Espectrometria de massas (MS) é um método que permite o estudo de íons na fase gasosa, sendo aplicado para a identificação, a caracterização estrutural e quantificação de compostos47. A utilização de MS para análise de macromoléculas
esteve por muito tempo limitada, pois não havia tecnologia que permitisse a ionização e transferência dessas moléculas para a fase gasosa. No final da década de 1980,
42 Peter M. Bowers et al., “De Novo Protein Structure Determination Using Sparse NMR Data,” Journal
of Biomolecular NMR 18, no. 4 (December 2000): 311–318, doi:10.1023/A:1026744431105; Yuefeng
Tang et al., “Protein Structure Determination by Combining Sparse NMR Data with Evolutionary Couplings,” Nature Methods 12, no. 8 (August 2015): 751–754, doi:10.1038/nmeth.3455; James M. Thompson et al., “Accurate Protein Structure Modeling Using Sparse NMR Data and Homologous Structure Information,” Proceedings of the National Academy of Sciences 109, no. 25 (June 2012): 9875–9880, doi:10.1073/pnas.1202485109.
43 Dina Schneidman-Duhovny et al., “Integrative Structural Modeling with Small Angle X-Ray Scattering Profiles,” BMC Structural Biology 12 (2012): 17–17, doi:10.1186/1472-6807-12-17.
44 Frank DiMaio et al., “Atomic-Accuracy Models from 4.5-Å Cryo-Electron Microscopy Data with Density-Guided Iterative Local Refinement,” Nature Methods 12, no. 4 (April 2015): 361–365, doi:10.1038/nmeth.3286.
45 Sergey Ovchinnikov et al., “Protein Structure Determination Using Metagenome Sequence Data,”
Science 355, no. 6322 (January 2017): 294–298, doi:10.1126/science.aah4043; Ovchinnikov Sergey et
al., “Improved de Novo Structure Prediction in CASP11 by Incorporating Coevolution Information into Rosetta,” Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 84, no. S1 (February 2016): 67–75, doi:10.1002/prot.24974.
46 Nicholas I. Brodie et al., “Solving Protein Structures Using Short-Distance Cross-Linking Constraints as a Guide for Discrete Molecular Dynamics Simulations,” Science Advances 3, no. 7 (July 2017): e1700479, doi:10.1126/sciadv.1700479; Adam Belsom et al., “Serum Albumin Domain Structures in Human Blood Serum by Mass Spectrometry and Computational Biology,” Molecular & Cellular
Proteomics : MCP 15, no. 3 (March 2016): 1105–1116, doi:10.1074/mcp.M115.048504; Dos Santos et
al., “Enhancing Protein Fold Determination by Exploring the Complementary Information of Chemical Cross-Linking and Coevolutionary Signals,” Bioinformatics, 2018, bty074, doi:10.1093/bioinformatics/bty074.
surgiram as técnicas de ionização “suaves” ESI (ElectroSpray Ionization)48 e MALDI
(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization)49 que permitiram a análise de peptídeos,
proteínas e ácidos nucleicos sem fragmentação durante a transferência para a fase gasosa ou necessidade de derivatização50.
O desenvolvimento dessas técnicas impulsionou uma grande e rápida evolução dos analisadores de massas associados, levando à disponibilização comercial de instrumentos com capacidade de experimentos de MS sequenciais (MSn), possuindo plataformas de diversas geometrias combinando diferentes
analisadores, como quadrupolo – tempo de voo (Q-TOF), tempo de voo – tempo de voo (TOF-TOF), ion trap linear (LIT), ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (FTICR)51, ion trap – orbitrap (LTQ-Orbitrap) e quadrupolo –
orbitrap (Q-Orbitrap)52, entre outros. Desde então, com instrumentos de desempenho
cada vez melhores, o uso da espectrometria de massas na análise de proteínas evoluiu extensivamente, a ponto de se tornar rotineiro no sequenciamento e identificação de proteínas, determinação da massa molecular de proteínas e complexos proteicos intactos, determinação de parceiros de interação, identificação e localização de modificações pós-traducionais e quantificação absoluta e relativa de proteínas53. Somando-se a isso, o desenvolvimento de metodologias envolvendo
48J. B. Fenn et al., “Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,” Science
(New York, N.Y.) 246, no. 4926 (October 1989): 64–71, doi:10.1126/science.2675315.
49M. Karas et al., “Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10,000 Daltons,” Analytical Chemistry 60, no. 20 (October 1988): 2299–2301.
50 R. Aebersold et al., “Mass Spectrometry in Proteomics,” Chemical Reviews 101, no. 2 (February 2001): 269–295; Jennifer Griffiths, “A Brief History of Mass Spectrometry,” Analytical Chemistry 80, no. 15 (August 2008): 5678–5683, doi:10.1021/ac8013065.
