 36 μl do tampão de fragmentação e 309,6 μl de água estéril. A reação foi incubada no termociclador por 35 minutos a 37 ºC e 15 minutos a 95 ºC. A fragmentação foi observada pela presença de fragmentos menores que 180 pb em eletroforese em gel de agarose 4% corado com brometo de etídeo (Figura 4). Os fragmentos obtidos foram utilizados imediatamente.
Figura 4. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma cutâneo e controles. Produtos da fragmentação visualizados em gel de agarose corado com brometo de etídio. A reação de fragmentação foi realizada utilizados os produtos das PCRs obtidos da digestão enzimática para a hibridização em lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA de 50 pares de bases (pb), estão representados nas colunas L e na coluna B está representada a reação com água estéril, tida como controle negativo da reação. Os fragmentos menores que 180 pb, correspondem à fragmentação das amostras.
3.6. Marcação do DNA fragmentado com biotina
Inicialmente foi preparado a reação de marcação com 14 μl de tampão terminal
deoxynucleotidyl transferase (TdT) (5X), 2 μl de reagente de marcação de DNA (30 mM)
(biotina) e 3,5 μl da enzima TdT (30 U/μl). A marcação foi realizada com 53,5 μl de DNA fragmentado e 19,5 μl da reação de marcação. A reação foi incubada em um termociclador por quatro horas a 37ºC e 15 minutos a 95ºC. O DNA marcado com biotina foi armazenado a -20ºC até o próximo passo.
3.7. Hibridização
Primeiramente foi preparado a reação de hibridização com 165 μl do reagente de hibridização parte I, 15 μl do reagente de hibridização parte II, 7 μl do reagente de hibridização parte III, 1 μl do reagente de hibridização parte IV e 2 μl do reagente de controle interno (OCR 0100). Esta reação foi aquecida em termociclador a 95 °C por 10 minutos e resfriada a 49 ºC até o próximo passo. Após estes procedimentos, 200 μl da reação desnaturada foi depositada em lâminas de vidro com os oligonucleotídeos pré- arranjados. As lâminas e o material com o DNA foram hibridizados a 50 ºC durante 17 horas a 60 rpm (rotação por minuto).
3.8. Lavagens das lâminas e marcação com fluoróforos
Após as 17 horas de hibridização, as lâminas foram submetidas as sucessivas lavagens com tampão de lavagem “A”, “B” e água destilada para remoção de excesso de amostras que não se ligaram nas sondas e de reagentes. Em seguida foram realizadas as lavagens com estreptavidina e ficoeritrina (reagente de marcação 1), seguida do anticorpo biotinilado antiestreptavidina (reagente de marcação 2) e finalmente com MES (reagente de marcação 3).
As lavagens e marcações foram realizadas com a utilização da estação de lavagem
GeneChip Fluidics Station 450. As sequências de lavagens e marcações dos microarranjos
Tabela 2. Sequências de lavagens e marcações dos microarranjos contidos em lâminas por fluoróforos para a genotipagem em larga escala de polimorfismos gênicos de base única em pacientes com melanoma cutâneo e controles
Etapas Descrição
Primeira lavagem pós-hibridização Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com tampão de lavagem “A” a 25 ºC
Segunda lavagem pós-hibridização Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com tampão de lavagem “B” a 45 ºC Primeira marcação
(estreptavidina e ficoeritrina) Dez minutos em solução de marcação 1 a 25 ºC
Lavagem pós-marcação Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com tampão de lavagem “A” a 25 ºC Segunda marcação
(anticorpo biotinilado antiestreptavidina) Dez minutos em solução de marcação 2 a 25 ºC Terceira marcação
(estreptavidina e ficoeritrina) Dez minutos em solução de marcação 3 a 25 ºC
Lavagem final Dez ciclos (seis reações por ciclo) com tampão de lavagem “A” a 25 ºC
A representação esquemática da sequência de todos os passos técnicos envolvidos no procedimento está apresentada na Figura 5.
Figura 5. Representação esquemática do protocolo Affymetrix® Genome-Wide Human
SNP Array 6.0 para a genotipagem em larga-escala de pacientes com
melanoma cutâneo e controles. O DNA genômico dos indivíduos foi digerido com as enzimas StyI e NspI, em seguida, foi realizada a reação ligação de adaptadores específicos para os fragmentos obtidos após a digestão enzimática. As reações de amplificação, de mistura e purificação desses fragmentos foi seguida pela fragmentação e marcação dos fragmentos de DNA com biotina. Após, o DNA biotinilado foi hibridizado na lâmina de microarranjo seguido das etapas de lavagens, marcações com estreptavidina ligada a ficoeritrina, e leitura dos resultados por meio da captação de fluorescência pelo scanner
3.9. Captação de imagens e controle de qualidade dos experimentos
As lâminas com microarranjos foram inseridas no GeneChip Scanner 3000 7G, gerenciado pelo programa computacional GeneChip® Command Console (versão 3.2.4,
Affymetrix, Santa Clara, CA USA). As imagens geradas pela excitação dos fluoróforos
de qualidade geral (CQC), que utiliza como base os controles de qualidade dos fragmentos clivados e hibridizados das enzimas StyI (CQ StyI) e NspI (CQ NspI) e dos gragmentos totais (CQ) por meio do programa Genotyping Console (versão 4.1.3, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Só foram e serão consideradas adequadas para análise as lâminas que obtiverem taxas iguais ou maiores que 0,40 de contraste CQ.
