UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CRISTIANE DE OLIVEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE SUSCETIBILIDADE HERDADA PARA O MELANOMA CUTÂNEO POR GENOTIPAGEM EM LARGA ESCALA
CAMPINAS 2017
IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE SUSCETIBILIDADE HERDADA PARA O MELANOMA CUTÂNEO POR GENOTIPAGEM EM LARGA ESCALA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências.
ORIENTADOR: PROFA. DRA.CARMEN SILVIA PASSOS LIMA COORIENTADOR: PROF. DR. GUSTAVO JACOB LOURENÇO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA CRISTIANE DE OLIVEIRA, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
CRISTIANE DE OLIVEIRAORIENTADOR: PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA COORIENTADOR: PROF. DR. GUSTAVO JACOB LOURENÇO
MEMBROS:
1. PROF. DR. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
2. PROF. DR. ROGER CHAMMAS
3. PROF. DR. SÉRGIO VICENTE SERRANO
4. PROF. DR. CARMEN SILVIA BERTUZZO
5. PROF. DR. FÁBIO ROSSI TORRES
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA Dedico este trabalho à minha amada família, pelo constante apoio e compreensão em todos os momentos. E aos pacientes que participaram da elaboração deste trabalho, por doarem um pouco de si, em momento tão delicado em suas vidas
À Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima, pela orientação, apoio, amizade, compreensão e profissionalismo, sem os quais eu não teria terminado minha dissertação.
Ao meu grande amigo e co-orientador Prof. Dr. Gustavo Jacob Lourenço pela amizade, apoio e ajuda imensurável em todas as etapas desse trabalho, principalmente por me nortear nas etapas mais difíceis.
Ao Dr. José Augusto Rinck Júnior, do ambulatório de Oncologia Clínica, e à Profa. Dra. Aparecida Machado de Moraes, do ambulatório de Dermatologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP, pelo apoio e enorme ajuda na obtenção das amostras de pacientes.
À Maria Eugênia do Laboratório de Biociências do LNSBio do CNPEN pela paciência e prontidão para me ajudar nos momentos delicados.
Ao Miguel e a Dra Maria Carolina do Laboratório de Pesquisa do Fleury pela ajuda e gentileza em disponibilizar o uso da plataforma Affymetrix.
Ao Fábio Rossi do Laboratório de Genética Molecular da FCM pela ajuda, amizade e compreensão nos momentos de grande dificuldade durante parte dos experimentos e no uso do equipamento.
Ao Dr. Benilton Carvalho pela ajuda e competência com as análises de bioinformática. À Stela, do Registro Hospitalar do Câncer, pela obtenção dos prontuários, a todos os funcionários do ambulatório de Oncologia Clínica e de Dermatologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP, pela ajuda na coleta do sangue de pacientes.
Aos meus amigos Anderson, Raquel e Alessandro pela amizade, foram fundamentais no desenvolvimento do meu trabalho, mesmo que distante.
Ao Laboratório de Genética do Câncer (LAGECA), por me proporcionar momentos únicos e de grande aprendizado profissional e pessoal, um lugar que tenho um carinho enorme que cuidei como se fosse a minha “primeira” casa e que já sinto saudades imensas.
que foram de grande valia no decorrer desse trabalho e no meu aprendizado.
Ao pessoal do LAGECA, Carla, Gabriela, Juliana, Gabriela Tortorelli, Vanessa, João Pedro, Guilherme Rossi pela ajuda e coleguismo.
Ao João pelo companheirismo, carinho e atenção especial, pela insistência em me mostrar o lado bom das coisas, por não me deixar desanimar e por me fazer acreditar que tudo dará certo (basta respirar e acreditar!)
Aos meus pais, Lourdes e Luiz, alicerces da minha existência e formação, meu porto seguro em todos os momentos; à minha avó Jovina, à minha irmã Elaine e ao meu cunhado Mendes pelo amor e apoio incondicional sem os quais eu não teria chegado aqui.
A todos os pacientes, que diante de tantos problemas, aceitaram participar deste estudo, doando um pouco de si e me permitindo mesmo que por alguns minutos ouvir e compartilhar suas histórias de vida.
Às agências de fomento FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pela concessão de bolsa (nº 2012/16617-4) e auxílio pesquisa (nº 2012/1588-3), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo auxílio Pesquisa Processo nº 479529/2012-4 e FAEPEX (Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão pelo auxílio Pesquisa Processo 191/14.
A minha eterna gratidão a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a realização, desenvolvimento e conclusão desse trabalho!
As associações de alterações genéticas herdadas, como polimorfismos gênicos de base única (SNPs) com o risco de melanoma cutâneo (MC), com suas manifestações clinicopatológicas e prognóstico de portadores do tumor não foram estabelecidas e, desta forma, estes foram os objetivos do presente estudo. O DNA genômico de sangue periférico de 103 pacientes com MC e de 103 controles foi analisado por meio de lâminas com microarranjos de DNA (SNPs). As frequências de 12.994 SNPs foram distintas entre pacientes e controles; 6.814 SNPs (52,4%) estiveram localizados em regiões regulatórias da transcrição do DNA (regiões 5’ e 3’ não traduzidas e intergênicas), 26 (0,2%) em regiões codificantes de aminoácidos, 6.042 (46,5%) em íntrons e 112 (0,9%) em regiões não identificadas. Dez SNPs localizados em regiões regulatórias da expressão de genes, relacionados com a melanogênese, WNT8B c.-101T>C (rs rs3793772), KIT c.67+12766T>C (rs2017472), GNAI1 g.80130766C>T (rs2079162), ADCY3 c.675+9196T>G (rs11900505), PLCB1 g.8908966C>A (rs4295085),
PRKCA c.205+407G>A (rs12601850), PRKCA c.288+33994A>G (rs1806448), CALM2
g.47384601A>G (rs11884600), CREB1 c.303+373G>A (rs10932201) e MITF
c.938-325A>G (rs7623610), foram considerados de interesse para o estudo e foram utilizados para a validação dos resultados obtidos na GELE por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real com ensaios TaqMan® (Applied Biosystems®). Todos os SNPs isolados e em combinações específicas de dois a dois alteraram o risco de ocorrência de MC. Os SNPs
ADCY3 c.675+9196T>G e MITF c.938-325A>G merecem destaque entre os demais. Os
genótipos isolados ADCY3 TT e MITF AA e o genótipo combinado TT+GG + AA+AG dos SNPs estiveram associados a riscos 4,86, 3,13 e 19,17 vezes maiores de ocorrência de MC do que os demais genótipos. Aos 60 meses de observação, os pacientes com o genótipo MITF AA e com o genótipo combinado ADCY3 + MITF TT+AA apresentaram menor SLP (44,5%
versus 68,2%, P= 0,007; 22,2% versus 61,3%, P= 0,006) e menor SG (67,7% versus 81,7%, P= 0,009; 44,4% versus 72,5%, P= 0,006) do que os pacientes com os outros genótipos dos
genes (Estimativas de Kaplan-Meier). Pacientes com os repectivos genótipos estiveram sob riscos 2,40 e 3,53 vezes maiores de apresentarem progressão da doença e 2,85 e 3,84 vezes maiores de apresentarem evolução para o óbito (análise univariada de Cox). Nossos resultados indicam, pela primeira vez, que SNPs em genes de melanogênese podem contribuir para identificar indivíduos com alto risco de MC e de pacientes com prognóstico desfavorável, que mereçam maior atenção na prevenção, diagnóstico precoce ou terapêutica do tumor.
