A citotoxicidade dos sistemas microparticulados foi avaliada em função do tempo de incubação de diferentes concentrações de fármaco livre e quantidade equivalente do mesmo nas micropartículas. Estudos relatam que esse parâmetro influencia diretamente na interação do fármaco com as células e, consequentemente, na viabilidade celular (KANG et al., 2008; SANTOS et al., 2010). Foram avaliados os sistemas 1:3 MTX/PLA, MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA- PLUF68 75:25, no intuito de correlacionar o ensaio de viabilidade celular com o estudo de liberação in vitro.
Legenda: *p < 0,05, comparado a micropartículas de PLA sem fármaco.
Na Figura 38, observou-se que as micropartículas de PLA sem fármaco mostraram viabilidade celular acima de 80%, nas concentrações estudadas, em 24 e
Figura 38 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com micropartículas de PLA sem fármaco, metotrexato e sistemas MTX/PLA, em diferentes concentrações, por 24 e 48 horas (n = 4).
48 horas de incubação. É importante ressaltar que estas não apresentaram efeito sobre a proliferação de células Vero E6. Isso pode ser confirmado também pela literatura que fornece informações sobre a biocompatibilidade do PLA (GARLOTTA, 2001; MANSOUR et al., 2010; LUCKACHAN; PILLAI, 2011; LASPRILLA et al., 2012).
Por outro lado, o aumento da concentração do fármaco livre e dentro da micropartícula levou a uma diminuição da viabilidade celular. O efeito citotóxico do metotrexato, em relação às micropartículas de PLA sem fármaco (p < 0,05), ocorreu devido à inibição da atividade da enzima dihidrofolato redutase, interferindo no processo de divisão mitótica das células (RUBINO, 2001; WARREN; GRIFFITHS, 2008; FDA, 2013). Além disso, o MTX apresentou maior citotoxicidade em relação ao sistema 1:3 MTX/PLA até 24 horas. Após esse período, houve uma diminuição do número de células viáveis, indicativo de uma liberação prolongada do MTX no meio. Esse resultado corroborou com o ensaio de liberação in vitro, no qual a taxa do fármaco liberado foi de 70% nas primeiras 24 horas, atingindo 80% até 48 horas de estudo.
Figura 38 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com blendas poliméricas PLA-PLUF127 75:25, PLA-PLUF68 75:25, metotrexato, sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68 75:25, em diferentes concentrações, por 24 e 48 horas (n = 4).
Na Figura 39, observou-se que as blendas PLA-PLU apresentaram viabilidade celular acima de 80% durante o período de 24 a 48 horas. No entanto, foi possível observar uma tendência ao aumento de biocompatibilidade (> 95% do número de células viáveis), em relação ao PLA, nas primeiras 24 horas. A modificação da superfície da matriz hidrofóbica do PLA a partir de grupos hidrofílicos de poli (óxido de etileno) aumenta a biocompatibilidade do sistema (KISS; BERTÓTI; VARGHA-BUTLER, 2002).
Os sistemas MTX/PLA-PLUF127 e F68 apresentaram uma liberação prolongada do fármaco, o que pode ser visualizado pela diminuição do número de células viáveis, após 24 horas, em relação ao fármaco livre, diferentemente do estudo de liberação in vitro, no qual o fármaco foi liberado completamente em apenas 30 minutos. A discordância dos resultados pode ter ocorrido devido às diferenças físico-químicas no microambiente em que se encontravam as micropartículas em cada tipo de estudo.
