4.5 Desempenho da modelagem com restrições experimentais
4.5.4 Avaliação da modelagem como fonte de informação sobre o conjunto de
O processo de modelagem implementado no protocolo ab initio do Rosetta consiste em partir de uma cadeia polipeptídica estendida, e sequencialmente e aleatoriamente substituir os ângulos de diedro de três ou nove resíduos dessa sequência com as informações contidas em uma biblioteca de fragmentos extraídas de estruturas de alta resolução. Essa sequência de substituições dá origem a intermediários com elementos de estrutura secundárias e estruturas cada vez mais compactas. Dessa forma, é uma simulação aproximada do processo de enovelamento proteico em que a paisagem energética é aproximada pela função de energia do Rosetta. Cada uma das estruturas resultantes desse processo de enovelamento in
a um mínimo de energia. Portanto, é razoável assumir que interações entre resíduos presentes no estado nativo também devam estar presentes em muitos desses intermediários de baixa energia. Similarmente, contatos não nativos devem se reproduzir com menor frequência pelos intermediários.
Nesta sessão, testamos a hipótese de que o conjunto de modelos gerados pelo Rosetta na ausência de restrições é capaz de discriminar restrições experimentais correspondentes a conformações próximas ao estado nativo daquelas que correspondem a potenciais falsos positivos e, além disso, que esse conjunto de restrições pode ser utilizado para melhorar a modelagem iterativamente. As Figuras 33 e 34 mostram que entre 25 e 30% das restrições experimentais são informativas para a modelagem. Partindo-se da modelagem sem restrições, avaliou-se com que frequência cada uma das restrições experimentais era validada no conjunto dos 1000 modelos. As 25% restrições mais frequentemente validadas foram selecionadas e utilizadas em uma nova rodada de modelagem. Esse processo foi repetido por três vezes para os alvos ALB-D1, ALB-D2, ALB-D3 e SalBIII.
A Figura 35 mostra o perfil de validação das restrições experimentais inicial e das restrições utilizadas em cada uma das modelagens subsequentes em função do desvio de Lmax. Para ALB-D1, por exemplo, 16% (32 restrições) das 206 restrições
experimentais iniciais são validadas pela estrutura cristalográfica (curva em preto), porém esse valor sobe para 50% (26 restrições) das 52 restrições recuperadas a partir da modelagem sem restrições (curva em vermelho). Similarmente, é possível verificar em todos os casos há aumento significativo da qualidade relativa das restrições no subconjunto recuperado em comparação com o conjunto experimental inicial. Todavia, é interessante notar que os conjuntos de restrições utilizados nas iterações 1, 2 e 3 possuem o mesmo perfil de validação. A Figura 36 mostra que as restrições recuperadas não são idênticas, mas, de fato, são muito similares. Para ALB-D2, o caso em que as restrições são mais diferentes entre si, 87% (53 restrições) das 61 restrições recuperadas são comuns nas três iterações. Para os outros casos, não mais do que duas restrições mudam entre uma iteração e outra. Dessa forma, não se observou melhora na qualidade das restrições recuperadas nas diferentes modelagens.
Figura 35: Perfil de validação das restrições a partir da avaliação de modelos gerados pelo Rosetta. Para todos os casos, se observa um aumento significativo na qualidade das restrições
recuperadas.
A Figura 37 mostra o resultado da modelagem para cada um dos conjuntos de restrições recuperados. Para todos os casos, se observa um pequeno deslocamento da distribuição da qualidade dos modelos para maiores TM-score. Entretanto, não se observa nenhuma melhoria que resulte em uma população significativa de modelos com o enovelamento correto para os alvos estudados. Esse resultado não é surpreendente uma vez que uma fração das restrições utilizadas estão associadas a grandes desvios do estado nativo, como mostrado na Figura 35. Na sessão anterior, demonstramos que poucas restrições com grandes desvios notadamente prejudicam a qualidade da modelagem. Assim, mostramos que a estratégia proposta é interessante para o enriquecimento do conjunto de restrições experimentais, mas na presente formulação não é suficiente para se observar impacto significativo na modelagem a partir da modelagem sem restrições.
Figura 36: Diagramas de Venn mostrando a complementariedade entre os conjuntos de restrições utilizados em cada uma das iterações.
Figura 37: Desempenho da modelagem com conjuntos de restrições experimentais validadas iterativamente.
Os resultados aqui apresentados foram publicados parcialmente na revista
Bioinformatics100 (Apêndice II, artigo 2).
100 Allan J. R. Ferrari et al., “Statistical Force-Field for Structural Modeling Using Chemical Cross- Linking/Mass Spectrometry Distance Constraints,” Bioinformatics, 2019, doi:10.1093/bioinformatics/btz013.
5 CONCLUSÕES
TopoLink, um pacote para a avaliação estrutural dos dados de ligação cruzada, foi desenvolvido e disponibilizado como código-fonte, interface gráfica para windows e como servidor online. TopoLink calcula as distâncias topológicas entre os resíduos acessíveis ao solvente e mostra melhor desempenho do que seus concorrentes, Jwalk e Xwalk.
Utilizando um banco de dados de estruturas de alta resolução, derivou-se um novo conjunto de distâncias estatísticas para avaliação de estruturas com dados de ligação cruzada, tendo em vista a natureza física do dado obtido. Essas distâncias são consistentemente menores do que as utilizadas pela comunidade atualmente.
Um campo de forças designado para modelar restrições provenientes dos experimentos de ligação cruzada foi desenvolvido. As funções de energia potencial representando as restrições foram obtidas da estatística das distâncias entre resíduos expostos ao solvente também a partir da análise de um banco de dados de estruturas de alta resolução. A função de energia potencial é dependente da distância Euclidiana entre os resíduos e das propriedades estruturais do agente de ligação cruzada e associa interações mais favoráveis aos pares de resíduos que estão mais provavelmente associados com um caminho topológico válido. O campo de forças foi implementado no pacote de modelagem Rosetta e expressivamente melhorou a qualidade dos modelos obtidos sob condições de restrições teóricas e experimentais. Esses resultados trazem à realidade a possiblidade de modelar a estrutura terciária de proteínas a partir dos dados de XLMS, especialmente aquelas que não possuem outros dados estruturais disponíveis ou cujos dados são insuficientes para caracterizar o enovelamento da proteína alvo.
Neste trabalho, abordamos o problema de modelagem a partir da perspectiva de obtenção de um conjunto de restrições corretas do ponto de vista da estrutura cristalográfica ou que amostrem as vizinhanças da estrutura nativa. Novas estratégias precisam ser desenvolvidas para lidar com a presença de múltiplas conformações e a presença de dados ruidosos. Também, mostramos pela primeira vez que um conjunto de modelos gerados pode ser utilizado como fonte de informação para enriquecimento da qualidade das restrições experimentais.
Finalmente, esse é o primeiro trabalho que avalia sistematicamente o efeito das restrições de ligação cruzada na predição da estrutura terciária de proteínas e
deve contribuir no esforço de trabalhos futuros em estabelecer essa técnica como uma fonte poderosa de informação no estudo da estrutura e conformação de proteínas em solução.
Como resultado dessa tese, dois artigos foram publicados como primeiro autor e um terceiro está sob revisão. Também, outros dois artigos em colaboração utilizando o conhecimento aqui produzido foram publicados.
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