Palavras chave: Melanoma, Técnicas de genotipagem, Polimorfismo genético, Melaninas, Análise de microarranjos
ABSTRACT
Combinations of inherited genetic alterations, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) in association with cutaneous melanoma (CM) risk, clinical manifestation and prognosis in patients have not been clarified. Therefore, this was the aim of the present study. Genomic DNA was extracted of the peripheral blood samples of 103 CM patients and 103 controls. Each sample was genotyped using DNA high-resolution microarrays (Affymetrix® SNP 6.0). We observed 12.994 SNPs differentially between patients and controls groups. Among them, 6.814 SNPs (52.4%) were located in regulatory regions of DNA transcription (in 3’ and 5’ untranslated), 26 (0.2%) in coding sequence of amino acids regions, 6.042 (46.5%) in introns and 112 (0.9%) unidentified regions. Ten SNPs, located in regulatory regions of gene associated with melanogenesis pathway, WNT8B c.-101T>C (rs rs3793772), KIT c.67+12766T>C (rs rs2017472), GNAI1 g.80130766C>T (rs2079162), ADCY3 c.675+9196T>G (rs11900505), PLCB1 g.8908966C>A (rs4295085), PRKCA c.205+407G>A (rs12601850), PRKCA c.288+33994A>G (rs1806448), CALM2 g.47384601A>G (rs11884600),
CREB1 c.303+373G>A (rs10932201) e MITF c.938-325A>G (rs7623610), were considered of interest
for the study and validated by polymerase chain reaction in real time using TaqMan assays (Applied Biosystems®). All SNPs isolated and combined alter the risk for CM. SNPs ADCY3 c.675+9196T>G and MITF c.938-325A>G deserves highlight. The isolated genotypes ADCY3 TT and MITF AA and TT+GG + AA+AG combined were associated with 4,86, 3,13 and 19,17-fold increased risk for CM. During 60 months of observation, patients with MITF AA genotypes and ADCY3 + MITF TT+AA combined genotypes were associated with poor progression free survival (44,5% versus 68,2%, P= 0,007; 22,2% versus 61,3%, P= 0,006) and lower overall survival (67,7% versus 81,7%, P= 0,009; 44,4% versus 72,5%, P= 0,006) than the patients with others genotypes (Kaplan-Meier estimates). Carriers of the same genotypes had 2,40 and 3,53 more chances of disease progression and 2,85 and 3,84 more chances to evolve to death, respectively (Cox univariate). Our results suggest, for the first time, that SNPs related in melanogenesis pathway may contributed for identify people with high risk for CM and patients with poor prognosis, that need to receive more attention on preventing, early diagnosis or treatment.
Key words: Melanoma, Genotyping techniques, Polymorphism, Genetic, Melanins, Microarray analysis
Figura 1. Representação esquemática da infiltração do melanoma cutâneo nas camadas da pele e critérios previamente definidos para as espessuras de Breslow e os níveis de Clark
23
Figura 2. Localização cromossômica dos genes de alta penetrância, média e baixa associados com maior predisposição ao melanoma cutâneo
31
Figura 3. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma cutâneo e controles
39
Figura 4. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma cutâneo e controles
40
Figura 5. Representação esquemática do protocolo Affymetrix® Genome-Wide Human SNP Array 6.0 para a genotipagem em larga-escala de
pacientes com melanoma cutâneo e controles
43
Figura 6. Imagem padrão gerada pela excitação dos fluoróforos contidos em lâmina de um indivíduo controle capturada por scanner para a genotipagem em larga escala
50
Figura 7. Sobrevida livre de progressão, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios clínicos
90
Figura 8. Sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
91
Figura 9. Sobrevida livre de progressão e sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G
Figura 10. Sobrevida livre de progressão, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por genótipos combinados dos polimorfismos ADCY3 e MITF, GNAI1 e
PLCB1, GNAI1 e MITF e CALM e MITF
97
Figura 11. Sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por genótipos combinados dos polimorfismos KIT e MITF e ADCY3 e MITF
98
Figura 12. Representação esquemática da via da melanogênese de acordo com as funções conhecidas ou presumidas das proteínas codificadas pelos genes polimórficos identificados neste estudo
Tabela 1. Polimorfismos de base única associados com risco de melanoma cutâneo em estudos de genotipagem em larga escala
30
Tabela 2. Sequências de lavagens e marcações dos microarranjos contidos em lâminas por fluoróforos para a genotipagem em larga escala
42
Tabela 3. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo e controles de acordo com a idade, sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cor dos cabelos, presença de sardas, presença de nevos e exposição solar
48
Tabela 4. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a localização do tumor, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios clínicos do tumor
49
Tabela 5. Regiões do DNA que albergam os polimorfimos com frequências genotípicas distintas em pacientes com melanoma cutâneo e controles
51
Tabela 6. Distribuições dos dez polimorfismos gênicos localizados em genes relacionados com a melanogênese
52
Tabela 7. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT,
GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1 e MITF,
identificados por genotipagem em larga escala e reação em cadeia da polimerase em tempo real, em pacientes com melanoma cutâneo e controles
53
Tabela 8. Teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg dos dez polimorfismos gênicos selecionados em pacientes com melanoma cutâneo e controles
55
Tabela 9. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos WNT8B c.-101T>C e KIT C.67+12766T>C em pacientes com melanoma cutâneo e controles
56
Tabela 10. Distribuições dos alelos selvagem e variante dos polimorfismos GNAI1 g.80130766C>T e ADCY3 c.675+9196T>G em pacientes com melanoma cutâneo e controles
Tabela 11. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos PLCB1 g.8908966C>A e PRKCA c.205+407G>A em pacientes com melanoma cutâneo e controles
59
Tabela 12. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos PRKCA c.288+33994A>G e CALM2 g.47384601A>G em pacientes com melanoma cutâneo e controles
60
Tabela 13. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em pacientes com melanoma cutâneo e controles
61
Tabela 14. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados
dois a dois, em pacientes melanoma cutâneo e controles
63
Tabela 15. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
66
Tabela 16. Distribuições dos genótipos do polimorfismo no gene KIT C.67+12766T>C em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
67
Tabela 17. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
68
Tabela 18. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
Tabela 19. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
70
Tabela 20. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
71
Tabela 21. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
72
Tabela 22. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
73
Tabela 23. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
74
Tabela 24. Distribuições dos genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
75
Tabela 25. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo
estratificados de acordo com o fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos e presença de efélides e nevos