4. Genotipagem dos SNPs
A identificação dos genótipos dos pacientes com MC e dos controles foi realizada por meio do algoritmo computacional corrected robust linear mixture model (crlmm) (Carvalho et al., 2010), disponível gratuitamente no programa Bioconductor (versão 3.3, linguagem R) (www.bioconductor.org). O algoritmo crlmm permitiu realizar o processamento das imagens obtidas, convertendo as intensidades das sondas dos microarranjos em quantidades proporcionais à quantidade de DNA de cada amostra associada com cada alelo, A e B, de cada SNP. O processamento consistiu nas seguintes etapas: 1) normalização, que permitiu ajustar e corrigir as intensidades das sondas de cada SNP, 2) sumarização, que consistiu nos valores numéricos associados à intensidade da sonda de cada SNP e 3) genotipagem, que possibilitou a identificação dos genótipos homozigoto selvagem (AA), heterozigoto (AB) e homozigoto variante (BB) (Carvalho et
al., 2010). (Carvalho et al., 2007).
5. Análises estatísticas da GELE
O significado estatístico das diferenças dos SNPs entre os grupos foi calculado por meio de modelos elásticos e da regressão logística múltipla, utilizando o algoritmo lasso
and elastic-net regularized generalized linear models (glmnet). O glmnet emprega
estratégias computacionais e estatísticas que maximizam a adequacidade de ajustes entre marcadores e informações clínicas nos diferentes grupos de pacientes e controles (Friedman et al., 2010). Para isso, utilizou-se a área sob a curva característica como estatística de adequacidade do modelo, a fim de determinar o melhor modelo preditivo. Por meio da validação cruzada, as observações disponíveis foram divididas em dois grupos: treino e teste. Com o grupo de treino, o método ajusta o melhor modelo, cujo desempenho foi avaliada no grupo de teste. Este procedimento foi repetido diversas vezes para a final determinação do modelo que melhor se adequou aos dados. As características clínicas que
foram significativas no modelo preditivo foram utilizadas como ajustes nas análises de regressão logística, considerando valores significativos P <0,01.
6. Seleção dos polimorfismos de base única
Com o intuito de restringir os SNPs identificados por meio da GELE, nós analisamos os resultados obtidos por meio dos bancos de dados Database for Annotation,
Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (Huang et al., 2009a; Huang et al.,
2009b) e do National Center for Biotechonology Information (NCBI) (Geer et al., 2010) e selecionamos apenas os SNPs localizados em genes relacionados com o processo de melanogênese.
A seguir, selecionamos os SNPs em que os genótipos dos indivíduos controles estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e cujos tamanhos amostrais calculados por normas definidas por Beiguelman (Beiguelman, 1995) tendo como base as frequências genotípicas observadas em indivíduos saudáveis do International HapMap 3 Consortium (International HapMap 3 Consortium et al., 2010), estavam disponíveis no Biorrepositório do nosso laboratório (n= 110).
Selecionamos, a seguir, apenas os SNPs que estiveram localizados em regiões regulatórias da expressão gênica. Para isso, utilizamos os programas Variant Effect
Predictor (Mclaren et al., 2010) e SNP Function Prediction (Xu & Taylor, 2009).
7. Validação dos resultados obtidos pela genotipagem em larga escala
Os resultados obtidos por meio da GELE foram validados utilizando a RT-PCR, considerado o padrão ouro para a genotipagem de SNPs. Os genótipos dos SNPs selecionados anteriormente foram obtidos por meio de ensaios para genotipagem TaqMan® (Applied Biosystems®, Carlsbad, CA, USA), de acordo com o protocolo do fabricante. Sucintamente, a RT-PCR foi realizada com a utilização de cerca de 20 ng de DNA, 0,5 µL de ensaio específico para cada SNP e 5 µL de TaqMan® Universal PCR Master Mix, que
contém a AmpliTaqGold® DNA polimerase, dNTPs e tampão com componentes otimizadores. As condições de amplificação consistiram na ativação inicial da AmpliTaq Gold® a 95 °C por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de incubação a 92 °C por 15 segundos e a 60°C por 1 minuto.
8. Análise estatística de associações de SNPs e aspectos clinicopatológicos
O teste de verificação do equilíbrio de HW foi realizado com o intuito de verificar se ocorreu distribuição preferencial de algum dos genótipos avaliados no grupo de pacientes e controles utilizados no estudo (Beiguelman, 1995).
O significado estatístico das diferenças dos SNPs entre os grupos foi calculado por meio do teste de Fisher ou χ2 e pelo modelo de regressão logística múltipla. As determinações dos riscos de ocorrência entre os grupos foram obtidas por meio das razões das chances (ORs) e calculadas considerando um intervalo de confiança (IC) de 95%. O poder da análise (PA) foi calculado a fim de verificar o tamanho do efeito mínimo suscetível de ser detectado em um estudo utilizando o tamanho amostral. Os resultados foram selecionados utilizando-se nível de significância de 5% (P< 0,05).
Os tempos de SLP e SG foram estimados por meio da curva de Kaplan-Meier e a comparação entre as curvas de sobrevida foi realizada por meio do teste de log rank. O fator prognóstico de cada variável (características clínicas e do tumor e cada SNP) foi avaliado por meio da análise univariada de Cox. Após a análise univariada, todas as características que apresentaram valore de P <0,10 foram incluídas na análise multivariada