4.3. Caracterização de P18
4.4.2. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de microdiluição em caldo
Os extratos obtidos, nas diferentes condições de cultivo, do fungo P. lilacinus e as substâncias P18 e C09 foram submetidos à avaliação da atividade antimicrobiana utilizando-se o método de microdiluição em caldo, testados a uma concentração fixa de 1000 μg/mL e 250 μg/mL, respectivamente. Foram utilizadas as bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes, as bactérias Gram-
83 negativas P. aeruginosa e E. coli, além da levedura C. albicans. Foram realizadas leituras 24 h e 48 h após a incubação das placas em estufa a 37 ºC.
Todos os extratos brutos apresentaram atividade antimicrobiana contra os micro-organismos testados (Gráficos 3 a 10).
Gráfico 3. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 4. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 S. aureus L.
monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ib iç ão Extrato 1 Extrato 3 Extrato 5 Extrato 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ib iç ão Extrato 1 Extrato 3 Extrato 5 Extrato 6
84 Gráfico 5. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 6. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ibi ção Extrato 8 Extrato 10 Extrato 12 Extrato 13 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ibi ção Extrato 8 Extrato 10 Extrato 12 Extrato 13
85 Gráfico 7. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 8. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ibi ção Extrato 1 Extrato 3 Extrato 5 Extrato 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ibi ção Extrato 1 Extrato 3 Extrato 5 Extrato 6
86 Gráfico 9. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 10. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ibi ção Extrato 8 Extrato 10 Extrato 12 Extrato 13 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% de In ibi ção Extrato 8 Extrato 10 Extrato 12 Extrato 13
87 Os resultados do presente teste diferem daqueles encontrados no teste antimicrobiano utilizando-se o método de difusão em placa com discos de papel, visto que, no último, não foi observada nenhuma atividade antimicrobiana frente às bactérias Gram-negativas testadas, P. aeruginosa e E. coli . Este fato pode ser explicado em função das diferenças dos fundamentos existentes entre as duas técnicas. O teste de difusão em placa com discos de papel é um método físico, no qual a substância ativa presente no extrato precisa sofrer difusão no meio de cultura sólido, de caráter hidrofílico, para inibir o crescimento do micro-organismo em teste. Assim, o tamanho da zona de inibição de crescimento do mesmo, não está relacionado somente com a concentração da substância ativa no extrato, mas sim, com a propriedade dela de sofrer difusão no meio. Isto significa que, quanto mais hidrossolúvel for a substância, maior a capacidade de difusão no meio de cultura, maior a interação com o micro-organismo e, por conseqüência, maior o halo de inibição de crescimento do micro-organismo. Desta forma, este método é caracterizado como um método qualitativo. Na técnica de microdiluição em caldo utiliza-se a amostra previamente solubilizada no meio de cultura, portanto a substância não necessita sofrer difusão no meio, visto que ela está solubilizada ou finamente suspendida no mesmo. Com isso, a interferência da propriedade química da substância ensaiada é menor do que no primeiro teste. Neste método considera-se a relação entre a proporção de crescimento do micro-organismo no meio líquido e a concentração da substância testada, caracterizando-se como um ensaio quantitativo.
Diante o exposto, observa-se que são vários os fatores interferentes em ambos os testes, como concentração e origem dos meios de cultura, principalmente no primeiro teste, disponibilidade de oxigênio, padronização do inóculo, condições de incubação e garantia de esterilidade do meio de cultura (PINTO et al., 2003; OSTROSKY et al., 2008).
Das substâncias testadas no teste antimicrobiano utilizando-se a metodologia da microdiluição em caldo, foi observada atividade frente às bactérias Gram-positivas, pela substância C09, como mostrado nas Tabelas que se seguem.
88 Tabela 15. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09, após 24 h do início do experimento
Amostra S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans P18 0 0 0 0 0 C09 4,3 9,4 0 0 0
Tabela 16. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09, após 48 h do início do experimento
Amostra S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans P18 0 0 0 0 0 C09 6,1 10,2 0 0 0
89 4.4.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia em camada delgada (CCD) – Método de Ellmann
A avaliação qualitativa da inibição da AchE foi realizada seguindo-se a metodologia de Ellmann, adaptada por Rhee et al. para cromatografia em camada delgada. Este método é baseado na hidrólise do ACTI pela AchE, produzindo tiocolina, que reage com DTNB originando o composto 5-tio-2-nitro-benzoato (Figura 36), que apresenta coloração amarela (SILVA, 2009). A visualização da inibição da enzima foi constatada pela formação de halos brancos, que desapareceram após 20 a 30 min da aplicação.
Figura 36. Reações envolvidas no método de Rhee (SILVA, 2009).
