MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação da composição química, atividade antioxidante, antibacteriana, antinoceptiva, antiinflamatória e toxicidade do extrato metanólico e
frações de folhas de Spondias sp. (Anacardiaceae)
GABRIEL ARAUJO DA SILVA
ORIENTADORA:PROFª.DRª.MARIA DAS GRAÇAS ALMEIDA CO-ORIENTADOR: PROFº DRº JORGE ALBERTO LÓPEZ RODRÍGUEZ
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS LABORATÓRIO MULTIDISCIPLINAR DE PESQUISA
Avaliação da composição química, atividade antioxidante, antibacteriana, antinoceptiva, antiinflamatória e toxicidade do extrato metanólico e
frações de folhas de Spondias sp. (Anacardiaceae)
GABRIEL ARAUJO DA SILVA
Dissertação submetida ao programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADORA:PROFª.DRª.MARIA DAS GRAÇAS ALMEIDA CO-ORIENTADOR: PROFº DRº JORGE ALBERTO RODRÍGUEZ LÓPEZ
GABRIEL ARAUJO DA SILVA
Avaliação da composição química, atividade antioxidante, antibacteriana, antinoceptiva, antiinflamatória e toxicidade do extrato metanólico e
frações de folhas de Spondias sp. (Anacardiaceae)
COMISSÃO JULGADORA DISSERTAÇÃO
___________________________________________________ Profª. Drª. Maria das Graças Almeida
Presidente-UFRN
___________________________________________________ Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel
Examinador Interno-UFRN
____________________________________________________ Profº Drº Ullysses Paulino Alburquerque
Examinador Externo-UFRPE
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que ajudaram para o êxito da realização deste trabalho, e especialmente:
À Deus, por possibilitar a existência e sempre nos dar a força para superar desafios.
À Mainha, Elenilda S. A. da Silva [Bebel], e a Painho, Wanderley P. da Silva, pelo apoio e dedicação, e pelo espírito de sempre que se dedicar a algo, ter a perfeição como meta, mesmo se às vezes, utópica.
Ao meu irmão, Filipe A. da Silva, pelos muitos momentos de conversa descontraída acerca das mil e uma invenções na realização deste trabalho, o qual não entendendo de química, farmácia ou produtos naturais, se manteve atento e com a curiosidade herdada de nosso pai me arguia sobre os resultados.
À Profª. Drª. Maria das Graças Almeida, pela orientação e confiança incondicional em aceitar-me como aluno, mesmo com a convivência de apenas quatro dias. E, pelo exemplo de postura, profissional e pessoal, sempre com seriedade e hombridade nos seus atos e feitos.
Ao Prof. Dr. Jorge A. López pela orientação, incentivo e visão ampla, além da amizade e ajuda durante todo o árduo trabalho para a elaboração desta dissertação. Sempre com a idéia de que “nenhum mestre sabe o suficiente,
que nunca poderá ser aluno novamente.”
À coordenação do curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, professores, Prof. Dr. Arnóbio Antonio da Silva Júnior e Profa. Dra. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas.
Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas na pessoa da Prof. Dr. Telma Maria Moura de Araújo Lemos pelo apoio e ajuda na medida de suas possibilidades.
As minhas amigas Suzane Guimarães Cairo e Monaliza L. Maia, por muitas idas e vindas por essa cidade, e por me apresentarem o que há de melhor em Natal, meu muito obrigado, vocês me fizeram discutir sobre literatura, música,
cinema, bobagens, evitando a “inevitável” mania de só falar sobre farmácia.
Aos meus amigos e funcionários do Biotério Central do CCS, Ana Auxiliadora Fernandes de Vieira e Washington Fernandes da Rocha, pela amizade desenvolvida e, pelo exemplar cuidado com os animais, os meus sinceros agradecimentos.
Às Profª Drª. Alessandra Silva Guedes e Profa. Drª. Sibele Oliveira Tozetto, pela oportunidade de realizar minha primeira iniciação cientifica, mostrando-me que experimentar e descobrir são possíveis.
A todos do Laboratório de Fitoquímica da UFPR, em especial ao Prof. Obdúlio Gomes Miguel, Milena Kallegari, Ranieri Oliveira Campos e Vanessa Canteli, que possibilitaram o uso do RMN e os processos de fitoquímica realizados neste trabalho.
Ao Prof. Adair Roberto Santos, e todos do Laboratório de Neurobiologia da dor e inflamação, do Centro de Ciências Biológicas, UFSC, que permitiram as avaliações antinociceptiva e antiinflamatória, e aos encontros descontraídos no Iega. Meu muito obrigado à Fernanda, Deiselene, Morgana, Gaucho, Leide, Franscinete, Eimael, Franscinelson, Daniel, Wladimir, Marinete, Serginho. A CAPES pelo apoio financeiro, disponibilizando bolsa de mestrado desde o início deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (MCT/CNPq), que por meio do fomento possibilitou a realização dos experimentos da parte experimental deste trabalho. Nossos sinceros agradecimentos por confiarem no nosso êxito.
A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para este trabalho, meus sinceros agradecimentos.
“Pipas sobem mais alto contra o vento, não com ele.”
RESUMO
Spondias sp. (Anacardiaceae), popularmente conhecida como cajá-umbu, é
uma planta endêmica do Nordeste do Brasil, onde as suas folhas são largamente usadas na medicina popular no tratamento de processos inflamatórios, enquanto os seus frutos possuem grande potencial agro-industrial. O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades hepatoprotetora, antioxidante, antibacteriana, antinociceptiva, antiinflamatória, além da toxicidade aguda e 28 doses repetidas, usando um extrato metanólico (EMS), uma fração rica em flavonóides (FRF) e um precipitado obtidos de folhas de de
Spondias sp. A atividade antioxidante dos mesmos foi avaliada para determinar
a capacidade de sequestro do radical livre DPPH, enquanto que MES e e FRF foram utilizados para avaliar a capacidade hepatoprotetora em lesões induzidas por tetracloreto de carbono (CCl4). Sete grupos (n=5) de ratas Wistar foram usados como se segue: grupo de controle, grupo intoxicado com CCl4- tratado com EMS (500 mg/kg) durante 7 dias, três grupo intoxicado com CCl4 tratados com o FRF (25, 50 e 75 mg/kg) durante 7 dias e o grupo intoxicado com CCl4 tratado com Legalon® (silimarina, fitoterápico de referência). EMS e FRF apresentaram ação protetora contra o dano hepático induzido por CCl4, ao ser observada a redução significativa da atividade enzimática de marcadores séricos (alanina transaminase e aspartato transaminase). Além disto, a redução da peroxidação lipídica, o aumento do conteúdo de glutationa e da atividade enzimática do sistema de defesa de antioxidante (SOD, CAT, GPx), comparáveis aos valores normais, indicaram a capacidade de MES e FRF de restaurar o desequilíbrio oxidativo induzido por CCl4. A análise histological confirmou a hepatoproteção, em comparação às modificações degenerativas no grupo tratado com CCl4. Este efeito hepatoprotetor foi análogo ao mostrado pelo Legalon®. A alta capacidade de antioxidante in vitro do extrato (93.16 ±1.00 %) foi similar à obtida com Carduus marianus e BHT (padrões de
referência), fato este que explica os resultados obtidos in vivo. Nenhuma
atividade antibacteriana foi detectada, porém, EMS e FRF promoveram o efeito antinociceptivo induzido na segunda fase da injeção intraplantar de formalina, evidenciando a ação antiinflamatória; confirmado pelo modelo de peritonite induzida por carragenina. A avaliação da alodinia mecânica (CFA a 80%) demonstrou o envolvimento da composição química de Spondias sp. na
atividade anti-inflamatória em relação aos processos agudos. A exposição aguda e dose repetida durante 28 dias não produziram mudanças significativas nos parâmetros que avaliaram a toxicidade. Os resultados experimentais, revelaram que extratos de folhas de Spondias sp. possuem um potencial
promissor na área farmacêutica e face à sua atoxicidade apresentam eficiência e segurança.