Tabela 26. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
79
Tabela 27. Distribuições dos genótipos do polimorfismo KIT C.67+12766T>C em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
80
Tabela 28. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
81
Tabela 29. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
82
Tabela 30. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
83
Tabela 31. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
84
Tabela 32. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
85
Tabela 33. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
86
Tabela 34. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
87
Tabela 35. Distribuições dos genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo
estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Tabela 37. Impacto de aspectos clínicos de pacientes e biológicos do tumor na sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com melanoma cutâneo na análise univariada de Cox
92
Tabela 38. Impacto de polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3 e PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1 e MITF na sobrevida livre de
progressão e sobrevida global dos pacientes com melanoma cutâneo na análise univariada de Cox
95
Tabela 39. Associação dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados dois a dois, na
sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com melanoma cutâneo na análise univariada de Cox
99
Tabela 40. Resumos dos principais resultados de associação dos dez polimorfismos da via da melanogênese isolados no risco de ocorrência, nos aspectos clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo
100
Tabela 41. Resumos dos principais resultados de associação dos dez polimorfismos da via da melanogênese combinados no risco de ocorrência, nos aspectos clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo
ADCY3 Adenilato ciclase tipo 3
AJCC American Joint Committee on Cancer
BRAF Protoncogene B-RAF BSA Albumina bovina sérica
CALM2 Calmodulina 2
cAMP AMP ciclíco
CDKN2A Gene inibidor de ciclina dependente de quinase CQ Controle de qualidade
CREB1 Elemento de ligação 1 de AMPc
crlmm Algoritmo corrected robust linear model with maximum likelihood classification
CT Tumografia computadorizada
DAVID Database for annotation, visualization and integrated discovery DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico EDTA Ácido etilenodiamino tetracético GELE Genotipagem em larga escala
GNAI1 Proteína G sub unidade alfa i1
HCl Ácido clorídrico
kDA Kilodaltons
KIT Proto oncogene receptor de tirosina quinase
M Molar
MC Melanoma cutâneo
MC1R Receptor de melanocortina
MES Ácido 4-morpholineethanesulfonic
mg Miligrama
MITF Fator de transcrição associado a microftalmia
ml Mililitro
mM Mili molar
n Número de indivíduos
OCR Oligo control reagent
OR Risco de ocorrência
PA Poder da análise
Pb Pares de base
PCR Reação em cadeia da polimerase
PLCB1 Fosfolipase tipo 1 beta
PRKCA Proteina quinase C alfa
RAS Oncogene RAS
RCF Força centrífuga relativa
RFLP RFLP
RNA Ácido ribonucléico
RR Risco relativo
rs Número de referência do SNP
RT Tempo real
SG Sobrevida global
SLP Sobrevida livre de progressão SNP Polimorfismo de troca de base única
TdT Enzima terminal deoxynucleotidyl transferase
TE Tampão Tris EDTA
U Unidades
UV Raios ultravioleta
Wnt8B Proteína transmembrana wingless 8 beta α-MSH Alfa hormônio estimulante de melanócito
RESUMO ... 08
ABSTRACT... 09
INTRODUÇÃO... 21
1. Considerações gerais ... 21
2. Aspectos clínico patológicos ... 22
3. Aspectos ambientais e constitucionais ... 24
4. Aspectos genéticos ... 25 5. Justificativa do estudo ... 31 OBJETIVOS ... 33 PACIENTES E MÉTODOS ... 34 1. Avaliação clínica ... 34 2. Terapêutica ... 35
3. Genotipagem em larga escala ... 35
4. Genotipagem dos polimorfismos gênicos ... 44
5. Análise estatística da genotipagem em larga escala ... 44
6. Seleção dos polimorfismos gênicos ... 45
7. Validação dos resultados ... 45
8. Análise estatística de associações de SNPs e aspectos clinicopatológicos ... 46
9. Aspectos éticos ... 46
RESULTADOS ... 47
1. Avaliação clínica ... 47
2. Aspectos do tumor ... 49
3. Terapêutica dos pacientes ... 50
4. Determinação dos polimorfismos gênicos ... 50
5. Identificação dos polimorfismos gênicos por genotipagem em larga escala 51 6. Seleção dos polimorfismos gênicos ... 51
7. Validação dos resultados ... 52
8. Polimorfismos em genes da via da melanogênese em pacientes e controles 54 9. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos clínicos de pacientes 65 10. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos do tumor de paciente. 78 11. Polimorfismos em via da melanogênese e prognóstico dos pacientes ... 89
DISCUSSÃO ... 103
CONCLUSÕES ... 114
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 115
INTRODUÇÃO
1. Considerações gerais
O aparecimento de um tumor está associado com a ocorrência de alterações genéticas que se acumulam progressivamente no material genético (DNA) de uma célula normal (Wunsch Filho & Gattás, 2001). Dessa forma, o câncer é uma doença genética e a identificação e a caracterização dos genes alterados são fundamentais para a compreensão da sua fisiopatologia (Wunsch Filho & Gattás, 2001). Além disso, o aumento da expectativa de vida, a urbanização e a globalização são alguns dos fatores que podem explicar aumento de novos casos de câncer no mundo (GLOBOCAN, 2012).
O melanoma cutâneo (MC) é um tumor de baixa incidência (corresponde a 5% dos tumores de pele) mas de alta letalidade devido ao alto potencial metastático (corresponde a 60% das mortes causadas por esta neoplasia) (Instituto Nacional do Câncer, 2016). O MC resulta da transformação maligna dos melanócitos cutâneos, que são células responsáveis pela produção da melanina, pigmento protetor natural da pele, e que estão localizados na camada basal da epiderme (Slingluff et al., 2011).
A incidência do MC dobrou nas últimas décadas e aumentou rapidamente em comparação à de outros tipos de cânceres (American Cancer Society, 2011). O aumento da incidência da doença foi observado em países com população de pele clara como a Austrália, a Nova Zelândia, os Estados Unidos da América (EUA), o Canadá, e a Europa central e norte (Jemal et al., 2011; Godar, 2011). Além disso, esse aumento também foi observado na população do Brasil (Instituto Nacional do Câncer, 2016).
Estima-se que anualmente, ocorram cerca de 232 mil novos casos desse tumor no mundo, com cerca de 55 mil óbitos (GLOBOCAN, 2012). Foi estimado para o ano de 2015, nos EUA, a ocorrência de 74 mil casos novos de MC (43 mil homens e 31 mil mulheres) com cerca de 10 mil mortes (6.700 homens e 3.300 mulheres). O tumor acomete preferencialmente indivíduos caucasianos, com proporções de 1:40 em brancos, 1:200 em hispânicos e 1:1.000 em negros (American Cancer Society, 2011). Estima-se a ocorrência de 5.670 casos novos de MC no Brasil nos anos de 2016 e 2017 (Instituto Nacional do Câncer, 2016).
O MC é considerado um grave problema de saúde pública na maioria dos países do mundo, incluindo o Brasil (Instituto Nacional do Câncer, 2016). A magnitude do problema encontra-se no diagnóstico da doença em fases avançadas e, muitas vezes, com metástases, especialmente em indivíduos de classes sócio-econômicas menos privilegiadas, quando o tratamento é pouco efetivo e as chances de cura são mínimas (Livingstone et al., 2012).