Os vinte e oito extratos brutos obtidos e o padrão cafeína foram testados na concentração de 10 mg/mL, sendo uma quantidade de 5 µL aplicada nas placas de testes. Do total testado, dezesseis extratos produziram halos brancos na placa, indicando atividade de inibição da enzima AchE, como mostrado na Figura 37 (A) e (B). O valor de Rf de cada amostra está indicado na Tabela 17.
90 Figura 37. (A) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos cultivados sob agitação) e (B) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos cultivados sob condição estática).
91 Tabela 17. Valores dos fatores de retenção (Rf) das substâncias ativas no teste de inibição da AchE Extrato Fator de retenção (Rf) Cultivo sob agitação Cultivo em condição estática 1 0,05 0,25 2 N.D. N.D. 3 0,05 0,20 / 0,62 4 0,23 0,20 / 0,62 5 0,05 0,20 / 0,62 6 N.D. 0,18 7 N.D. N.D. 8 0,25 0,25 9 N.D. 0,06 10 N.D. N.D. 11 0,25 N.D. 12 N.D. 0,25 13 N.D. 0,25 14 0,25 0,25
Cafeína (padrão positivo) 0,45
N.D. = Não detectado
Estes resultados foram bastante satisfatórios, sendo quase 60% dos extratos testados ativos na inibição da enzima AchE. Analisando-se a Tabela 17 pode-se perceber que, em determinados extratos, existe mais de uma substância ativa, afirmando a capacidade de micro-organismos em produzir substâncias anticolinesterásicas.
Após a triagem com os vinte e oito extratos obtidos, o extrato 8, cultivado sob condição estática, foi selecionado para produção em escala ampliada para que
92 se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e isolamento de constituintes químicos.
4.4.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca – Método de Ellmann
O teste de inibição da AchE em CCD, descrito no tópico 3.10.3, apresenta apenas caráter qualitativo. Para quantificar o valor da inibição da enzima AchE apresentado pelos extratos obtidos neste estudo, utilizou-se a metodologia de Ellmann. Portanto o critério de escolha dos extratos testados por este método baseou-se na triagem do primeiro ensaio, sendo então, dezesseis extratos ensaiados. As substâncias isoladas, P18 e C09 também foram testadas nesse bioensaio.
A primeira etapa do ensaio constituiu-se em medir a absorbância da solução (solução de trabalho + solução de ACTI + solução de DTNB + tampão Tris/HCl pH 8,0) por oito vezes, obtendo-se, assim, para cada amostra, a média de quarenta medidas de absorbância, visto que o teste foi realizado em quintuplicata. Na segunda etapa, realizada após a adição da solução da enzima AchE aos poços testes, foi mensurada a absorbância novamente, por dez vezes, resultando na média de cinqüenta medidas para cada amostra.
As porcentagens de inibição foram calculadas comparando-se as taxas das reações das amostras com a taxa de reação do controle (solvente utilizado para solubilizar as amostras) através da fórmula: % inibição = 100 - (taxa da reação amostra/taxa da reação controle x 100). Os resultados das avaliações do potencial inibitório dos extratos e das substâncias P18 e 09 de P. lilacinus estão apresentados a seguir.
93 Tabela 18. Percentual (%) de inibição das amostras no ensaio anticolinesterásico em microplaca pelo método de Ellmann
Amostra % Inibição (média ± d.p.)
01 S.A 86 ± 1,87 03 S.A 80 ± 4,0 04 S.A 85 ± 2,73 05 S.A 91 ± 2,91 06 S.A 93 ± 4,73 08 S.A 97 ± 4,68 09 S.A 78 ± 2,30 12 S.A 81 ± 0,80 13 S.A 83 ± 1,75 14 S.A 79 ± 1,60 1 C.A 92 ± 3,52 4 C.A 87 ± 2,30 5 C.A 86 ± 1,10 8 C.A 86 ± 2,13 11 C.A 92 ± 2,07 14 C.A 88 ± 2,10 P18 57,5 ± 5,50 C09 67 ± 4,0 Controle positivo (eserina) 98 ± 1,66 Controle negative 0 ± 0 *d.p.= desvio padrão
94 Gráfico 11. Percentual de inibição da enzima AchE pelos extratos, substâncias P18 e C09, eserina e MeOH
Como pode ser observado, todos os extratos ensaiados apresentaram alto potencial anticolinesterásico, visto que é descrito que extratos que apresentam porcentagens de inibição maiores do que 50% têm potencial anticolinesterásico considerado como alto e porcentagens de inibição entre 15 a 50% como de atividade moderada a baixa (SEIDL, 2010). O extrato 8 S.A apresentou a maior porcentagem de inibição, 98%, similar ao controle positivo, eserina. As substâncias isoladas P18 e C09 também mostraram significativa atividade de inibição da enzima AchE, como níveis de inibição de 57,5 e 67%, respectivamente.