Palavras-chave: Spondias sp., fitoquímica, atividade farmacológica, toxicidade,
ABSTRACT
Spondias sp. (Anacardiaceae), popularly known as cajá-umbu, is an endemic
plant from Northeastern Brazil, where their leaves are widely used in folk medicine to treat inflammatory processes, while their fruits have a great agro industrial potential. This study was designed to evaluate hepatoprotective, antinociceptive, antioxidant, antimicrobial and anti-inflammatory properties, as well as the acute toxicity and repeated dose 28, using a methanolic extract (MES), a fraction rich in flavonoids (FRF) and a precipitate from Spondias
sp.leaves. The antioxidant activity of them was valued to evaluate their free radical scavenger capacity by DPPH test, whereas MES and FRF were used to evaluate while the preventive action on carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatotoxicity. Seven groups (n=5) of female Wistar rats were used as follows: control group, CCl4-intoxicated group treated with EMS (500 mg/kg) for 7 days, three CCl4-intoxicated groups treated with FRF (25, 50 and 75 mg/kg) for 7 days and the CCl4-intoxicated group treated with Legalon ® (silimarina; (phytotherapeutic reference) (50 mg/kg; 7 days). MES and FRF showed a protective action against liver injury induced by CCl4, being observed a significant reduction of serum enzyme activity marker of liver damage (alanine transaminase and aspartate transaminase). On the other hand, the lipid peroxidation (SRAT) decrease, as well as the increase of glutathione content and enzyme activity of antioxidant defense system (SOD, CAT, GPx) toward near normal values indicated the ability of EMS to restore the oxidative imbalance induced by CCl4. The histological analysis confirmed the hepatoprotection, compared to degenerative changes in CCl4-treated group. This hepatoprotetor effect was similar to that shown by Legalon®. The in vitro
high antioxidant capacity of extract (93.16 ± 1.00%) showed analogous results to those obtained by Carduus marianus BHT (reference standard). This fact explains the obtained results in vivo. Although no antimicrobial activity was
detected, EMS and FRF promoted the antinociceptive effect induced in the second phase by the intraplantar formalin test, evidencing the anti-inflammatory action; confirmed by the carrageenan-induced peritonitis model. The evaluation of the mechanical allodynia (CFA a 80%) demonstrated the involvement of the
Spondias sp. chemical composition in the anti-inflammatory activity toward the
acute processes. The acute exposure and repeated dose during 28 days did not produce significant changes in the parameters that evaluate toxicity. Together the experimental results reveal, that Spondias sp. leaf extracts have a
promising potential in pharmaceutical area, and due to its non-toxic condition present efficiency and security.
LISTA DE ABREVIATURAS
1O2 Oxigênio singlet ALP Fosfatase Alcalina ALT Alanina transaminase AST Aspartato transaminase BHT Butil Hidroxitolueno BT Bilirrubina Total
CAT Catalase
CCl3- Tricloreto de Carbono CCl4 Tetracloreto de carbono CFA Adjuvante completo de Freud DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil DTNB 5,5‟ditiobis, 2-nitrobenzóico ERN Espécies Reativas do Nitrogênio ERO Espécies Reativas do Oxigênio
FRF Fração Rica em Flavonóide (Flavonoid rich-fraction) H2O2 Peróxido de hidrogênio
GPx Glutationa peroxidase GR Glutationa Redutase GSH Glutationa reduzida GSSG Glutationa oxidada
LH Ácidos Graxos Poliinsaturado L• Radical lipídico
LOO• Radical Peroxil
LOOH Radical hidroperóxido LO• Radical Alcooxil MDA Malondialdeído O2 Oxigênio Molecular
O2•¯ Radical Anion Superóxido •OH Radical hidroxil
SME Spondias sp. Methanolic Extract
SOD Superóxido Dismutase
SRAT Substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico SRL Sequestro de Radical Livre
TBA Ácido Tiobarbitúrico
TBAR Thiobarbituric acid Reactive Products TCA Ácido Tricloroacético
LISTA DE FIGURAS
Figura pág.
01 Detalhes da exsicata de Spondias sp. depositada no
Herbário da Faculdade de Tecnologia e Ciências –
Departamento de Biologia – Campus Salvador.
21
02 Cajá-umbu (Spondias sp.) Linn. (EMBRAPA) A. detalhes
dos frutos maduros, e B. galhos de cajá-umbuzeiro. 22 03 Peroxidação Lipídica (Adaptado LOUREIRO et al., 2002). 26
04 Detoxificação enzimática realizada pela CAT e GPx 28 05 Estrutura do -tocoferol (BRITO, 2009) 30 06 Estrutura base dos flavonóides (TIWARI, 2001). 34 07 Mecanismo de sequestro das ERO (R•) por flavonóides,
com formação de estrutura estável (Adaptado de HEIM, 2002).
35
08 Esquema do processo de partição do extrato metanólico (EMS) de Spondias sp. para obtenção das frações
semi-purificadas. (adaptado de CAJUEIRO et. al, 2008)
42
09 Teor extrativo total obtido por maceração durate intervalos de tempo de 1 à 7 dias de um grama de massa seca vegetal em etanol (EtOH) ou metanol (MetOH) na proporção 1:5.
60
10 Gráfico de calorimetria exploratória diferencial (DSC) do
padrão de rutina e do composto isolado. 61 11 Espectros de UV, varredura de 200 – 500 nm, do composto
isolado (A), composto isolado + AlCl3 (B), composto isolado + AlCl3 + HCl (C), rutina padrão (D), rutina padrão + AlCl3 (E) e rutina padrão + AlCl3 + HCl (F).
62
12 Estrutura química da rutina 66
13 Varredura espectral em 2D e 1D dos marcadores 67 14 Análise cromatográfica exploratória dos nove padrões,
eluição de 5-50% de fase B, fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 10 uL e detecção a 254 nm. Fase A:água acidificada, pH 3,0, acido formico e Fase B: Acetonitrila.
68
15 Análise cromatográfica dos nove padrões e extrato bruto de
Spondias sp. , eluição por gradiente, fluxo de 1,3 mL/min,
volume de injeção de 9 uL e detecção a 280 nm. Fase A:água acidificada, pH 3,0, acido formico, e Fase B: Acetonitrila.
16 Análise de pureza de pico dos nove compostos. Área verde:
pura; área amarela: parcialmente pura e vermelha: impura. 70 17 Histopatologia de fígado murino (Hematoxilina e Eosina).
Dos diferentes grupos testados. 80
18 Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre as concentrações de SRAT em homogenato de fígado de animais intoxicados com CCl4.
81
19 Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre o conteúdo de GSH em homogenato de fígado de animais intoxicados com CCl4.
82
20 Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre a atividade catalásica em homogenato de fígado de animais intoxicados com CCl4
85
21 Efeito do EMS e FRF sobre a nocicepção induzida por
formalina 3,5% em camundongos. 89
22 Efeito do EMS e FRF sobre a atividade locomotora
espontânea em camundongos. 90
23 Efeito do EMS e FRF sobre a migração de leucócitos totais (painel A), e neutrofilos (painel B) induzida pela carragenina (750 ug/cavidade) por 4 h.
92
24 Efeito do tratamento com FRF sobre o conteúdo de GSH em exudato peritonial de camundongos pré tratados com carragenina
93
25 Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida por capsaicina
(5,2 nmol/pata) em camundongos. 94
26 Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida por
cinamaldeído (10nmol/pata) em camundongos. 94 27 Efeito do tratamento com EMS (300 mg/kg) e FRF
(30mg/kg) sobre a alodinia mecânica induzida pela injeção intraplantar de CFA em camundongos.
96
28 Efeito do tratamento com FRF (30mg/kg) sobre a sensibilidade na placa quente (56ºC) em camundongos com dois dias de inflamação crônica induzida por CFA.