2. Aspectos clínicopatológicos
O MC acomete predominantemente indivíduos com pele, cabelos e olhos claros, com incapacidade de bronzeamento, presença de efélides e nevos atípicos (Leiter et al., 2014). Portadores da síndrome xeroderma pigmentoso, caracterizada pela deficiência herdada de reparo de lesões de DNA, apresentam elevada fotossensibilidade nas regiões expostas à luz solar, tendo o câncer de pele, incluindo o MC, como consequência (Leiter et
al., 2014).
A incidência do MC aumenta com o passar dos anos, sendo 50 anos a mediana de idade ao diagnóstico (Jemal et al., 2004; Leiter et al., 2014).
O MC usualmente se apresenta como uma lesão de pele com algumas das seguintes características: assimetria, bordas irregulares, variações de cor e aumento ou regressão de tamanho ao longo do tempo (Giorgi et al., 2012). Em homens caucasianos, os locais mais acometidos de melanoma são o dorso e os membros superiores, em mulheres caucasianas, o dorso e os membros inferiores são os locais de maior exposição solar (Caini et al., 2009).
O diagnóstico do MC é realizado com a exérese da lesão e a avaliação histológica de fragmentos tumorais incluídos em parafina (Slingluff JR et al., 2011).
O crescimento vertical da lesão é o principal fator prognóstico para os portadores de MC, quanto mais o tumor se aprofunda nas camadas da pele, pior é o prognóstico (Balch et al., 2009; Mrazek & Chao, 2014). A espessura de Breslow, que corresponde à profundidade de infiltração do tumor na pele (Breslow, 1970) e o nível de Clark, que corresponde ao comprometimento das camadas cutâneas pelo tumor (Clark et al., 1969), são utilizados na rotina para avaliar o crecimento vertical da lesão.
São cinco os níveis de Clark: no nível I, as células tumorais estão confinadas à epiderme; no nível II, o tumor invade a derme papilar, atravessando a membrana basal; nível III, o tumor preenche a derme papilar e estende-se entre a derme papilar e reticular; no nível IV, o tumor invade a derme reticular e nível V, o tumor invade o tecido subcutâneo (Clark et al., 1969). São quatro as espessuras de Breslow: menor do que 0,75 mm, entre 0,76 e 1,5 mm, entre 1,51 e 4 mm e maior do que 4 mm de infiltração da pele (Breslow, 1975). Os níveis de Clark e os índices de Breslow são considerados fatores isolados de maior impacto no prognóstico dos pacientes com o tumor (Spatz et al., 2010) (Figura 1). A sobrevida global (SG) dos pacientes em cinco anos de acordo com o nível de Clark II, III, IV e V corresponde a 100%, 93%, 89% e 82%, e a sobrevida livre de doença (SLD) corresponde a 85%, 88%, 77% e 55%, respectivamente. A SG em cinco anos dos
pacientes com tumores com Breslow menor ou igual a 1,0 mm, entre 1,01 a 2,00 mm, 2,01 a 4,00 mm e maior que 4,0 mm correspondem a 97%, 94%, 86% e 78%, respectivamente, e a SLD corresponde a 94%, 87%, 72% e 62%, respectivamente (Elsaeber et al., 2012). A ulceração é um fator prognóstico importante para portadores do tumor. A frequência de ulceração aumenta conforme a espessura do tumor: em melanomas finos é de apenas 6% e em espessos pode chegar a 63%. A SG em cinco anos para pacientes com tumor ulcerado é de cerca de 66% e para aqueles com tumor sem ulceração é de cerca de 92% (Mervic, 2012). O envolvimento linfonodal também constituiu fator prognóstico para portadores do tumor, tendo influência tanto o número de linfonodos envolvidos como a forma de invasão dos mesmos, micro ou macroscópica (Paxton et al., 2011). Apenas 54% dos casos com comprometimento linfonodal pelo tumor sobrevivem por cinco anos (Elsaeber et al., 2012).
Figura 1. Representação esquemática da infiltração do melanoma cutâneo nas camadas da pele e critérios previamente definidos para as espessuras de Breslow e os níveis de Clark
O sistema de estagiamento do MC é o TNM, determinado por critérios do American
Joint Committee on Cancer (AJCC). O sistema considera a extensão do tumor na pele e
tecidos adjacentes (T) com a presença ou não de ulceração no tumor (a, b) e a identificação de metástases linfonodais (N) ou à distância (M). Dez estágios do tumor são identificados (0, Ia, Ib, IIa, IIb, IIc, IIIa, IIIb, IIIc e IV) (Balch et al., 2009; Boland et al., 2016).
A única terapêutica curativa para pacientes com o MC até o momento é a remoção cirúrgica da lesão com margens livres de tumor; a quimioterapia, a radioterapia e a
imunoterapia atuam como tratamento complementares ao cirúrgico (Testori et al., 2009; Livingstone et al., 2012; Hamid et al., 2013). Medicamentos alvo específicos, como o vemurafenibe e o mesilato de imatinibe têm indicação precisa para pacientes com mutações no gene BRAF (Chapman et al., 2011) e no gene cKIT (Carvajal et al., 2011), respectivamente. Outros medicamentos que merecem destaque, na atualidade, são aqueles que estimulam o sistema imunológico, como o anti-CTLA4 ipilimumabe (Fellner, 2012) e os antiPD1 nivolumabe isolado (Robert et al., 2015) ou associado a pembrolizumabe (Ascierto e Marincola, 2015), para que este reconheça o tumor como algo a ser combatido
3. Aspectos ambientais e constitucionais
O MC é um tumor heterogêneo, determinado pela interação entre fatores ambientais e genéticos. O principal fator de risco é a exposição solar aos raios ultravioleta A (UVA), B (UVB) e C (UVC) (Gandini et al., 2011). Os raios UV na pele induzem dano genético às células (Thompson et al., 2005). A radiação UVA corresponde a mais de 90% da radiação solar e causa dano indireto ao DNA por meio da formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) com quebras na dupla fita (Svobodova et al., 2011; Mouret et al., 2012).
As radiações UVB e UVC alteram diretamente a estrutura do DNA pela formação de dímeros de ciclobutano pirimidina e fotoprodutos de pirimidina-pirimidona (Svobodova
et al., 2011). A exposição consistente ao sol, principalmente na infância, e as queimaduras
solares em qualquer fase da vida estão associadas com maior risco de desenvolvimento do MC.
Estima-se que 65% dos tumores estão relacionados à exposição solar de alguma forma, seja crônica ou intermitente (Armstrong et al., 1993).
