Avaliação da integridade membrana das células Raw 264.7

Os resultados da análise da coloração com Trypan Blue nas células Raw 264.7 encontram-se na Figura 3.4, após exposição destas a 750, 1000 e 1250 µg/mL do extrato obtido por decocção, durante 24 h.

As células Raw 264.7 crescem fracamente aderidas às placas de cultura não sendo necessário tripsina para a sua separação, o que implica que ligeiras alterações no ambiente ou na sua viabilidade podem promover a sua desagregação da placa e passagem para o sobrenadante, sendo eliminadas quando este é descartado. Na figura 3.4 mostra-se o resultado da exposição destas células a várias concentrações do extrato obtido por decocção em comparação com o controlo, após ter sido removido o sobrenadante e substituído por meio contendo azul de tripano. Pelo que se pode observar, o número de células no controlo é várias vezes superior ao que se observa em qualquer uma das condições de exposição, indicando que a presença do extrato promoveu a sua descolagem das placas por alteração das ligações à mesma ou por morte celular.

As células, após a coloração com azul de tripano, foram visualizadas ao microscópio e contadas, tendo-se calculado a % de células vivas em cada condição. Observa-se que, a % de morte celular é de aproximadamente 50% a 750 µg/mL e que, aparentemente, esta morte celular é revertida para as concentrações superiores. Contudo, este deve ser o resultado de descolagem das células mortas e que entretanto foram removidas com o sobrenadante, dado que na imagem se observa um número muito baixo de células comparativamente ao controlo. Assim, a análise estatística permite verificar que apenas a concentração mais baixa apresenta diferenças significativas em relação ao controlo (p=0,0018). Contudo, estes resultados devem ser confirmados pela observação e quantificação de células no sobrenadante.

32 Figura 3.4: Avaliação da morte celular pelo método de azul de tripano. Células Raw 264.7 após

a ação do extrato decocção por 24 h, aplicado em várias concentrações (painel da esquerda). Viabilidade celular, avaliada pelo nº de células coradas a azul e nº de células vivas em função da concentração de extrato.

Nas imagens, o “C” corresponde à concentração e no gráfico o “ct” corresponde ao controlo. Os “*” indicam diferenças estatisticamente significativas em relação ao efeito da concentração, em relação ao controlo. “#” indica diferenças estatisticamente significativas em relação a diferentes concentrações com o mesmo tempo de exposição.

Verificou-se que este extrato a estas concentrações é tóxico para as células, levando à morte celular (evidente pelas células coradas a azul), mas que também leva a uma descolagem das células das placas. De notar que com concentrações elevadas, com o aumento da concentração, há um aumento aparente do número de células vivas, o que poderia significar que a elevadas concentrações, o extrato induzia o crescimento e a proliferação celular, contudo o número total de células por ensaio é bem menor que no controlo. Assim, a análise estatística permite verificar que todas as concentrações apresentam diferenças significativas em relação ao controlo (p<0,0001) e entre diferentes concentrações existem diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações de 750 e 1250 µg/mL (p=0,0070).

Os resultados da análise da viabilidade celular por coloração com TB em células Raw 264.7 após exposição à infusão encontram-se na Figura 3.5. Pela análise estatística,

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todas as concentrações apresentam diferenças significativas em relação ao controlo (p<0,05). Entre diferentes concentrações, existem diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações de 50 e 200 µg/mL (p=0,0111) e 100 e 200 µg/mL (p=0,0098). Observa-se também, nas células expostas ao extrato, uma elevada redução do número de células por campo comparando com o controlo. Contudo, e dado que as concentrações são menores, as células coradas de azul ainda têm adesão à placa sendo, portanto, observáveis ao microscópio. Aqui verifica-se uma redução na viabilidade celular que é dependente da concentração, tal como observado com o método do AB.

Figura 3.5: Avaliação da morte celular pelo método de azul de tripano. Células Raw 264.7 após

a ação do extrato infusão por 24 h, aplicado em várias concentrações (painel da esquerda). Viabilidade celular, avaliada pelo nº de células coradas a azul e nº de células vivas em função da concentração de extrato.