97
29 Efeito do tratamento com FRF (30mg/kg) sobre a sensibilidade ao frio (0,2 ml/pata de acetona) em camundongos com três dias de inflamação crônica induzida por CFA.
97
30 Grafico de acompanhamento do consumo de água, ração e peso corporeo dos animais controle e tratados com dose única de SEM 2000 mg/kg, no periodo de 14 dias.
98
31 Gráfico de acompanhamento do consumo de água, ração e peso corporêo dos animais controle e tratados com doses de EMS 500 mg/kg, no período de 28 dias.
LISTA DE TABELAS
Tabela pág.
01 Espécies do gênero Spondias distribuídas no Brasil 20
02 Bioatividade atribuídas a espécies da família anacardiácea 22 03 Esquema do gradiente de eluição estabelecido para
separação dos compostos fenólicos.
45
04 Deslocamentos Quimicos (ppm) de RMN-13C e RMN-1H do composto isolado, padrão rutina e lituratura.
65
05 Ensaios de validação segundo a RE nº 899 72
06 Capacidade sequestradora de 50% dos radicais livres, em µg/mL, dos padrões e dos extratos aquoso, etanolico e EMS, e frações.
75
07 Parâmetros bioquímicos de avaliação de lesão e função hepática nos animais dos diferentes grupos experimentais
78
08 Atividade das enzimas SOD e GPx em homogenato de fígado dos animais dos diferentes grupos experimentais.
86
09 Determinação da atividade antibacteriana do extrato bruto e das frações contra as cepas testadas.
87
10 Parâmetros hematológicos e bioquímicos dos animais controle e tratados com dose única de EMS 2000 mg/kg e 28 doses de 500 mg/kg de EMS.
SUMÁRIO
Pág.
1. Introdução 17
2. Revisão de literatura 20
2.1 Levantamento botânico 20
2.2 Atividades Farmacológicas 22
2.3 Estresse oxidativo 23
2.3.1 Espécies reativas de oxigênio 23
2.3.2 Peroxidação Lípidica 25
2.3.3 Sistema de defesa antioxidante 26
2.3.4 Antioxidantes Naturais 29
2.4 Atividade antibacteriana 31
2.5 Inflamação 32
2.6 Dor 33
2.7 Composição Química 34
2.7.1 Flavonóides 34
2.8 Avaliação toxicológica 36
3. Objetivo 38
3.1 Objetivo Geral 38
3.2 Objetivos Específicos 38
4 Metodologia 41
4.1 Material Vegetal 41
4.2 Otimização do processo extrativo 42
4.3 Obtenção do Extrato Metanólico, das frações e isolado de folhas Spondias sp.
42
4.4 Caracterização da Composição Química dos Extratos e
isolado 44
4.4.1 Determinação de polifenólicos 44
4.4.2 Espectrofotometria UV 44
4.4.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) 44 4.4.4 Ressonância Magnética Nuclear 13C e 1H 45 4.4.5 Desenvolvimento e validação de método analítico por
4.5 Determinação da capacidade antioxidante in vitro 47
4.5.1 Capacidade de SRL pelo Teste do DPPH 47
4.6 Determinação da capacidade antioxidante in vivo 47
4.6.1 Animais 47
4.6.2 Desenho experimental 48
4.6.3 Avaliação Bioquímica 48
4.6.4 Coleta e Processamento das amostras 49
4.6.5 Preparo do homogenato de Fígado 49
4.6.5.1 Determinação de SRAT 49
4.6.5.2 Determinação da glutationa 50
4.6.5.3 Determinação da atividade da CAT 50
4.6.6 Análise histopatológica 50
4.7 Ensaios Antimicrobianos 51
4.7.1 Difusão em Agar 51
4.7.1.1 Preparo das amostras 51
4.7.1.2 Preparo dos discos 51
4.7.1.3 Meio de cultura 52
4.7.1.4 Preparo do inoculo 52
4.7.1.5 Teste da atividade antibacteriana 52
4.8 Avaliação da atividade antinociceptiva e antiinflamatória 53 4.8.1 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de Formalina
em camundongos 53
4.8.2 Avaliação da atividade locomotora espontânea 53
4.8.3 Peritonite induzida por carragenina 54
4.8.3.1 Contagem de leucócitos peritoneais 54
4.8.3.2 Avaliação do estresse oxidativo (GSH) 54
4.8.4 Alodínia mecânica induzida pelo CFA 54
4.8.4.1 Nocicepção induzida pelo estímulo térmico 55
4.9 Ensaios toxicológicos 56
4.10 Análise estatística 57
5 Resultados e discussão 59
5.1 Otimização do Processo Extrativo 59
5.2 Caracterização da composição química 60
5.2.1 Concentração de polifenólicos 61
5.3 Desenvolvimento de método analítico por CLAE-DAD 66 5.3.1 Espectros de varredura para os padrões 66 5.3.2 Análise dos padrões durante o gradiente exploratório 68 5.4 Validação de método analítico por CLAE-DAD 70
5.4.1 Parâmetros analíticos de validação 70
5.5 Aplicação do método por CLAE no EMS 72
5.6 Capacidade antioxidante in vitro 73
5.6.1 Capacidade de SRL pelo Teste do DPPH 73
5.7 Determinação da capacidade antioxidante in vivo 76
5.7.1 Avaliação Bioquímica 76
5.7.2 Análise histopatológica 79
5.7.3 Marcador de Peroxidação Lipídica - SRAT 81
5.7.4 Biomarcadores Antioxidates 82
5.7.4.1 Glutationa Reduzida em homogenato de fígado 82 5.7.4.2 Atividade catalásica em homogenato de fígado 85 5.7.4.3 Determinação da atividade das enzimas SOD e GPx em
homogenato de fígado 86
5.8 Ensaios Antimicrobianos 87
5.9 Avaliação da atividade antinociceptiva e antiinflamatória 88 5.9.1 Nocicepção induzida por injação intraplantar de formalina
em camundongos 88
5.9.2 Efeito do EMS e FRF sobre a atividade locomotora
espôntanea em camundongos 90
5.9.3 Efeito do EMS e FRF sobre a peritonite induzida por
carragenina 91
5.9.4 Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina ou cinameldeido em camundongos
93
5.9.5 Efeito do EMS e FRF sobre a alodínia mecânica induzida pelo Adjuvante completo de Freud (CFA) 95
5.10 Ensaios toxicológicos 98
6 Conclusão 102
Referências 104
Anexo 01 116
Anexo 02 120
Anexo 03 129
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta que, associada a uma rica diversidade étnica e cultural detém um valioso conhecimento tradicional quanto ao uso de plantas medicinais, e, consequentemente, o potencial necessário para o desenvolvimento de pesquisas que resultem em tecnologias e terapêuticas apropriadas (BRASIL, 2005).
Esse imenso patrimônio genético, já escasso nos denominados países desenvolvidos, tem na atualidade um inestimável valor econômico-estratégico no campo do desenvolvimento de novos medicamentos. Neste ponto, é importante ressaltar que aproximadamente 40% dos medicamentos utilizados na terapêutica derivam direta ou indiretamente de produtos naturais, e um quarto do faturamento anual da indústria farmacêutica são oriundos desses medicamentos (CALIXTO, 2003).
No intuito de estabelecer diretrizes para a atuação do governo e de grupos de pesquisa na área de plantas medicinais e fitoterápicos, foi elaborada a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, a qual é, em parte, essencial para o uso sustentável da biodiversidade brasileira, a geração de emprego e renda, o desenvolvimento industrial e tecnológico e a perspectiva de inclusão social e regional. Entre os fatores previamente admitidos, ressalta-se a necessidade de minimizar a dependência tecnológica e estabelecer uma posição de destaque do Brasil no cenário internacional (BRASIL, 2005).