Outro fator de risco para o tumor é o fototipo cutâneo, que considera a coloração da pele e o tipo de reação diante da exposição ao sol. Fitzpatrick (1975 e 1988) descreveu seis fototipos cutâneos: I, pele branca, muito sensível ao sol, que nunca brônzeia; II, pele branca sujeita a bronzeado; III, pele morena clara; IV, pele morena moderada; V, pele morena escura e VI, pele negra. Indivíduos com o fototipo I têm risco 2,27 vezes maior de desenvolver o MC, enquanto que os com o fototipo II e III têm riscos de 1,99 vezes e 1,35 vezes, respectivamente (Gandini et al., 2005). Outros fatores constitucionais, como cabelos ruivos (risco 2,6 vezes maior) e loiros (risco 2,0 vezes maior) (Lotze et al., 2001), olhos azuis (risco 1,6 vezes maior) e verdes (risco 1,5 vezes maior) (Gandini et al., 2005), a presença de sardas (risco 2,0 vezes maior) (Grulich et al., 2007) e nevos congênitos
melanocíticos e displásicos (risco 6,4 vezes maior) (Ernst et al., 2014) foram também associados à ocorrência do tumor.
A proteção contra a radiação UV é feita pela melanina que previne danos ao DNA, pela absorção e espalhamento da radiação. A formação de fotoprodutos estimula a produção do alfa-hormônio estimulante de melanócito (α-MSH), que se liga ao receptor de melanocortina 1 (MC1R) nos melanócitos, com consequente aumento na produção de melanina. Esse hormônio induz o aumento da concentração de AMP cíclico (cAMP) nos melanócitos, que ativa a proteína quinase A (PKA), que desencadeia o aumento da expressão do fator de transcrição associado a microftalmia (MITF) (Prusis et al., 1997). O gene MITF é crucial na regulação de proliferação e síntese de melanina em melanócitos (Moan et al., 2014) e anormalidades nestes processos foram associados com o surgimento do MC (Hartman & Czyz, 2015).
4. Aspectos genéticos
O conceito para o risco genético de MC é dinâmico e multifacetado devido à heterogeneidade do tumor.
Anormalidades em genes específicos relacionados com a origem do MC incluem, predominantemente, as mutações gênicas (Zhang et al., 2016; Read et al., 2016).
As mutações gênicas são mudanças na sequência do DNA dos genomas nucleares e mitocondriais, variando desde uma pequena mudança, como em um único nucleotídeo, até alterações que podem afetar milhões de pares de base. Quando uma variante é tão comum que é encontrada em mais de 1% de cromossomo na população geral, a variante consitui o que é conhecido como polimorfismo genético. Em contrapartida, os alelos com frequência menor que 1% são, por convenção, chamado de variantes raras. Embora muitos tipos de mutações deletérias sejam variantes raras, não há uma simples correlação entre frequência de alelos e o efeito do alelo sobre a saúde. Muitas variantes raras parecem não ter efeitos deletérios, enquanto algumas variantes bastante comuns para serem polimórficas são conhecidas por predisporem a sérias doenças (Nussbaum, 2008).
Há vários tipos de polimorfismos que podem ser devidos a variantes que consistem em deleções, duplicações, triplicações e assim por diante de centenas de milhões de pares de bases de DNA, e não estão associados a qualquer fenótipo de doença conhecida; outras alterações de grandeza semelhante são variantes raras que claramente causam sérias doenças.
Os mais simples e mais comuns de todos os polimorfismos são os polimorfismos de troca de base única, denominado de single nucleotide polymorphisms (SNPs). Os SNPs possuem dois alelos correspondendo a duas diferentes bases que ocupam uma localização em particular no genoma (Nussbaum, 2008).
Os SNPs alteram tanto aspectos físicos, como a cor da pele, olhos e cabelos, o desenvolvimento de efélides e nevos, como aspectos metabólicos, incluindo o controle do ciclo celular, o reparo de DNA, a apoptose, a angiogênese, a capacidade de metabolizar carcinógenos e a síntese de melanina (Seal et al., 2014).
A avaliação de SNPs em pacientes com MC e controles por métodos convencionais, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de digestão enzimática (RFLP), constitui uma avaliação lenta e trabalhosa, por possibilitar a avaliação de pequeno número de variações genéticas em um estudo (Ward et al., 2012).
Com a conclusão do Projeto Genoma Humano (www.genome.gov), que possibitou o mapeamento genético, e o início do Projeto Internacional HapMap, que identificou variantes genéticas entre as pessoas (www.hapmap.ncbi.nlm.nih.gov), os pesquisadores puderam desfrutar de um conjunto de ferramentas como banco de dados de sequências do genoma humano do projeto denominado Ensembl (Herrero et al., 2016), catálogos de variações genéticas, como o GenBank (Banson et al., 2013) e um conjunto de novas tecnologias de alto rendimento de genotipagem disponibilizadas pelas empresas Affymetrix e Illumina que possibilitaram a investigação dessas variantes em diferentes populações.
Diante desse cenário, foi descrito o método de genotipagem em larga escala (GELE), que permitiu analisar centenas ou milhares de SNPs com rapidez e confiabilidade em estudo único. O método tem como base a análise de microarranjos de DNA de cada indivíduo separadamente (Mao et al., 2007; Xing et al., 2008). Com isso, estudos de associação do genoma completo permitiram a descoberta de novos marcadores genéticos associados com doenças, incluindo tumores (Waddell et al., 2008).
Além de mutações, a interação de múltiplos eventos genéticos e epigenéticos foram descritos como responsáveis pelo surgimento e agressividade do tumor (Slingluff JR et al., 2011).
Mutações em genes associados com o MC foram classificados como de alta, média e baixa penetrância, considerando a probabilidade de portadores de anormalidades genéticas desenvolverem o tumor ao longo do tempo (Read et al., 2016).
4.1. Genes de alta penetrância
Mutações genéticas podem provocar grandes mudanças na função de um gene, podendo ocasionar a inativação do gene. Quando uma mutação hereditária tem um grande efeito na função de um gene a ponto de causar uma doença ou uma alteração perceptível na maioria das pessoas que as têm, essa mutação é chamada de alta penetrância (Read et al., 2016).
Genes de alta penetrância estão relacionados com a ocorrência de melanoma hereditário, particularmente em oncogenes ou supressores tumorais, desenvolvem em idade precoce e acometem parentes de primeiro grau (Read et al., 2016).
O gene CDKN2A está localizado no cromossomo 9p21 é um gene supressor de tumor responsável por codificar a proteína p16 (Gray-Schopfer et al., 2007). A p16 é considerada inibidora específica das quinases dependentes de ciclina (CDK), CDK4 e CDK6, sendo estas as principais CDKs que se ligam às ciclinas D, colaborando no controle da transição da fase G1 para S (Gray-Schopfer et al., 2007). Deleções ou mutações pontuais no gene CDKN2A foram identificadas em linhagens celulares de melanoma, indicando a importância desse gene no desenvolvimento do tumor, inibindo o ciclo celular ou permitindo o acúmulo de danos no DNA e induzindo a proliferação celular (Goldstein
et al., 2008). Aproximadamente 20 a 40% das mutações no gene CDKN2A estão
implicadas no risco do melanoma hereditário, e as frequências dessas mutações são variáveis em diferentes populações étnicas (Barrett et al., 2015). Mutações no gene CDK4, localizado no cromossomo 12q14, impactam na mesma via de atuação do gene CDKN2A, determinando efeito oncogênico no controle do ciclo celular (Puntervoll et al., 2013)
4.2. Genes de média penetrância
Algumas mutações hereditárias não parecem afetar a função dos genes e muitas vezes não provocam alterações evidentes. Essas mutações são chamadas de média e baixa penetrância, dependo da sua frequência de ocorrência e o risco relativo associado. Essas mutações, podem afetar o risco de câncer através de efeitos sutis em determinados mecanismos, além de interagir com outros fatores de risco para doença (Read et al., 2016). SNPs em genes de média penetrância são prevalentes na população em geral, mas não conduzem ao desenvolvimento de MC de forma isolada. No entanto, a interação de vários SNPs pode aumentar o risco de ocorrência do tumor (Read et al., 2016).