Em experimentos em cultura de células, a presença de um complexo de proteínas e antibióticos pode influenciar o pH e, consequentemente, a ionização do fármaco, mas a relação entre a massa de micropartículas e o volume de meio de dissolução é mais determinante na velocidade de fármaco liberado. Portanto, o menor volume de meio, comparado ao ensaio de liberação in vitro, foi responsável pelo intumescimento do PLU, o qual se manteve na matriz, retardando a liberação do fármaco. Isso pode ter ocorrido devido ao comportamento termogelificante do Pluronic® à temperatura de 37°C (ESCOBAR-CHÀVEZ et al., 2006; PATEL, H.; PATEL, R.; PATEL, M., 2009), diminuindo a taxa de difusão do fármaco para o meio. O uso de poloxâmeros vem sendo investigado como formador de matriz in situ, através da formação de gel, para uso em sistemas de liberação de fármacos (GUO et al., 2007; MOEBUS; SIEPMANN; BODMEIER, 2009; BONACUCINA et al., 2011).
O efeito da liberação lenta do fármaco sobre o número de células viáveis em função do tempo foi mais pronunciado com o aumento da concentração de metotrexato no meio, por isso a viabilidade celular pode ser melhor avaliada na concentração máxima de 1 μg/mL.
Legenda: *p < 0,05, comparado ao metotrexato.
Na Figura acima, observou-se que a porcentagem de células viáveis dos sistemas microparticulados apresentaram diferença estatística (p < 0,05), comparado ao metotrexato. Portanto até 24 horas, uma quantidade insuficiente de fármaco foi liberada, não atingindo a ação citotóxica. Após esse período, as micropartículas liberaram uma porcentagem de fármaco equivalente à dose do MTX testado, o que tornou semelhante o número de células viáveis das amostras. Comparando os sistemas contendo Pluronic® F127 e F68, não foi possível observar diferenças significativas na taxa de liberação do fármaco, corroborando com o resultado do ensaio in vitro.
Figura 40 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com metotrexato e sistemas 1:3 MTX/PLA, MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68 75:25, na concentração de 1 μg/mL, por 24 e 48 horas.
6 CONCLUSÕES
As micropartículas de PLA contendo diferentes concentrações fármaco- polímero (1:10; 1:4,5; 1:3) e blendas poliméricas PLA-PLU, com distintas variáveis polímero-copolímero (25:75; 50:50; 75:25), foram obtidas com sucesso por spray
drying devido à alta eficiência de encapsulação dos sistemas, utilizando metodologia
analítica validada para o doseamento do metotrexato.
Quanto à distribuição do tamanho das partículas, os diferentes sistemas microparticulados apresentaram-se uniformes e com baixa polidispersão, em um intervalo de 3 a 5 μm. Em relação à morfologia, a presença do fármaco na matriz de PLA e a razão polímero:copolímero 75:25, em blendas PLA-PLU, foram determinantes para a obtenção de partículas mais esféricas, parâmetro importante na velocidade de liberação do fármaco.
Os resultados do DRX e da análise térmica mostraram que o metotrexato encontra-se disperso na matriz amorfa de PLA e nas blendas PLA-PLU, sendo confirmado principalmente pela ausência de picos cristalinos do fármaco e do seu ponto de fusão, enquanto que o tipo e a concentração de Pluronic® influenciaram a miscibilidade das blendas obtidas. A análise térmica mostrou maior miscibilidade em blendas contendo Pluronic® F127. Além disso, não foi possível observar ligações químicas entre o MTX e o PLA pela análise de FTIR. Por outro lado, a presença de fármaco favoreceu interações MTX-PLU.
No estudo de liberação in vitro do fármaco, as micropartículas de PLA contendo metotrexato apresentaram um perfil de liberação prolongada, com cinética envolvendo mecanismos de difusão e erosão, enquanto foi possível modular a velocidade de liberação do mesmo a partir de blendas poliméricas contendo PLU. Além disso, no ensaio de viabilidade celular, foi possível observar a liberação lenta do fármaco no meio, a partir de sistemas contendo PLA e blendas PLA-PLU. Diante disso, estes sistemas são promissores carreadores de fármacos biodegradáveis e biocompatíveis para modificar a velocidade de liberação do MTX com potencial para a aplicação em estudos in vivo.
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