Os países desenvolvidos detêm as maiores indústrias farmacêuticas e geram boa parte da pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos, em virtude da alta tecnologia, dos elevados custos e dos riscos inerentes para o desenvolvimento de um novo medicamento sintético1 (CALIXTO, 2003). Ainda neste contexto, se encontram os fitoterápicos, preparações de extratos padronizados de uma ou mais plantas, cujos constituintes bioativos são poucos conhecidos e a sua ação farmacológica envolve a interação de inúmeras moléculas presentes no extrato (BRASIL, 2005). Estes merecem atenção, pois
a pesquisa e desenvolvimento desses medicamentos são caracterizados por menores custos, e riscos atenuados, uma vez que o estudo etnofarmacológico, o conhecimento tradicional é a ferramenta de escolha do espécime de plantas medicinais a ser estudado (GURIB-FAKIM, 2006).
Dessa forma, os estudos sobre a medicina popular vêm despertando cada vez mais a atenção científica na identificação e na caracterização química de novos princípios ativos, visando elucidar a ação farmacológica e efeitos tóxicos dessas substâncias (GURIB-FAKIM, 2006).
Assim, no presente trabalho as atividades farmacológicas dos extratos, frações e composto isolado de folhas de Spondias sp. foram avaliadas em ensaios in vitro e in vivo, somadas a avaliação da toxicidade para garantir a eficácia e a
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Levantamento botânico
A família Anacardiaceae compreende 77 gêneros e cerca de 600 espécies,
conhecidas por apresentarem frutos comestíveis, em sua maioria, na forma de drupas. O gênero Spondias, pertencente a esta família, apresenta 18 espécies
de plantas distribuídas nas regiões tropicais do planeta (MIN TIANLU & BARFOR, 1980).
No Brasil, este gênero é representado por várias espécies, como mostrado na tabela 1, distribuídas nas regiões norte e nordeste, onde são utilizadas popularmente no preparo de sucos, doces, picolés e sorvetes a partir do fruto, por apresentarem odor agradável e sabor agridoce (LIRA JUNIOR, 2005).
Tabela 1. Espécies do gênero Spondias distribuídas no Brasil
Nome científico Nome popular
S. mombin L. Cajazeira S. purpurea L. Sirigueleira S. cytherea Sonn. Cajaraneira S. tuberosa Arr. Cam Umbuzeiro
Spondias sp. Cajá-umbuzeiro ou umbugueleira
O cajá-umbu (Spondias sp.) é uma planta frutífera nativa do Nordeste
Brasileiro, originada de possíveis cruzamentos naturais entre o cajá (S. mombim L.) e o umbu (S. tuberosa Arr. Cam.), que está ainda em fase de
domesticação, apresentando uma acentuada variabilidade quanto à morfologia de suas folhas e frutos (Figura 1) (LIRA JUNIOR, 2005). Atualmente, ela é descrita como uma nova espécie, denominada S. caatinguae, uma vez que
O fruto do cajá-umbuzeiro é caracterizado como uma drupa arredondada, de
cor amarela, casca fina e lisa, com endocarpo, denominado “caroço”, grande,
branco, suberoso e enrugado localizado na parte central do fruto, em cujo interior se encontram os lóculos, podendo ou não conter uma semente (Figura 2). Diversos fatores influenciam as características físicas e físico-químicas de frutos, destacando-se a constituição genética, condições edafoclimáticas, tratos culturais e tratamento pós-colheita.
Figura 1. Detalhes da exsicata de Spondias sp.(voucher nº
2897/12.09) depositada no Herbário da Faculdade de Tecnologia e Ciências, Departamento de Biologia, Campus Salvador, Salvador, BA.
Os caracteres físicos dos frutos referentes à aparência externa, ao tamanho, à forma e à cor da casca, assim como as características físico-químicas (sabor, odor, textura e valor nutritivo), constituem atributos relacionados à qualidade para sua comercialização e utilização da polpa na elaboração de produtos industrializados (LIRA JUNIOR, 2005).
secretores e dois feixes vasculares, e idioblasto com inclusão de oxalato de cálcio. Apresenta pecíolo de forma poligonal (ROCHA et al., 2008).
Figura 2. Cajá-umbu (Spondias sp.) Linn. (EMBRAPA)
A:Detalhes dos frutos maduros, e B: Galhos de cajá-umbuzeiro.
2.2 Atividade farmacológica
A família Anacardiaceae apresenta espécies e variedades com usos populares,
além de comprovações científicas quanto à bioatividade (Tabela 2).
Tabela 2. Bioatividade atribuídas a espécies da família anacardiácea Nome
científico Nome popular Usos populares Avaliações Científicas S. mombin L. Cajazeira Conjutivite
(ALBUQUERQUE et al., 2009);
Atividade antibacteriana (ABO, 1999); Atividade antiviral (COURTHOUT et al., 1989; PENA et al., 1999; VILLEGAS et al., 1997), Atividade antiedematogênica (PENA, 2000);
Anacardium
ocidentale L. Cajú Anemias, esgotamento nervoso, anti-inflamatório diurético e gengivite (FERNANDES et al., 1989)
Vitamina C
(FERNANDES et al., 1989).
Astronium fraxinifolium Schott.
Aroeira de miolo
Bronquite,
Tuberculose e diabetes
(FERNANDES et al., 1989)
Efeitos cicatrizante e anti-inflamatório, ações antihistamínica e antibracinina
Quimicamente, o gênero Spondias é caracterizado pela presença de
terpenóides do grupo dos sesquiterpenos e monoterpenos, como também de flavonóides, taninos, alcalóides e lipídios (MENDES & ELISALDO, 2007; TALHOUK et al., 2007).
O fruto do cajá-umbu apresenta teores elevados de vitamina C e glicídios. Investigações fitoquímicas realizadas com a polpa do fruto indicaram o cajá-umbuzeiro como fonte natural de antioxidante, sendo isolados a partir do extrato acetato, furfural e alfa/beta-D-glicose. O furfural apresentou atividade antioxidante moderada (ALMEIDA, 2000).
Rhus, outro gênero da família anacardiácea, possui múltiplas atividades farmacológicas devido a taninos, portanto, com um potencial promissor devido às diversas bioatividades: antifibrinogênica, antifúngica, antiinflamatória, antimalárica, antimicrobiana, antitumoral, antiviral, citotóxica, hipoglicemiante e leucopênica, assim como atividade antioxidante (RAYNE & MAZZA, 2007).
2.3 Estresse oxidativo
2.3.1. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
O termo radical livre utilizado para designar qualquer átomo ou molécula cuja estrutura atômica apresenta um ou mais elétrons desemparelhados no seu orbital mais externo, sendo por isso instável e com grande capacidade de reatividade. Outras espécies químicas podem-se formar a partir dos radicais livres, que embora, não tenham elétrons desemparelhados, possuem similar instabilidade estrutural dos radicais livres. (RIBEIRO et al., 2008).
Assim as espécies reativas incluem radicais do oxigênio (ERO) e do nitrogênio (ERN), e certas espécies não radicalares, que podem ser convertidas facilmente à radical (EHRENBRINK et al, 2006). O oxigênio pode gerar ERO
ora por absorção de energia ou por transferência de elétrons (BARREIROS et al., 2006). Assim, ao absorver energia (luz ou radiação) no seu estado
fundamental formam-se as espécies excitadas conhecidas como oxigênio singlet (1O2) que embora não constituindo radicais livres, apresentam alto poder oxidante, reagindo rapidamente com biomoléculas (BARREIROS et al.,
2006; KARIHTALA & SOINI, 2007). Outro mecanismo de geração de ERO consiste na redução do O2 à água com a formação de radical ânion superóxido (O2•¯), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (•OH). Estes produtos, uma vez formados, podem reagir com biomoléculas danificando ou inativando estruturas celulares (KARIHTALA & SOINI, 2007).