Dois genes de média penetrância, o MC1R, e o MITF, relacionados com o processo de pigmentação da pele, foram associados com maior risco de MC (Read et al., 2016).
O gene melanocortin receptor gene (MC1R), codifica uma proteína receptora que tem como principal ligante o hormônio alfa estimulante de melanócitos (MSH). O α-MSH se liga ao receptor MC1R, que ativa as proteínas adenilatos ciclases, com consequente aumento dos níveis intracelulares de monofosfato cíclico de adenosina cíclicos (AMPc) (Read et al., 2016). O aumento do AMPc ativa a via de sinalização do gene MITF, que codifica um fator de transcrição associado à microftalmia, e proteínas tirosinases, que promovem a proliferação de melanócitos e a síntese do pigmento eumelanina (preto/marrom) em melanócitos (Beaumont et al., 2007). Existe um balanço na síntese dos tipos de melanina eumelanina (coloração preto/marrom) e feomelanina (coloração vermelho/amarelo) (Read et al., 2016). O aumento da síntese de eumelanina, que possui efeito protetor dos raios UV, inibe a síntese do pigmento feomelania que é pouco efetivo na proteção dos raios UV. O tipo e a quantidade de pigmento a ser sintetizado determina o fenótipo da pele (cor e sensibilidade ao sol), dos cabelos e dos olhos (Read et al., 2016). O MC1R é altamente polimórfico. Variações nesse gene foram associados com redução da capacidade de ligação do α-MSH, causando a redução dos níveis de AMPc e aumento da síntese de feomelanina e foram também associadas ao fenótipo ruivo (Beaumont et al., 2007).
O gene MITF, codifica um fator de transcrição que tem como principal função a regulação da síntese de melanina e o desenvolvimento e a diferenciação dos melanócitos (Ploper & Robertis, 2015). Esse gene é polimórfico e encontra-se hiperexpresso em 20% dos MC, particularmente em tumores metastáticos, e esteve associado também com pior sobrevida global (Hartman & Czyz, 2015).
4.3. Genes de baixa penetrância
Os genes de baixa penetrância seguem as mesmas definições dos genes de média penetrância, alterando somente as frequências e o risco relativo dessas variantes genéticas na ocorrência da doença (Read et al., 2016).
Associações de inúmeros genes de baixa penetrância como MC foram identificadas na meta-análise conduzida por Law et al. (2015). Onze estudos conduzidos por GELE em MC e controles saudáveis foram incluídos na meta-análise, sendo que sete foram previamente publicados (Bishop et al., 2009; Nan et al., 2009, Amos et al., 2011; Barrett et
foram publicados. Foram avaliados 15.990 casos de MC e 26.409 controles da Europa, Austrália e EUA. Esse estudo faz parte do GENOMEL, um consórcio sem fins lucrativos de grupos de pesquisa de todo o mundo e que tem como objetivos a identificação de genes associados com aumento do risco de MC e a interação entre genes e ambiente na ocorrência do tumor (http://www.biogenomel.eu) (Law et al., 2015).
Foram identificados na meta-análise, loci de genes relacionados com o processo de pigmentação, síntese de melanina, reparo de DNA, manutenção dos telômeros e outros mecanismos desconhecidos em associação com o risco de MC ou de suas manifestações clinicopatológicas (Tabela 1).
SNPs nos genes TERT e OBFC1, relacionados com comprimento do telômero, estiveram associados a risco de MC (Barret et al., 2011; Law et al., 2015). Os genes Agouti
signalling protein (ASIP), Tyrosinase (TYR), Tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) e Oculocutaneous albinism type II (OCA2) estão envolvidos com o mecanismo de
pigmentação; o gene ASIP codifica um antagonista do hormônio α-MSH que competitivamente se liga ao receptor MC1R, bloqueando a síntese de eumelanina (Bishop
et al., 2009; Nan et al., 2009; Amos et al., 2011; Law et al., 2015). SNPs nos genes ASIP e MC1R foram associados com o fenótipo ruivo, presença de sardas e risco de MC (Bishop et al., 2009). A proteína codificada pelo gene TYR influencia na síntese de eumelanina para
feomelanina; SNPs nos genes TYR e TYRP1 foram associados com o fenótipo de olhos claros, pele sensível ao sol e risco de MC (Bishop et al., 2009; Nan et al., 2009). SNPs localizado nos genes HERC2 ou OCA2, com papéis na pigmentação cutânea, estiveram associados a risco de MC (Amos et al., 2011; Law et al., 2015). SNPs nos genes PLA2G6,
CASP8 (Bishop et al., 2009; Barrett et al., 2011), AGR3 (Law et al., 2015) e FTO (Iles et al., 2013) foram associados com a quantidade de nevos e risco de MC. Outros quatro loci
que estão localizados os genes ARNT/SETDB1, CYP1B1, MX2 e TEMEM38B/RAD23B foram associados a risco de MC, mas por mecanismos ainda desconhecidos (Barrett et al., 2011; Mcgregor et al., 2011; Law et al., 2015).
Tabela 1. Polimorfismos de base única associados com o risco de melanoma cutâneo em estudos de genotipagem em larga escala de acordo com o gene, localização cromossômica, número de referência, risco de ocorrência, envolvimento com pigmentação, presença de nevos e seus respectivos autores
As localizações cromossômicas dos genes de alta, média e baixa penetrância envolvidos com o MC estão apresentadas na Figura 2.
Figura 2. Localização cromossômica dos genes de alta penetrância (preto), média (azul) e baixa (vermelho) associados com predisposição ao melanoma cutâneo (adaptado de Read et al., 2016.)
Até onde atinge o nosso conhecimento, estudos por GELE em MC foram conduzidos apenas em caucasianos (Law et al., 2015). É fundamental comentar que as frequências dos genótipos dos SNPs variam substancialmente em diferentes populações étnicas (Chung & Chanock, 2011) e, desta forma, suas relações com a origem ou manifestações clínicas de doenças não podem ser generalizadas para todas as populações.
5. Justificativa do estudo
O problema do câncer no Brasil ganha relevância pelo perfil epidemiológico que a doença apresenta e o número de casos aumenta a cada ano no país (INCA). É esperado o aumento no número casos de MC no estado de São Paulo e no Brasil. Merece destaque o
fato de que vivemos em país tropical, sob os efeitos intensos da radiação UV (Instituto Nacional do Câncer, 2016).
Além disso, a nossa população é altamente heterogênea e miscigenada, composta por imigrantes da Europa, Ásia e África (Mendes et al., 2010), com possíveis diferenças na suscetibilidade aos efeitos deletérios dos raios UV na pele e diferentes suscetibilidades ao MC.