Estudos realizados utilizando-se fungos como produtores de substâncias anticolinesterásicas corroboram com essa pesquisa. Os diasteroisômeros quinolactacina A1 (58) e quinolactacina A2 (59), isolados de uma cultura de
Penicillium citrinum 90648, apresentaram grande atividade inibitória da enzima AchE, sendo a quinolactacina A2, ainda, seletiva para a AchE versus butirilcolinesterase (BuchE), uma enzima semelhante à acetilcolinesterase, porém com distribuição tecidual diferente da última, e sem real função definida. (KIM et al. 2001).
Em outras pesquisas, utilizando-se culturas do fungo Aspergillus terreus, Kim e colaboradores (2002), isolaram um meroterpenóide, denominado terreulactona A (72) e, em 2005, um novo meroterpenóide foi isolado, a
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
% de inibição da enzima AchE %
95 O O R1 R2 R3 O O OH OH
isoterreulactona A (73). Ambas inibiram consideravelmente a enzima AchE, a primeira com um IC50 de 0,2 µM e, a segunda, com IC50 de 2,5 µM.
O O O O O OCH3 OH OH O O O OCH3 OH O H3CO O O 72 73
Outro estudo que apresentou resultados positivos foi o de Sunazuka e colaboradores (2004), que pesquisaram uma enorme variedade de fungos do solo, na busca por produtores de inibidores de AChE. Neste trabalho, estes autores isolaram (+)-arisugacinas A (74) e B (75), ciclofostina (76), territrems B (77) e C (78) e a ciclopenina (79), todas com satisfatório poder de inibição de AchE. As arisugacinas A e B e a ciclopenina foram seletivas, pois não inibiram a enzima BuChE. O P O CH3 O H H3CO O 76 N N O H O CH3 O 79 74 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = H 75 R1 = H, R2 = OCH3, R3 = H
77 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = OCH3 78 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = H
96
Capítulo 5
CONCLUSÃO
97 5. CONCLUSÃO
Nesse trabalho foi realizado o estudo da variação de parâmetros no cultivo do fungo filamentoso Paecilomyces lilacinus, a fim de se obter diferentes extratos brutos e testá-los quanto às atividades antimicrobiana e anticolinesterásica.
Os extratos brutos apresentaram atividade antibacteriana seletiva, no teste antimicrobiano utilizando-se o método de difusão em ágar, sendo ativos somente contra as bactérias Gram-positivas. Quando submetidos ao mesmo teste, utilizando-se a metodologia de microdiluição em caldo, todos os extratos ensaiados mostraram atividade antimicrobiana contra os micro-organismos utilizados no teste, o que é explicado pela diferença dos fundamentos entre os dois testes. O extrato 5, cultivado sob condição estática (5 S.A), foi selecionado para produção em escala ampliada para que se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e isolamento de constituintes químicos.
Dos vinte e oito extratos brutos obtidos e testados no teste de inibição da enzima AchE, utilizando-se o método qualitativo em CCD, dezesseis extratos apresentaram atividade de inibição da enzima AchE. Estes foram submetidos ao teste quantitativo de inibição da mesma enzima, e apresentaram percentual de inibição entre 78 e 97%. Em seguida às triagens, o extrato 8, cultivado sob condição estática (8 S.A), foi selecionado para produção em escala ampliada para que se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e isolamento de constituintes químicos.
Análise dos extratos brutos, por CLAE-PDA, revelou que a variação de alguns parâmetros de cultivo, como co-adição de material genético bacteriano ao meio e aeração do meio, interferiu na produção de metabólitos pelo fungo estudado, visto que os extratos obtidos deste apresentaram diferenças nos seus perfis químicos.
Do fracionamento cromatográfico do extrato 5 S.A, foi isolada a substância P18, para a qual baseando-se em dados espectroscópicos, foi proposta a estrutura química de uma δ-lactama.
Do fracionamento cromatográfico do extrato 8 S.A, foram isoladas duas substâncias, C09 e C16-P, para as quais, infelizmente, não se conseguiu dados espectroscópicos suficientes para suas respectivas caracterizações.
98 As substâncias P18 e C09 foram submetidas aos testes antimicrobianos, por ambas as metodologias citadas acima e ao teste de inibição da enzima AchE. Nos testes antimicrobianos, foi observada atividade para a substância C09, contra as bactérias Gram-positivas S. aureus, quando se utilizou a metodologia de microdiluição em caldo e L. monocytogenes, em ambas as metodologias. Em relação ao teste de atividade anticolinesterásica, ambas as substâncias apresentaram relevante atividade de inibição da enzima, com percentual de inibição de 57,5% e 67% para as substâncias P18 e C09, respectivamente.
99
Capítulo 6
REFERÊNCIAS
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