O ânion superóxido (O2•¯), primeiro produto da redução monoeletrônica do O2, é gerado através de sistemas enzimáticos, como os das enzimas xantina oxidase, NADPH oxidase e peroxidades (GENESTRA, 2007). A reação de dismutação de O2•¯, catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD), forma H2O2, um intermediário reativo (VASCONCELOS et al., 2007). Enzimas
oxidases, como a xantina oxidase e aminoácido oxidase, também formam H2O2, que embora sendo uma espécie não radicalar, pode reagir com metais redox-ativos (e.g. ferro e cobre), gerando o radical •OH (VALKO, 2004;
YOSHIDA & CAMPOS, 2005).
O radical •OH é a forma radicalar mais reativa no sistema biológico, cuja remoção in vivo é difícil, em face da não existência de enzimas que catalisem
do radical O2•¯ com H2O2, via reação de Haber-Weiss, forma o radical •OH (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; VASCONCELOS, 2007).
O2•¯ + Fe3+ O
2 + Fe2+
Fe2++ H
2O2Fe3+OH•+ OH¯
O2•¯ + H2O2 O2 + OH•+ OH¯
(Reação de Fenton) (Reação de Haber-Weiss) O2•¯ + Fe3+ O
2 + Fe2+
Fe2++ H
2O2Fe3+OH•+ OH¯
O2•¯ + H2O2 O2 + OH•+ OH¯
(Reação de Fenton) (Reação de Haber-Weiss)
O excesso na formação e/ou a incapacidade na remoção de moléculas altamente reativas caracteriza o quadro de estresse oxidativo (VALKO et al,
2007); um excesso de agentes oxidantes e/ou deficiência do sistema protetor, que causa o desequilíbrio entre o consumo de glutationa reduzida (GSH) e a produção de glutationa oxidada (GSSG). O aumento de GSSG favorece a formação de pontes dissulfeto (-S-S-) nas proteínas portadoras de grupamento tiol (-SH). Assim, a oxidação deste grupo prejudica as funções das biomoléculas (RAHMAN & MacNEE, 2000). A redução das pontes de dissulfeto pode ocorrer devido à ação de compostos antioxidantes, como a GSH e pelo sistema tioredoxina (NORDBERG & ARNER, 2001).
Assim, o estresse oxidativo não pode ser definido apenas pelo desequilíbrio entre parâmetros pró-oxidantes e antioxidantes. Atualmente, conceituado como uma perturbação da sinalização e do controle redox, levando-se em consideração o sistema redox GSSG/GSH, tioredoxina e cisteina/cistina (JONES, 2006).
2.3.2 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
A peroxidação lipídica, a primeira consequências do estresse oxidativo, ocorre
em ácidos graxos poliinsaturados (LH) e se inicia com o radical •OH que ao
capturar um átomo de hidrogênio de um carbono metileno da cadeia polialquil
desemparelhado reage com O2 gerando um radical peroxil (LOO•), capaz de
retirar um hidrogênio de um ácido graxo poliinsaturado adjacente da membrana, aumentando a reação de propagação da cadeia de peroxidação lipídica, com formação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) (GATÉ et al., 1999).
Os hidroperóxidos lipídicos são instáveis na presença de metais de transição (e.g. ferro ou cobre), levando à formação de radicais alcooxil (LO•) e peroxil
(LOO•). (LOUREIRO et al., 2002). A figura 3 representa o processo de
peroxidação lipídica.
Figura 3. Peroxidação Lipídica (Adaptado LOUREIRO et al., 2002).
Um dos produtos da peroxidação lipídica é o malondialdeído (MDA), um dialdeído, altamente reativo, que eventualmente reage com os grupos amino de proteínas, com fosfolipídios ou com ácidos nucléicos, induzindo modificações estruturais nas moléculas biológicas (FREI, 1997; YOUNG, 2001; DROGE, 2002). Esse aldeído é o mais abundante e sua avaliação é feita espectrofotometricamente ao se medir um complexo colorido, produto da reação com o ácido tiobarbitúrico (THÉROND et al, 2000).
2.3.3 SISTEMA DE DEFESA ANTIOXIDANTE
O sistema de defesa antioxidante é formado por antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos, protegendo o organismo dos danos causados por ERO e ERN, e, portanto, aumentam a defesa imunológica, atenuando o risco de doenças degenerativas (WILLCOX et al, 2004; VALKO, 2007; CHATTERJEE et al., 2007).
proteínas de transporte de metais de transição (transferrina, ceruloplasmina), etc., de origem endógena, são os antioxidantes não-enzimáticos (DROGE, 2002; WILLCOX et al, 2004). Os antioxidantes exógenos, provenientes da
dieta, incluem os tocoferóis, carotenóides, ascorbato, micronutrientes (zinco, selênio, manganês), taninos e flavonóides. A presença desses antioxidantes no sistema celular é conhecida por prevenir danos oxidativos (SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004; WU et al., 2005).
A função da SOD é catalisar a reação de dismutação do ânion radical superóxido (O2•¯), gerando compostos menos reativos, oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio (H2O2), que pode ser degradado pelas enzimas GPx e CAT. A SOD é a principal isoenzima nos fluídos extracelulares, mas também ocorre em tecidos (NIKI, 2004). Existem três formas de SOD em mamíferos: a cobre-zinco (Cu-Zn-SOD), manganês (Mn-SOD), e a SOD extracelular (EC-SOD). A Cu-Zn-SOD está presente no citosol de todas as células, envolvida na remoção dos ânions superóxido do citoplasma e, possivelmente, também do peroxissoma (GRALLA & KOSMAN, 1992; JAMIESON et al, 1994); enquanto a
Mn-SOD está localizada principalmente nas mitocôndias, protegendo-a dos superóxidos gerados durante a respiração (GUIDOT et al., 1993; JAMIESON et al., 1994). Como indicado pelo nome, a EC-SOD é uma forma extracelular da
enzima e encontra-se em equilíbrio entre o plasmae a superfície das células endoteliais, onde exerce sua ação protetora antioxidante (STROCKER e KEANEY-JR, 2004)
Estas enzimas distribuem-se em diversos órgãos, na seguinte ordem de atividade especifica: fígado, cérebro, testículos, rins, coração, estômago, pulmão e pâncreas. A forma Cu/Zn-SOD apresenta-se mais resistente às variações de temperatura e à desnaturação por substâncias como cloreto de guanidina, duodecil sulfato de sódio, ou uréia (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Outra isoforma, a Fe-SOD, uma ferro-enzima, foi identificada em bactérias. Porém, as diferentes formas de SOD catalisam a mesma reação de dismutação do radical O2•¯ (CHANCE et al., 1979; HALLIWELL &
A catalase (CAT), uma hemeproteína, encontrada principalmente nos peroxissomos celulares e em extensão no citosol, decompondo o H2O2 a H2O e O2. Esta reação é vital, pois o H2O2 é nocivo à célula devido a sua capacidade de atacar as cadeias de ácidos graxos insaturados presentes nas membranas, além de outras macromoléculas (FRIDOVICH, 1998). Esta enzima está presente em animais, plantas, bactérias e fungos, sendo encontrada no sangue, na medula óssea, em mucosas, rins e fígado. Embora a CAT seja capaz de catalisar H2O2, é praticamente inativa frente à hidroperóxidos orgânicos, diferentemente da GPx que é altamente ativa na presença desses compostos (URSINI et al., 1995; JACOB, 1995; STOCKER e KEANEY-JR,
2004).
A glutationa peroxidase (GPx), uma enzima dependente de selênio, coopera com a CAT na remoção de hidroperóxidos (ROOH). A GPx reduz o H2O2, os peróxidos alifáticos e aromáticos à água e seu correspondente álcool inerte, mediante uma reação dependente de GSH e de NADPH como fonte de equivalentes redutores (GRISSA, 2007).
