Avaliação da atividade enzimática

Pinto (2005) descreve a técnica para medição de atividade proteolítica da papaína através da espectrofluorimetria por método de microplacas, que foi validada por Miura (2012) e também utilizada por Nicoletti (2015). Essa técnica permite que a análise seja feita diretamente no produto, sem necessidade de extração da enzima.

Utiliza-se como substrato o cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4- metilcumarina-7-amido (N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA), que sofre hidrólise catalisada pela papaína (MOLE, HORTON, 1973; KANAOKA et al, 1977), liberando um produto fluorescente, a 4-metilcumarina-7-amido. Mesmo em baixas concentrações esse produto é detectado através do aparelho FLUOstar OPTIMA, um leitor de fluorescência em microplacas, locado na Central Analítica do Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense (UFF). Para os ensaios no fluorímetro foram utilizados filtros de excitação e emissão de 360nm e 460nm, respectivamente. As soluções necessárias para os testes foram preparadas conforme métodos descritos abaixo.

4.2.4.1 Preparo das soluções

a) Solução tampão de fosfato-cisteína-EDTA

Em balão volumétrico de 500 mL colocou-se 3,55 g de fosfato de sódio dibásico anidro e dissolveu-se em 400 mL de água ultra-pura. Adicionou-se 7,00 g de EDTA dissódico e 2,74 g de cloridrato de cisteína anidro, completou-se o volume com água ultra-pura e agitou-se até completa dissolução. O pH foi ajustado para 6,0 (± 0,1) com solução de hidróxido de sódio 10%.

b) Solução do substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA

Em frasco de vidro âmbar pesou-se exatamente 25 mg do substrato N-CBZ-PHE- ARG-7-MCA os quais foram solubilizados em 37,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Uma alíquota de 400 µL desta solução foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL, que teve seu volume completado, e homogeneizado sob agitação, com solução tampão.

c) Solução de ácido acético 30% (v/v)

Transferiu-se 30mL de ácido acético glacial para um balão volumétrico de 100 mL e completou-se o volume com água purificada. Após, a solução foi homogeneizada sob agitação.

4.2.4.2 Técnica de espectrofluorimetria por método de microplacas Foram adicionados a cada poço da microplaca:

 55 µL da solução tampão fosfato-cisteína  125 µL da solução do substrato

 20 µL de solução contendo papaína, obtida através de diluição da amostra ou do padrão

 40 µL de solução de ácido acético 30% (v/v): a fim de interromper a reação de hidrólise

As soluções e a placa foram mantidas em banho de gelo por todo o tempo de preparo da microplaca. Durante os procedimentos de leitura no aparelho, a placa foi mantida a 40ºC por 45 minutos. A cada 15 minutos adicionou-se solução de ácido acético 30%, iniciando no tempo zero e terminando em 45 minutos.

O esquema da microplaca está representado na Figura 10. Os poços em cor cinza representam a análise de uma amostra: as quatro linhas (A, B, C, D) são referentes ao tempo de reação (0, 15, 30 e 45 minutos) e as três colunas (1, 2, 3) correspondem a três amostras do mesmo lote. Foram realizadas leituras de duas placas para cada lote analisado.

4.2.4.3 Determinação da curva analítica

Para a construção da curva analítica foram pesados exatamente 25 mg de papaína padrão secundário 30.000 USP-U/mg (atividade descrita no laudo 32132USP-U/mg), os quais foram transferidos para balão volumétrico de 250 mL. O volume foi completado com solução tampão fosfato-cisteína-EDTA (conforme item 4.2.4.-a) sob agitação e procedeu-se a homogeneização.

Transferiu-se alíquotas de 180 µL, 300 µL, 600 µL, 1200 µL e 1500 µL da solução anterior para 05 balões volumétricos de 100 mL, cujos volumes foram completados com solução tampão fosfato-cisteína-EDTA e homogeneizados. A partir dessas diluições, foram obtidas em cada poço da microplaca, as respectivas concentrações finais: 0,45; 0,75; 1,50; 3,00 e 3,75 USP-U/mL.

As soluções foram avaliadas conforme procedimento descrito anteriormente no item 4.2.4. Realizou-se a leitura de duas microplacas contendo 03 amostras de cada diluição, totalizando 6 leituras para cada tempo de experimento (0, 15, 30 e 45 minutos).

4.2.4.4 Avaliação da atividade da matéria-prima

Para observar a manutenção da atividade da papaína nas formulações propostas na tabela 7 do item 4.2.3, faz-se necessário verificar a atividade real da matéria-prima adquirida, que desde sua aquisição, foi mantida sob refrigeração (5ºC±3).

Segundo informado no certificado de análise da Fagron, distribuidora da papaína fabricada pela Chemical Industries, a atividade proteolítica do lote adquirido é 6016 USP-U/mg. Para verificação da atividade da matéria-prima, pesou-se exatamente 100 mg de papaína 6016 USP-U/mg, os quais foram transferidos para balão volumétrico de 100 mL. O volume foi completado com solução tampão fosfato-cisteína-EDTA (conforme 4.2.4), sob agitação e homogeneização.

Transferiu-se uma alíquota de 300 µL da solução anterior para um balão volumétrico de 100mL, cujo volume foi completado com solução tampão fosfato-cisteína-EDTA e homogeneizado. Essa solução foi pipetada para a microplaca, juntamente com as outras soluções necessárias para esse ensaio, conforme descrito no item 4.2.4.2 (pág. 43), obtendo-se assim a concentração teórica de 1,5U/mL em cada poço. Realizou-se a leitura de duas microplacas contendo 06 amostras, totalizando 12 leituras para cada tempo de experimento (0, 15, 30 e 45 minutos).

Para este ensaio, também foi realizada diluição da papaína padrão, diluída conforme item 4.2.5, para que em cada poço houvesse 1,5U/mL.

4.2.4.5 Determinação da atividade proteolítica em D1 e D7

Conforme metodologia descrita no item 4.2.1, foram preparados 02 lotes de 25g para cada formulação da tabela 7, item 4.2.3, que foram divididos em 02 potes: um dos potes foi analisado 24 horas após o preparo (D1) e o outro foi analisado no sétimo dia (D7) contados a partir de D1.

O acondicionamento das amostras foi realizado em vidro incolor com tampa rosca, envolvido com papel alumínio, para proteger da luz e vedado com Parafilm®. As formulações embaladas foram mantidas sob refrigeração (5ºC±3) logo após o preparo e durante todo o período do estudo, a fim de preservar as propriedades da papaína.

As amostras ímpares foram preparadas e analisadas em dias diferentes das amostras pares. Esse procedimento foi realizado para amostras contendo como antioxidante o acetato de alfa-tocoferol e também para amostras contendo metabissulfito de sódio.

Para determinação da atividade proteolítica através de fluorimetria, conforme técnica descrita no item 4.2.4, faz-se necessária a diluição da amostra. Utilizou-se 1,303g da formulação, que foi diluída com solução tampão fosfato-cisteína-EDTA até a concentração de 2,5 U/mL em cada poço.

Realizou-se a leitura de duas microplacas contendo 03 alíquotas de cada amostra, totalizando 6 leituras para cada amostra em cada tempo de experimento (0, 15, 30 e 45 minutos).