Nas imagens, o “C” corresponde à concentração e no gráfico o “ct” corresponde ao controlo. Os “*” indicam diferenças estatisticamente significativas em relação ao efeito da concentração, em relação ao controlo. “#” indica diferenças estatisticamente significativas em relação a diferentes concentrações com o mesmo tempo de exposição.

Em relação ao número total de células em comparação com o controlo, observa- se que este diminui com o aumento da concentração. Em termos de análise estatística, todas as concentrações apresentam diferenças significativas em comparação com o controlo (p<0,0001) e existem diferenças significativas entre as concentrações de 50 e 100 µg/mL (p=0,0211) e 50 e 200 µg/mL (p=0,0051). Estes resultados permitem inferir que o aumento da concentração provoca a diminuição do número de células vivas

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(aumento da morte celular). Além disso, o extrato provoca uma ligeira alteração da morfologia celular, como visível na figura 3.5, pela alteração da sua conformação redonda para alongada.

Os resultados da análise da coloração com TB nas células Raw 264.7 após exposição ao extrato HE em PBS e em DMSO encontram-se nas figuras 3.6 e 3.7, respetivamente. Em relação a estes extratos, verificam-se diferenças significativas entre todas as concentrações e o controlo (p=0,0025 para 50 µg/mL, p=0,0029 para 100 µg/mL e p=0,0002 para 200 µg/mL, no extrato HE (PBS), e p<0,001 para 50 µg/mL e p=0,0001 para as restantes concentrações, no extrato HE (PBS+DMSO)), independentemente do solvente utilizado para dissolver o extrato. Entre diferentes concentrações de extrato não foram verificadas diferenças significativas.

Figura 3.6: Avaliação da morte celular pelo método de azul de tripano. Células Raw 264.7 após

a ação do extrato HE (PBS) por 24 h, aplicado em várias concentrações (painel da esquerda). Viabilidade celular, avaliada pelo nº de células coradas a azul e nº de células vivas em função da concentração de extrato.

Nas imagens, o “C” corresponde à concentração e no gráfico o “ct” corresponde ao controlo. Os “*” indicam diferenças estatisticamente significativas em relação ao efeito da concentração, em relação ao controlo. “#” indica diferenças estatisticamente significativas em relação a diferentes concentrações com o mesmo tempo de exposição.

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Em ambos os casos observa-se elevada redução no nº de células por campo, que indica toxicidade dos extratos a estas concentrações (diferenças estatisticamente significativas entre todas as concentrações testadas e o controlo (p<0,0001)).

O extrato HE dissolvido em PBS (Figura 3.6), induz alteração da morfologia e uma drástica perda de viabilidade celular que não é tão aparente pela % de células mortas (100% - % de células vivas) mas que é evidente pela perda de células por campo e que resultou da sua descolagem e passagem para o sobrenadante e que entretanto foram eliminadas, aquando a colocação do meio com azul de tripano.

O mesmo se verifica nas células expostas ao extrato HE dissolvido na mistura PBS + DMSO (Figura 3.7), onde a 200 µg/mL praticamente não se observam células, e as que se observam estão quase todas coradas de azul (mortas). Estes resultados corroboram com os resultados de viabilidade do AB onde se observaram valores de IC50 muito baixos.

Figura 3.7: Avaliação da morte celular pelo método de azul de tripano. Células Raw 264.7 após

a ação do extrato HE (PBS+DMSO) por 24 h, aplicado em várias concentrações (painel da esquerda). Viabilidade celular, avaliada pelo nº de células coradas a azul e nº de células vivas em função da concentração de extrato.

Nas imagens, o “C” corresponde à concentração e no gráfico o “ct” corresponde ao controlo. Os “*” indicam diferenças estatisticamente significativas em relação ao efeito da concentração, em relação ao controlo. “#” indica diferenças estatisticamente significativas em relação a diferentes concentrações com o mesmo tempo de exposição.

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No geral, estes resultados permitem verificar que os resultados do AB corroboram com os do azul de tripano, a redução de viabilidade com este último método tem de ser fundamentada com a redução no número de células por campo.