A glutationa (GSH), o tripeptídeo D-L-glutamil-L-cisteinil-glicina, é o antioxidante intracelular mais abundante, com importante função na manutenção do estado redox celular (CHOIN et al., 1997). Ao atuar como
cofator da GPx na eliminação do H2O2, a GSH passa para GSSG, sendo recuperada pela glutationa redutase (GR) na presença de NADPH (Figura 4). Além do seu papel central na atividade da GPx, a GSH está envolvida em várias outras vias antioxidantes, incluindo sequestro de radicais livres, no metabolismo do ascorbato e na detoxificação de xenobióticos via glutationa transferase (YOUNG, 2001; DROGE, 2002; YOSHIDA & CAMPOS, 2005; STOCKER e KEANEY-JR, 2004).
Figura 4. Detoxificação enzimática realizada pela CAT e GPx (Adaptado de PROCTO & REYNOLDS, 1984).
2.3.4. ANTIOXIDANTES NATURAIS
A ação antioxidante protetora do sistema biológico é complementada através do sistema antioxidante não-enzimático constituído por substâncias, tais como
vitamina E (tocoferóis), vitamina C (ácido ascórbico) e -caroteno (carotenóides) (GRISSA, 2007). Substâncias estas que em associação aos flavonóides, são os antioxidantes mais estudados em animais e humanos por atuarem na redução de espécies reativas, principalmente do radical peroxil, e do oxigênio singlet (FILIPE et al, 2001).
A vitamina E, principal antioxidante lipossolúvel presente nas membranas
celulares, tem o α-tocoferol como seu componente mais importante (Figura 5) e atua no bloqueio da etapa de propagação da peroxidação lipídica dos ácidos graxos poliinsaturados das membranas e lipoproteínas, ao doar um átomo de
hidrogênio aos radicais peroxil e alcoxil. A capacidade do α-tocoferol é conferida pela de regeneração do radical α-tocoferoxil por agentes redutores, principalmente o ácido ascórbico, mantendo assim a sua atividade antioxidante (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).
Figura 05. Estrutura do -tocoferol (BRITO, 2009) O
CH3 HO
H CH3
CH3 CH3
CH3 CH3
Outro antioxidante natural, a vitamina C, conhecida como ácido ascórbico, é
hidrossolúvel, agindo contra radicais livres e o oxigênio “singlet”. Plantas e
animais podem sintetizá-la, com exceção de humanos, primatas e cobaias, sendo, então, obtida da dieta (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; LI & SCHELLORN, 2007). Ela pode atuar em sistemas biológicos como antioxidante, antiteratogênica, anticancerígena e imunomoduladora. Sua principal propriedade química é a habilidade para agir como agente redutor (doador de elétrons) na regeneração do α-tocoferoxil (NAIDU, 2003; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; LI & SCHELLORN, 2007).
Os carotenóides, principalmente o -caroteno, são absorvidos a nível entérico e funcionam como precursores da vitamina A, e como antioxidantes. Portanto, estas substâncias têm um duplo papel ao diminuir a formação do oxigênio
“singlet” in vivo, e na remoção daqueles já formados (TEE, 1992). O
-caroteno, um pigmento presente em todas as plantas, pode ser encontrado em membranas celulares, inclusive nos lipossomos (WILLCOX et al., 2004). Sua
deficiência pode estar relacionada com alterações hepáticas (TRÉROND et al.,
2000).
Os antioxidantes naturais são essencialmente polifenóis, ocorrendo em todas as partes das plantas. Estruturalmente, estas moléculas são constituídas por um ou mais núcleos aromáticos, contendo hidroxilas e/ou seus derivados funcionais, substituindo ao menos um hidrogênio (CARVALHO et al., 2001;
ZUANAZZI & MONTANHA, 2004). A atividade antioxidante destas estruturas é atribuída a sua propriedade redox, tendo, assim, um papel importante na absorção e neutralização de radicais livres ou na decomposição de peróxidos; daí que parece que apresentam efeitos farmacológicos benéficos em desordens neurológicas (NAHAR & SARKER, 2005).
2.4 Atividade antibacteriana
plantas pertencentes a 63 gêneros continham substâncias que inibiam o crescimento de um ou ambos os microorganismos. (PEDERSON, 1944).
No Brasil, as pesquisas sobre substâncias antimicrobianas de origem vegetal foram iniciadas por Cardoso e Santos (1948) ao avaliarem extratos de 100 diferentes plantas, indicadas na terapêutica como antiinflamatórias ou cicatrizantes. Destes, apenas cinco extratos apresentaram comprovada atividade inibitória contra S. aureus e E. coli.
Na década de 50, os primeiros compostos de espécies vegetais foram isolados. Dentre eles, destacam-se o isolamento e a identificação de flavonóides tais como, primina, miconidina, lapachol e derivados, luteolina e miricetina, apresentando propriedades antibacterianas efetivas contra S. aureus (XU e
LEE, 2001; ZACCHINO et al., 2001).
O conhecimento sobre determinadas espécies vegetais com propriedades antimicrobianas tem sido revisto e ampliado, devido aos crescentes problemas associados ao uso de diversos antibióticos. Em amplo estudo sobre plantas medicinais foi feita uma avaliação concreta sobre a atividade antimicrobiana de extratos, óleos essenciais e de substâncias obtidas de espécies vegetais contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e espécies fúngicas (LIMA, 2001). As plantas produzem um vasto número de substâncias naturais com potencial antimicrobiano e imunomodulador na tentativa de se adaptarem às agressões do meio ambiente. Essas substâncias podem ser isoflavonóides, indóis, fitoestérois, polissacarídeos, sesquiterpenos, alcalóides, glucanas, taninos, vitaminas e minerais (WILLIAMS, 2001)
Atribui-se a flavónoides e taninos a capacidade de inibir o crescimento ou provocar a morte de microorganismos. Os flavonóides podem inibir importantes enzimas virais como transcriptase reversa e proteases, bem como destruir alguns protozoários patogênicos, sendo essas atividade de baixa toxicidade em células animais (HAVSTEEN, 2002).
Os taninos condensados são os componentes que possuem a maior toxicidade em relação aos microorganismos e são diversos seus mecanismos de ação: inibição de enzimas extracelulares, privação de substratos, comprometimento do metabolismo – como ação sobre a membrana celular (SCALBERT, 1991). Estudos com diversas espécies da família Anacadiaceae exemplificam e
microorganismos (ELOFF,2001; OZÇELIK, 2005; LOGUERCIO, 2005; ERAZO et al, 2006). A espécie Anacardium occidentale, conhecida como caju
verdadeiro, é vastamente estudada e o potencial antimicrobiano da casca da árvore é relatado em diversos trabalhos (HIMEJINA & KUBO, 1991; KUDI et al., 1999; AKIPELU, 2001).
O extrato aquoso do caule e folhas de Schinus terebenthifolius Raddi,
conhecida popularmente por aroeira, mostrou-se positivo na inibição do crescimento de microorganismos, como Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa (LIMA et al., 2004).
2.5 Inflamação
A resposta inflamatória é um mecanismo que provoca alterações do sistema vascular, componentes líquidos e celulares, visando destruir, diluir ou isolar o agente lesivo, sendo assim uma reação de defesa e de reparação do dano tecidual (GILMAN, 1996; RANG; DALLE; RITTER, 1997).
A inflamação aguda é a primeira resposta a uma lesão celular ou tecidual, na qual contempla uma série de alterações sequenciais do processo, que é mediado por substâncias, como histamina, serotonina, bradicinina, prostaglandinas e leucotrienos. Segundo Lieberman (2009), a histamina desempenha papel fundamental ao aumentar a permeabilidade celular, gerando a vasodilatação, desencadeada ao se ligar à receptores H1 da células endoteliais.
Este processo aumenta o fluxo sanguíneo local, consequentemente o extravasamento de grande quantidade de líquidos e de proteínas para os espaços intersticiais.