Até onde atinge o nosso conhecimento, não há estudos de GELE para identificação de SNPs associados com o risco de MC na população brasileira. Assim, nos pareceu relevante identificar novos SNPs ou confirmar papéis de SNPs já identificados em outras populações em associação com o MC em nossa população.
OBJETIVOS
Avaliar pacientes com MC atendidos nos ambulatórios de Oncologia Clínica e de Dermatologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP e indivíduos saudáveis do Centro de Hematologia e Hemoterapia (HEMOCENTRO) da UNICAMP, que servirão como controles, tendo como objetivos:
Identificar SNPs envolvidos com o risco para o MC por meio de microarranjos de DNA da empresa Affymetrix®, utilizando a GELE;
Validar SNPs localizados em genes de interesse identificados no estudo por meio da técnica de PCR em tempo real (RT-PCR);
Verificar se os genótipos dos SNPs selecionados estão associados aos aspectos clínicos dos pacientes (idade, sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos, cor dos cabelos, presença de sardas, presença de nevos e tipo de exposição solar), e aos aspectos biológicos do tumor (localização, espessura de Breslow, nível de Clark e estágio TNM);
Verificar se os genótipos dos SNPs selecionados influenciam a sobrevida livre de progressão (SLP) e a sobrevida global (SG) dos pacientes com MC.
PACIENTES E MÉTODOS
Foram avaliados 103 pacientes não aparentados com MC atendidos ao diagnóstico ou durante o seguimento clínico, nos ambulatórios de Oncologia Clínica e de Dermatologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP, sob supervisão da Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima e da Profa. Dra. Aparecida Machado de Moraes. Foram excluídos os pacientes sem tumor primário definido, tumor localizado em mucosas e na região ocular, e aqueles que não aceitaram participar do estudo.
Foi também avaliado um grupo controle, constituído por 103 doadores de sangue atendidos no HEMOCENTRO da UNICAMP, pareado aos pacientes por sexo. Foram excluídos os pacientes que não aceitaram participar do estudo.
1. Avaliação clínica
Os dados relativos à identificação, à idade, ao sexo, ao fototipo cutâneo, cor dos olhos e dos cabelos, presença de sardas e nevos e o tipo de exposição solar foram obtidos no momento da aplicação do questionário específico em pacientes e controles, pelo pesquisador responsável pelo estudo (Anexo 1).
Os pacientes e controles foram classificados de acordo com o fototipo cutâneo, cor dos olhos e cor dos cabelos. O fototipo foi definido usando critérios já definidos por Fitzpatrick que considera a cor e o grau de sensibilidade da pele quando exposta ao sol. Indivíduos com fototipo I possuem pele clara, se queimam com facilidade e nunca se bronzeiam; fototipo II são indivíduos com pele clara, se queimam com facilidade e bronzeiam-se pouco; fototipo III indivíduos com pele morena, se queimam e bronzeiam-se de forma moderada; fototipo IV indivíduos de pele morena que se queimam pouco e bronzeiam-se com facilidade; fototipo V indivíduos de pele morena que se queimam pouco e sempre se bronzeiam; e fototipo VI indivíduos de pele negra que nunca se queimam quando expostos ao sol (Fitzpatrick, 1988). Foram considerados portadores de olhos claros os indivíduos com olhos azuis e verdes e portadores de olhos não claros aqueles com olhos castanhos e pretos. Foram considerados portadores de cabelos claros os indivíduos com cabelos loiros e ruivos naturais e indivíduos com cabelos castanhos e pretos naturais foram classificados como portadores de cabelos não claros (Fitzpatrick, 1988).
Foram considerados portadores de nevos aqueles com pelo menos um nevo melanocítico maior que 2 mm de diâmetro em qualquer área do corpo (exceto no couro cabeludo, púbis e região perineal, que não foram avaliadas ao exame físico). Os pacientes
foram categorizados de acordo com protocolo de identificação da International Agency for
Research on Cancer (IARC) em: sem nevos ou com poucos nevos (≤ 20), e com moderado
número de nevos ou muitos nevos (>20) (English e Mac Lennan, 1990). Foram classificados como portadores de efélides, os indivíduos que apresentam manchas hipercrômicas pequenas (até 5 mm de diâmetro) e de limites bem nítidos (Gandini et al., 2005).
Indivíduos expostos ao sol por mais de duas horas ao dia e por mais de 10 anos foram considerados expostos ao sol, sendo a exposição classificada como intermitente (exposição solar relacionada a atividades recreativas em menos de 50% na semana ou férias) ou crônica (atividade laboral ou domiciliar em mais de 50% do tempo sob a exposição solar), e sem exposição (não enquadramento nas definições anteriores) (Gordon
et al., 2015)
O diagnóstico de MC foi realizado por exame histopatológico realizado em cortes de fragmentos do tumor incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina. Os dados da localização primária (classificados em cabeça, tronco, dorso e membros), espessura de Breslow (classificados em ≤ 1,5 mm ou >1,5 mm) e níveis de Clark foram coletados do laudo do exame anatomopatológico.
O estágio do tumor foi determinado com base nos resultados obtidos do exame histológico da peça cirúrgica, dos exames de imagem e da dosagem da lactato desidrogenase (LDH). Os exames de imagem realizados foram a radiografia do tórax, ultrassonografia do abdome, ressonância magnética ou computed tomography (CT) do tórax e ou abdome, positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), e ainda ressonância magnética de crânio e cintilografia óssea em casos com suspeita clínica de infiltração de sistema nervoso central ou óssea, para a definição da presença ou ausência de metástases distantes. O estágio do tumor foi classificado de acordo com os critérios do
American Joint Comitee on Cancer (Edge et al., 2010). Essas informações foram obtidas
dos prontuários médicos pelo pesquisador do estudo.
2. Terapêutica
Ampliação de margem cutânea foi realizada quando a excisão inicial foi um procedimento apenas diagnóstico (Gillgren et al., 2011). A pesquisa de linfonodo sentinela teve indicação em pacientes com índice de Breslow maior que 1 mm, porém
não foi um procedimento obrigatório pois sua realização não melhora a curva de sobrevida específica em estudo prospectivo e randomizado (Morton et al., 2014).
O tratamento adjuvante com interferon alfa 2b (IFN alfa 2b) constitui modalidade terapêutica com questionável benefício na sobrevida global (SG) de pacientes com MC (apenas 11% de aumento) (Mocellin et al., 2010), mas com ganho real na sobrevida livre de recidiva (SLR) (aumento de 18%), especialmente em esquemas de longa duração (1 a 5 anos) e com doses intermediárias ou altas do fármaco (Mocellin et al., 2010). Por serem tratamentos com alta toxicidade, utilizamos em nosso serviço a estratégia de discutir os riscos e benefícios do tratamento adjuvante com cada paciente, cabendo uma decisão conjunta médico-paciente, sobre a sua realização. A discussão do tratamento adjuvante com IFN alfa 2b ocorreu em especial com pacientes com linfonodos acometidos ou com tumores com índice de Breslow maior que 4 mm (Kirkwood et al., 1996).
