Avaliação da atividade antinociceptiva e antiinflamatória

4.8.1 NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE FORMALINA EM CAMUNDONGOS

As avaliações da atividade antiinflamatória e antinociceptiva foram realizadas em camundongos Balb-c, fornecidos pelo Biotério Central do TECPAR (Curitiba, PR).

Para a avaliação por este modelo, os animais foram pré-tratados com veículo (Controle: salina, 0,1 ml/10 g) ou EMS (30-1000 mg/kg) e FRF (3-100 mg/kg) por via oral, e após 30 min foi intraplantarmente injetado um volume de 20 L de formalina a 2,5% na superfície ventral da pata direita do animal. A resposta nociceptiva (lambida e/ou mordida da pata) foi observada em um período de tempo de 0-5 min (fase neurogênica) e de 15-30 min (fase inflamatória) após a injeção da formalina.

4.8.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LOCOMOTORA ESPONTÂNEA

Para excluir a possibilidade de prejuízo no desempenho motor dos animais após o tratamento com a substância, se avaliou a atividade locomotora espontânea no campo aberto. Este teste é realizado em uma caixa de madeira (40 x 60 x 50 cm) cujo fundo é dividido em 12 quadrados (MEOTTI et al., 2006). Para isto, 30 min antes de serem colocados individualmente nessa arena, os camundongos foram tratados com o veículo (salina, 0,1 ml/10 g, i.p.) ou EMS (300 e 1000 mg/kg, v.o.) e FRF (3 a 100 mg/kg, v.o.). O período de observação na arena foi de 6 min, sendo contado o número de quadrados cruzados com todas as patas.

4.8.3 Peritonite induzida por carragenina

A carragenina foi utilizada para produzir uma resposta inflamatória aguda na cavidade peritoneal em camundongos após 4 h, com um grande número de leucócitos no exudato e indução de estresse oxidativo. Os animais foram pré- tratados por via oral com o veículo (Controle: salina, 0,1 ml/10 g), ou com EMS (300mg/kg) ou com FRF (3, 10 e 30 mg/kg) 30 min antes da injeção de carragenina (750 g/cavidade) na cavidade peritoneal. O grupo controle recebeu apenas a injeção de salina (0,1 ml/10 g) no peritônio. Após 4h da indução da peritonite, os animais submetidos à eutanásia por inalação de CO2

e a cavidade peritoneal foi lavada com 1 mL de solução salina heparinizada (20 UI/mL), antes da coleta do líquido peritoneal a ser utilizado para posterior análise (PAGANO et al., 2002).

4.8.3.1 Contagem dos leucócitos peritoneais

O fluído peritoneal foi diluído com líquido de Türk (1:20) e a contagem de leucócitos totais realizada em câmara de Neubauer. Uma alíquota do exsudato foi citocentrifugado (citocentrífuga Cytospin Tharmac, Alemanha) e corado com May-Grünwald Giemsa para efetuar a contagem diferencial de leucócitos (MONTANHER et al., 2007).

4.8.3.2 Avaliação do conteúdo de GSH em exudato peritoneal

A determinação foi feita conforme descrito por BEUTLER et al. (1963). Resumidamente, a um tubo contendo 1,6 mL de tampão fosfato de potássio 0,2 M pH 8,0 se adicionaram 400 µL do liquido peritoneal, acrescentado-se 200 µL de DTNB 2,525 mM. Após homogeneização, a leitura foi efetuada a 412 nm (espectrofotômentro VARIAN, EUA), num tempo máximo de 2 min.

4.8.4 Alodínia mecânica induzida pelo Adjuvante Completo de Freud (CFA)

O modelo de alodínia mecânica persistente causada pela injeção intraplantar de 20 l de solução do adjuvante completo de Freund (CFA) foi utilizado para avaliar o possível efeito anti-alodínico do EMS e da FRF, evidenciando

atividade antiinflamatória em um dado período de tempo. Os camundongos foram colocados em caixas de acrílico transparente sobre uma plataforma com fundo de tela de arame durante 2 h para a aclimatização, sendo a reatividade basal ou a alodínia mecânica avaliadas pelo contato da pata traseira com filamentos de von Frey (Stoelting, Chicago, EUA), segundo o método de up and down.

Este método foi padronizado para medir (em mg) o limiar da alodínia mecânica de cada camundongo, conforme a metodologia descrita por Chaplan et al (2000). Após a aclimatização dos animais, se utilizaram uma série de filamentos de 0,008 a 6,0 g, aplicados em ordem crescente ou decrescente para determinar 50% do limiar de retirada da pata (limiar 50%). O primeiro filamento da série testado foi o de 0,4 g na pata posterior direita, sendo realizadas 6 avaliações em intervalos de 10 s. A ausência de resposta indicava a utilização de um filamento de maior massa e assim sucessivamente. Com a retirada ou lambida da pata pelo animal, um filamento de menor massa foi aplicado em intervalos de 2 min. O limiar de retirada da pata (50% do limiar) foi calculado segundo a fórmula de Dixon. No dia anterior à aplicação de CFA, foi avaliada aresposta basal de todos os animais. Após 24 h da injeção do CFA, verificou-se o aparecimento da alodínia mecânica e os animais foram avaliados 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 e 12 h após o tratamento com 300 mg/kg EMS, e 30 mg/kg de FRF, além do veículo (decurso temporal). Nos dias subsequentes, a avaliação foi realizada 2 h após o tratamento, sendo que no 2° e 3° dias, todos os grupos foram avaliados quanto a reatividade ao calor e ao frio. Entre o 6º e 9º dias, não se efetuou nenhum tratamento, visando a reversão de um possível efeito de tolerância.

4.8.4.1 Nocicepção induzida pelo estímulo térmico

Os animais foram submetidos a testes de placa quente para avaliar o possível efeito antinociceptivo da FRF sobre as respostas nociceptivas induzidas pelo calor nocivo (placa quente) e a sensibilidade ao frio (teste de acetona).

O teste de placa quente foi realizado como descrito por Woolfe e MacDonald (1944) com algumas modificações, utilizando um aparato que compreende uma superfície metálica a 50 ± 1°C, circundada por um cilindro transparente (24 cm de diâmetro, Ugo Basile, modelo DS37). Cada animal foi colocado

individualmente dentro do cilindro, cronomentrando-se o tempo no qual o animal sacudiu ou lambeu a pata ou pulou. Isto foi marcado como índice de latência de resposta térmica.

Os animais controle e tratados intraplantarmente com CFA a 80% foram pré- testados para se obter o valor de latência basal. Um tempo de corte de 30 s foi utilizado para minimizar danos ao tecido. Após 30 min, os animais foram tratados com o veículo (Controle: salina, 0,1 ml/10 g, v.o.), ou FRF (30 mg/kg, v.o.). O teste foi realizado após 30 min. O tempo de permanência dos animais foi convertido em percentuais, através da fórmula:

Onde: porcentagem máxima de efeito (PME%), corresponde a diferença entre o tempo final (TF) e o tempo basal (TB), dividido pela diferença entre o TB e o limite máximo de exposição (30 s), vezes 100.