Uma das etapas iniciais do processo inflamatório é a marginação ou deslocamento dos leucócitos da porção periférica dos vasos sanguíneos, que, na sequência migram sob o endotélio, aderindo-se fortemente e atingindo o espaço intercelular do endotélio. Todas estas reações são desencadeadas por mediadores químicos originados no local do processo inflamatório.
aumento da permeabilidade vascular, a fase subaguda na qual ocorre a infiltração de leucócitos e fagócitos e a fase crônica, caracterizada pela degeneração de tecidos e a presença de fibrose (ROTELLI et al. 2003). Portanto, a inflamação é um processo tipicamente caracterizado pelo aumento da permeabilidade vascular do tecido endotelial e do influxo de células leucocitárias até o sítio inflamatório.
O uso das plantas medicinais vem sendo aceito e utilizado por vários profissionais por apresentarem propriedades químicas que ajudam no tratamento das doenças inflamatórias (MARTINS et al., 2000).
Das várias aplicações terapêuticas dos vegetais, muitos apresentam atividade antiinflamatória e analgésica, sendo largamente utilizados na medicina popular e por isso, há necessidade de pesquisas e estudos para comprovar tanto essas atividades, quanto um possível quadro tóxico, em ensaios biológicos (SILVA, 1978; SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1985).
No Brasil, a utilização de plantas no tratamento de doenças inflamatórias apresenta, fundamentalmente, influências da cultura indígena, africana e européia. Essas influências deixaram marcas profundas nas diferentes áreas da cultura brasileira, sob o aspecto material e espiritual e constituem a base da medicina popular que há algum tempo vem sendo retomada pela medicina natural. A medicina natural procura aproveitar suas práticas, dando caráter científico e integrando-as em um conjunto de princípios que visam não apenas curar algumas doenças, mas restituir o homem à vida natural (MARTINS et al.,
2000).
Segundo Góes et al. (2005), a aroeira-do-sertão, Myracrodruon urundeuva Fr. AlI, planta da família Anacardiaceae, é uma planta de uso popular no nordeste
do Brasil, que apresenta eficácia terapêutica, com evidentes efeitos antiinflamatório, cicatrizante, antiulcerogênico, anti-histamínico, antibradicinina e analgésico. Assim, a planta pode ser utilizada no tratamento de várias afecções, principalmente ginecológicas e ferimentos cutâneos.
Estudos realizados com Ageratum conyzoides em ratos mostraram que a
Grande parte das atividades dos flavonóides descrita em artigos contempla sua ação no sangue e em células endoteliais, o qual vem de encontro com as principais áreas de pesquisa, concentradas na inflamação e no câncer. Embora os flavonóides sejam estudados há mais de 50 anos, o mecanismo celular envolvido em sua ação biológica não está completamente elucidado (BENAVENTE-GARCÍA; CASTILLO, 2008).
2.6 Dor
A sensação de dor é um mecanismo de alerta do organismo, indicando a presença de um estímulo lesivo que aciona respostas protetoras apropriadas (WOOLF, SALTER, 2000; JULIUS, BASBAUM, 2001). Dessa maneira, o adequado funcionamento do sistema nociceptivo é essencial para proteger o organismo de danos teciduais. Entretanto, sob condições patológicas, este sistema se torna sensibilizado e a dor transforma-se em uma doença (ZEILHOFER, 2005).
A nocicepção é o processo pelo qual estímulos térmicos, mecânicos ou químicos nocivos são detectados por uma subpopulação de fibras nervosas periféricas, chamadas nociceptores (BASBAUM et al., 2009).
Na última década, muitas moléculas de transdução da nocicepção têm sido identificadas, sendo o maior grupo de detectores de estímulos nocivos o da família dos receptores de potencial transitório (TRP) (CHENG, JI, 2008; PATAPOUTIAN, TATE, WOOLF, 2009). Esses canais participam na geração de sensações dolorosas evocadas por estímulos químicos, térmicos e mecânicos (LEVINE, ALESSANDRI-HABER, 2007). O receptor de potencial transitório vanilóide 1 (TRPV1), originalmente denominado receptor vanilóide 1 (VR1) e comumente referido como receptor da capsaicina, foi o primeiro a ser descrito como receptor polimodal ativado por três estímulos dolorosos; compostos vanilóides (capsaicina, resiniferatoxina), calor nocivo (43°C) e pH baixo (< 5,9) (CATERINA et al., 1997; TOMINAGA et al., 2007).
(STORY et al., 2003) e ativado por temperaturas menores que 17°C (CALIXTO et al., 2005; PATAPOUTIAN, TATE, WOOLF, 2009). Esses receptores também podem ser ativados por substâncias pungentes, tais como alicina, D9-tetraidrocanabinol (THC), formalina, substâncias presentes nos óleos de mostarda (isotiocianato de alila) e canela (cinamaldeído), e moléculas irritantes presentes no meio ambiente (BANDELL et al., 2004; JORDT et al., 2004).
2.7 Composição química
2.7.1 FLAVONÓIDES
Dentre os polifenóis estudados, destacam-se os flavonóides, compostos considerados não-essenciais, porém amplamente distribuídos entre plantas vasculares, sendo encontrados em numerosos frutos, grãos e em outras partes do vegetal (BORS et al, 1996). Estas substâncias estão presentes em produtos
consumidos diariamente na dieta humana (e.g. frutos, vegetais, especiarias,
cacau, chá verde, vinho tinto seco) (SCALBERT & WILLIAMSON, 2000). Diversas funções biológicas e farmacológicas têm sido atribuídas aos flavonóides (e.g. atividade antitumoral, antibacteriana, antiviral,
anticarcinogênica, antimutagênica, antiinflamatória, inibidor enzimático) (PATHAK, 1991; AVIRAM & FUHRMAN, 2002; NESTEL, 2003).
O
O
A C
B
7
6
8
2
3 9
5 10
4
4'
3' 6'
5'
2'
Figura 6. Estrutura base dos flavonóides (TIWARI, 2001).
Ainda, a depender da substituição e do nível de oxidação, os flavonóides podem ser divididos em subclasses: flavonóis (quercitina, kaempferol), flavonas (rutina, apigenina), antocianidinas (cianidina), isoflavonóides (genisteína) e flavononas (mirecetina, hesperidina), dentre outras (BRITO, 2009).
O efeito dos flavonóides sobre a peroxidação lipídica baseia-se na relação estrutura-atividade. A característica principal para a inibição do processo é o grupo catecol no anel B (BORS et al., 1996). Estudos sugerem que estas
moléculas bloqueiam a peroxidação lipídica ao doar átomos de hidrogênio aos radicais hidroxil e peroxil, formando um radical semiquinona ou radical aroxil que ao reagir com um segundo radical, adquire uma estrutura quinona estável, terminando assim a cadeia de propagação da peroxidação lipídica como mostrado na figura 7 (TIWARI, 2001).
Figura 7. Mecanismo de sequestro das ERO (R•) por flavonóides, com
formação de estrutura estável (Adaptado de HEIM, 2002).
do extrato padronizado de Ginkgo biloba na terapêutica como antioxidante
(PINCEMAIL & DEBY, 1986).
A silimarina, um biflavonóide extraído de Silybum marianum, cujos efeitos
medicinais são conhecidos desde a antiguidade no tratamento de problemas biliares e hepáticos (LENG-PESCHLOW, 1996), devido a sua natureza fenólica, é um antioxidante capaz de reagir com numerosos radicais livres, como o radical hidroxila, formando compostos mais estáveis e menos reativos. O extrato desta planta está incluído na farmacopéia de muitos países sob a marca Legalon®, sendo utilizada no tratamento de distúrbios hepáticos, como é o caso da neutralização da hepatotoxicidade, causada por agentes tóxicos, tais como paracetamol, galactosamina, halotano e CCl4 (BRITO, 2009).