Os pacientes com metástase única ou recidiva operável foram submetidos à remoção cirúrgica com objetivo de ressecção completa do tumor (Sondak & Guibney 2014). Aqueles com recidivas inoperáveis ou com metástases múltiplas receberam a monoquimioterapia com dacarbazina (Sasse et al., 2007).
A radioterapia foi utilizada no tratamento local de pacientes com impossibilidade cirúrgica, pois apresenta pouco impacto no tratamento do MC, tendo apenas papel paliativo, principalmente em lesões com sangramentos, metástases ósseas ou cerebrais (Burmeister et al., 2012).
A SLP foi definida como a data da ampliação de margem e a data da primeira progressão ou recidiva, ou óbito de causas decorrente da doença. A SG foi definida como o intervalo entre a data do diagnóstico e a data do óbito por qualquer causa ou data do último segmento.
3. Genotipagem em larga escala (GELE)
As etapas de extração do DNA de amostras de leucócitos do sangue periférico dos pacientes e dos controles, digestão enzimática, PCR, purificação, fragmentação e marcação foram realizadas nas instalações do Laboratório de Genética do Câncer da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP.
As etapas de hibridização, lavagem e escaneamento das lâminas de microarranjos foram realizadas na plataforma de GELE da empresa Affymetrix® disponível no Laboratório Nacional de Biociências do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e
Materiais de Campinas, São Paulo; na plataforma disponível no Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento do Grupo Fleury de São Paulo, São Paulo; e no Laboratório Multiusuário de Genética Molecular do Câncer da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, de Campinas, São Paulo. A referida plataforma de GELE é composta de um forno de hibridização, estação de lavagem e escaner acoplados a um computador.
Foram utilizadas 206 lâminas (103 para pacientes e 103 para controles) com microarranjos de DNA contendo 906.000 SNPs (Genome Wide Human SNP Array 6.0) e o kit de reagentes compatíveis (Genome Wide Human SNP Nsp/Sty Assay Kit 6.0). Os procedimentos para a identificação dos SNPs foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante, descrito sucintamente abaixo.
3.1. Extração do DNA a partir dos leucócitos
O DNA genômico foi obtido de amostras de sangue periférico dos pacientes com MC e dos controles com a utilização do kit de extração de DNA QIAamp DNA Blood Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). A concentração do DNA foi determinada por meio de espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA). O DNA foi diluído em tampão TE (0,01 mM ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), 10 mM Tris HCl, pH 8,0) para 50 ng/μl e foi armazenado a -20 ºC até o próximo passo.
3.2. Digestão com a enzima StyI, ligação a adaptadores e amplificação
Os DNAs dos pacientes e controles foram submetidos à digestão com a enzima StyI para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada uma reação de 5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10X), 0,2 μl de albumina bovina sérica (BSA) (100 X, 10 mg/ml) e 1,0 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi incubadas no termociclador (Eppendorf, Hamburg, Germany) por duas horas a 37 ºC e 20 minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos com a reação de 0,75 μl de adaptador StyI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10 X) e 2,0 μl da enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores StyI foram submetidos a três PCRs realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10 X), 20 μl de potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5 mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30 segundos), a 60º C (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Foram obtidos fragmentos de 250 a 1100 pares de bases (pb). A presença dos fragmentos foi analisada por eletroforese em gel de agarose 2% (Figura 3A). Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
3.3. Digestão com a enzima NspI, ligação a adaptadores e amplificação
Os DNAs dos pacientes e controles também foram submetidos à digestão com a enzima NspI para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada uma reação de 5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10 X), 0,2 μl de BSA (100 X, 10 mg/ml) e 1 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi incubada no termociclador por duas horas a 37 ºC e 20 minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos com a reação de 0,75 μl de adaptador NspI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10X) e 2 μl da enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores NspI foram submetidos a quatro PCRs realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10X), 20 μl de potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5 mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30 segundos), a 60 ºC (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Os fragmentos de 250 a 1100 pares de bases (pb) foram analisados em eletroforese em gel de agarose 2% (Figura 3B). Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
Figura 3. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma cutâneo e controles. Produtos da amplificação dos fragmentos obtidos das digestões com a enzima StyI (A) NspI (B) de DNA genômico visualizados em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio, para a hibridização em lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA de 100 pares de bases (pb), estão representados nas colunas L. Os fragmentos de 250 a 1100 pb, que correspondem à amplificação dos fragmentos da digestão enzimática, estão representados nas demais colunas. Os resultados obtidos de controles negativos estão representados nas colunas B.
3.4. Reação dos produtos das PCRs, purificação e quantificação
Os produtos das PCRs das enzimas StyI e NspI foram misturados. A reação compreendeu 100μl do produto de cada uma das três PCRs da enzima StyI e 100 μl do produto de cada uma das quatro PCRs da NspI. Em seguida, os produtos misturados (volume final de 700 μl) foram purificados por meio do método de precipitação de ácidos nucléicos com isopropanol. A purificação consistiu na adição de 12 μl de EDTA 0,5 M em cada amostra, seguida de incubação por 10 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, foram adicionados 200 μl de acetato de amônio 7,5 M e 700 μl de isopropanol em cada amostra, em seguida, elas foram centrifugadas a 2.250 RCF (força centrífuga relativa) por 30 minutos e apenas o precipitado foi mantido. A ele, foram acrescentados 1,6 ml de etanol 75%, com posterior homogeneização e centrifugação a 2.250 RCF por 5 minutos. Após, o sobrenadante foi retirado por inversão cuidadosamente
do tubo e o precipitado de ácidos nucleicos foi ressuspenso em 55 μl de tampão de eluição, com agitação vigorosa durante 30 minutos. A concentração dos ácidos nucleicos foi determinada em espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA), por leitura da densidade óptica no comprimento de onda de 260 nanômetros. As amostras com concentrações entre 450-600 μg/μl foram armazenadas a -20 ºC até o próximo passo.
3.5. Fragmentação dos produtos das PCRs
Foram adicionados 5 μl do tampão de fragmentação aos 45uL dos produtos purificados de cada amostra. Em seguida, foram adicionados a cada amostra 14,4 μl da enzima DNase I (2,5 U), 36 μl do tampão de fragmentação e 309,6 μl de água estéril. A reação foi incubada no termociclador por 35 minutos a 37 ºC e 15 minutos a 95 ºC. A fragmentação foi observada pela presença de fragmentos menores que 180 pb em eletroforese em gel de agarose 4% corado com brometo de etídeo (Figura 4). Os fragmentos obtidos foram utilizados imediatamente.
Figura 4. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma cutâneo e controles. Produtos da fragmentação visualizados em gel de agarose corado com brometo de etídio. A reação de fragmentação foi realizada utilizados os produtos das PCRs obtidos da digestão enzimática para a hibridização em lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA de 50 pares de bases (pb), estão representados nas colunas L e na coluna B está representada a reação com água estéril, tida como controle negativo da reação. Os fragmentos menores que 180 pb, correspondem à fragmentação das amostras.