51A. G. Marshall et al., “Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry: A Primer,”
Mass Spectrometry Reviews 17, no. 1 (February 1998): 1–35, doi:10.1002/(SICI)1098-
2787(1998)17:1<1::AID-MAS1>3.0.CO;2-K.
52 Qizhi Hu et al., “The Orbitrap: A New Mass Spectrometer,” Journal of Mass Spectrometry 40, no. 4 (2005): 430–443, doi:10.1002/jms.856.
53 R. Aebersold et al., “Mass Spectrometry in Proteomics,” Chemical Reviews 101, no. 2 (February 2001): 269–295; Ruedi Aebersold et al., “Mass Spectrometry-Based Proteomics,” Nature 422, no. 6928 (March 2003): 198–207, doi:10.1038/nature01511; Scott D. Patterson et al., “Proteomics: The First Decade and Beyond,” Nature Genetics 33 Suppl (March 2003): 311–323, doi:10.1038/ng1106; Hanno Steen et al., “The ABC’s (and XYZ’s) of Peptide Sequencing,” Nature Reviews. Molecular Cell Biology 5, no. 9 (September 2004): 699–711, doi:10.1038/nrm1468; John R. Yates, “Mass Spectral Analysis in Proteomics,” Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 33 (2004): 297–316, doi:10.1146/annurev.biophys.33.111502.082538; Bruno Domon et al., “Mass Spectrometry and Protein Analysis,” Science (New York, N.Y.) 312, no. 5771 (April 2006): 212–217,
cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UPLC) acoplada à MS para análise de misturas complexas de peptídeos resultantes de digestão enzimática de uma grande variedade de proteínas, além do crescimento das ferramentas de bioinformática para buscas em bancos de dados, possibilitou a realização de estudos de proteômica em larga escala, chamados também de proteômica shotgun54.
A aplicação abrangente de MS no estudo de proteínas se deve principalmente às vantagens intrínsecas da técnica como a alta sensibilidade, versatilidade, robustez, velocidade na aquisição de dados e aplicabilidade universal, uma vez que não há limite teórico de tamanho e complexidade do sistema a ser analisado. Além disso, para o caso de estudos estruturais in vitro não há necessidade do elevado grau de pureza das amostras, o que é requisito para técnicas de alta resolução. Por esses motivos, várias tecnologias e metodologias baseadas em MS foram impulsionadas para análise estrutural de proteínas (Figura 11), como troca hidrogênio-deutério (HDX)55, mapeamento radicalar oxidativo (Footprinting)56,
Mobilidade Iônica (IM)57, análise nativa de proteínas por espectrometria de massas
(native MS)58, e ligação cruzada associada à espectrometria de massas (XLMS)59.
doi:10.1126/science.1124619; Benjamin F. Cravatt et al., “The Biological Impact of Mass-Spectrometry- Based Proteomics,” Nature 450 (December 2007): 991–1000, doi:10.1038/nature06525.
54 D. A. Wolters et al., “An Automated Multidimensional Protein Identification Technology for Shotgun Proteomics,” Analytical Chemistry 73, no. 23 (December 2001): 5683–5690; Michael Kinter et al.,
Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry (John Wiley & Sons, 2000).
55 Y. Bai et al., “Primary Structure Effects on Peptide Group Hydrogen Exchange,” Proteins 17, no. 1 (September 1993): 75–86, doi:10.1002/prot.340170110; John R. Engen et al., “Hydrogen Exchange Mass Spectrometry for Conformational Analysis of Proteins,” in Encyclopedia of Analytical Chemistry (American Cancer Society, 2011), doi:10.1002/9780470027318.a9201; S Walter Englander et al., “Mechanisms and Uses of Hydrogen Exchange,” Current Opinion in Structural Biology 6, no. 1 (February 1996): 18–23, doi:10.1016/S0959-440X(96)80090-X.
56Guozhong Xu et al., “Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for Structural Proteomics,” Chemical Reviews 107, no. 8 (August 2007): 3514–3543, doi:10.1021/cr0682047. 57 Megan M. Maurer et al., “Advances in Ion Mobility-Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques for Characterizing Structural Heterogeneity,” Analyst 140, no. 20 (September 2015): 6782– 6798, doi:10.1039/C5AN00922G.
58 Aneika C. Leney et al., “Native Mass Spectrometry: What Is in the Name?,” Journal of the American
Society for Mass Spectrometry 28, no. 1 (2017): 5–13, doi:10.1007/s13361-016-1545-3.
59Andrea Sinz, “The Advancement of Chemical Cross-Linking and Mass Spectrometry for Structural Proteomics: From Single Proteins to Protein Interaction Networks,” Expert Review of Proteomics 11, no. 6 (December 2014): 733–743, doi:10.1586/14789450.2014.960852.
Esse conjunto de técnicas deu origem ao conceito de proteômica estrutural baseado em espectrometria de massas60.
Figura 11: Algumas metodologias que compõem a área de proteômica estrutural baseadas em espectromeria de massas.