2.8 Avaliação toxicológica
A grande expansão da medicina tradicional por todo o mundo acontecida nos últimos dez anos despertou a preocupação das autoridades regulatórias com relação à utilização dos diferentes recursos oferecidos pela Medicina Tradicional em cada país, principalmente no que se refere à segurança e eficácia dos medicamentos fitoterápicos (OECD, 2001).
A principal fonte de guias para regulamentação em âmbito internacional é a Organização Mundial de Saúde. Dado o caráter multilateral dessa organização, suas Diretivas não têm força de lei em nenhum país, mas influenciam fortemente na elaboração das respectivas legislações nacionais. Sendo assim, a partir de 1991 a OMS elaborou diversas normas técnicas para avaliar os medicamentos fitoterápicos e a eficácia e a segurança dos mesmos (OMS, 2000)
Quanto à realização de ensaios toxicológicos pré-clínicos de substâncias químicas, os critérios para realização destes testes estão bem especificados em diferentes normas, como por exemplo, as normas da Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) – Organização para
Cooperação Econômica e Desenvolvimento, descritos em “Guidelines for
testing of chemicals” (EOCD, 1996). Em relação a fitoterápicos, ainda há dúvidas a respeito das avaliações mais apropriadas.
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a composição química, e as atividade antioxidante, antibacteriana, antiinflamatória e antinociceptiora, além da toxicidade de extratos e frações de folhas de Spondias sp.
3.2 Objetivos Específicos
1. Determinar a composição química dos extratos vegetais mediante a caracterização por espectrofotometria em UV, calorimetria exploratória diferencial (DSC), e por ressonância magnética nuclear do composto majoritário;
2. Desenvolver e validar método analítico por CLAE-DAD para a identificação e a quantificação dos compostos fenólicos, segundo a RE nº 899, possibilitando a padronização dos extratos e frações;
3. Avaliar a atividade antibacteriana do EMS e frações contra cepas de
Enterococcus faecalis ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae (amostra
clínica) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC
25922, Salmonella Typhimurium ATCC 14028), Bacillus cereus (amostra
clínica), Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228.
4. Avaliar a capacidade antioxidante in vitro dos extratos vegetais, pelo o
sequestro do radical DPPH;
5. Avaliar a peroxidação lipídica in vivo através da determinação do
Malonildialdéido (SRAT) em homogenato de fígado;
6. Determinar in vivo o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) em
homogenato de fígado;
7. Determinar a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT) em homogenato de fígado. 8. Verificar o efeito antinociceptivo do extrato e fração rica em flavonóides em
9. Avaliar o possível efeito do extrato e fração rica em flavonóides sobre alodínia mecânica no modelo de neuropatia induzida por CFA a 80% em camundongos;
10. Investigar o efeito antinoceptivo do extrato e fração rica em flavonóides frente aos receptores transitórios (TRPA1 e TRPV1);
11. Avaliar a atividade antiinflamatória do extrato e fração rica em flavonóides no modelo de peritonite induzida pela carragenina;
12. Investigar se no efeito antiinflamatório há restabelecimento do equilíbrio redox pela determinação de GSH em exudato peritoneal;
13. Investigar se no efeito antiinflamatório há inibição da migração celular em exudato peritoneal;
14. Avaliar o possível efeito depressor do sistema nervoso central pelo método de campo aberto (Open Field) em camundongos;
4 METODOLOGIA
4.1 Material Vegetal
As folhas de Spondias sp. foram coletadas em março de 2010 no horto da
Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola (EBDA), no município de Itaberaba, estado da Bahia, Brasil (log. 40º 18‟ 14‟‟ O lat. 12º 30‟ 56‟ S), sendo transportadas, após coleta, para o Núcleo de Pesquisas, da Faculdade de Tecnologia e Ciências, no município de Salvador, Bahia, Brasil.
Confeccionou-se uma exsicata, identificada pela Prof. Dr. Jomar Gomes Jardim, e depositada no Herbário da UFRN (voucher nº 10433/03.11)
As folhas foram submetidas à secagem em estufa de circulação de ar (Fanem modelo 315 SE,Brasil), com a temperatura regulada a 40 °C(± 2,5°C), por 48 h.
Após secagem, as folhas foram trituradas em moinho de Willys (Quimis modelo MW1420, Brasil), o pó foi submetido à processos de otimização de extração.
4.2 Otimização do Processo Extrativo
As folhas de Spondias sp. foram submetidas a extração utilizando-se métodos
descritos na Farmacopéia Brasileira (2003), com algumas modificações. Resumidamente, 1 g de massa seca foi macerada em metanol ou etanol (1:5 p/v), em intervalos de 1 – 7 dias, enquanto para a extração aquosa 10 g de massa seca forma submetidos à decocção com água destilada por 5 min de fervura (1:5 p/v).
a -80°C e, posteriormente, liofilizado. A massa do extrato foi utilizada para comparação dos métodos extrativos.
4.3 Obtenção do Extrato Metanólico, das frações e
isolado de folhas
Spondias sp.
O material pulverizado (700 g), após maceração em metanol (3,5L) durante sete dias com agitação periódica, foi filtrado e rota-evaporado (ROTACOOL Labora 3300®, Londres, RU), obtendo-se o extrato metanólico. Este foi particionado com solventes de polaridade crescente (hexano, clorofórmio e acetato de etila), e as frações foram secas com canhão de ar quente, conforme descrito na figura 8.
Figura 8. Esquema do processo de partição do extrato metanólico (EMS) de
Spondias sp. para obtenção das frações semi-purificadas. (adaptado de
O precipitado obtido após o processo, denominado fração rica em flavonóides (FRF), foi submetido à cromatografia em coluna, usando-se Sephadex LH20 como fase estacionária, e metanol a 50% como fase móvel. Vinte frações foram obtidas, correspondendo as frações 1-5 açucares, e de 7-13 isolado purificado que foram submetidas à identificação por espectrometria UV, calorimetria exploratória diferencial (DSC) e RMN 13C e H1. As frações 1-5 e as 7-13 foram analisadas, respectivamente, no Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos da UFRN (Natal, RN), e no Laboratório de Fitoquímica da UFPR (Curitiba, PR).
4.4 Caracterização da Composição Química dos
extratos e isolado
4.4.1 DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓLICOS
O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação da absorbância de amostras contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido gálico (10- 350 g/mL), utilizando-se o reagente de Folin-Ciocalteau, conforme o procedimento descrito por GEORGÉ (2005). O resultado foi expresso em mg de equivalentes de ácido gálico/ g de extrato.
4.4.2 ESPECTROFOTOMETRIA UV
4.4.3 CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC)
As curvas de DSC forma obtidas em calorímetro exploratório diferencial (Shimadzu®, modelo SD-60, Japão) na faixa de 25 a 400ºC sob atmosfera de nitrogênio (N2), com fluxo de 50 mL/min e razão de aquecimento de 10ºC/min, utilizando cadinho de alumínio fechado (sem perfuração) contendo 2,0 mg de amostra. O calorímetro foi devidamente calibrado, utilizando padrão de índio (Tfusão=156ºC e ∆H = 28,4 J/g). Este experimento foi realizado no Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos (LDM), UFRN (Natal, RN).
4.4.4 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 13C E 1H
Para a RMN de ¹³C e ¹H utilizou-se espectrofotômetro Brucker® modelo (Alemanha) AC200 em 60 MHz e 300 MHz, respectivamente, realizada no Laboratório de RMN do Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná.
4.4.5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO POR CLAE-DAD
Para o desenvolvimento do método analítico, 10µL de uma solução de 100 µg/mL de cada padrão de compostos fenólicos (ácido gálico, ácido clorogênico, galato de -(-)epigalocatequina, catequina, rutina, hiperina, quercetina, apgenina, canferol) foram injetados no cromatógrafo VARIAN mod. ProStar 440 (EUA), com bomba quaternária, detector de arranjo de diodo, e amostrador automático, utilizando coluna KINETEX C18 (100x4.6 mm, 2.6 µm) (Phenomenex, EUA).
