Avaliação da resistência térmica de esporos de C difficile

4.4.1. Preparo de caldo de carne

Para o preparo do caldo de carne, 300 g de peito bovino (M. pectoralis e M. intercostais) foram submetidos ao cozimento (100°C/50 min) em água destilada (quantidade suficiente para atingir 1.000 g). Em seguida, o caldo foi esterilizado em autoclave a 121°C/15 min. O ácido cítrico foi adicionado após a esterilização, em quantidade suficiente, para atingir o pH 5,3. O pH foi medido em pHmetro (Digmed).

4.4.2. Resistência térmica de C. difficile

A resistência térmica de C. difficile foi determinada em caldo de carne com pH modificado (pH 5,3), 150 ppm de nitrito de sódio, 2% de cloreto de sódio, nas temperaturas de 72, 77 e 82°C, utilizando-se a metodologia de tempo de destruição térmica em tubos (STUMBO, 1973). Em cada tubo TDT (tubo de 10x6 mm e 2 mm de espessura do vidro), foram adicionados 0,2 mL de suspensão de esporos de C. difficile padronizada em 108 esporos/mL e 1,8 mL de caldo de carne (150 ppm de nitrito de sódio e 2% de cloreto de sódio, pH 5,3). Em seguida, os tubos foram selados com gás oxigênio (O2) e gás liquefeito de petróleo (GLP). Os tubos foram

imersos em banho termostático com agitação e controle de temperatura (Polystat®, EUA, ±0,2ºC). Para cada intervalo de tempo foram removidos do banho termostático três tubos TDT, estes foram imediatamente resfriados em banho de gelo até a temperatura ambiente. Após o resfriamento, cada tubo TDT foi aberto, o conteúdo foi coletado em placa Petri estéril e foram preparadas as diluições decimais seriadas para contagem de sobreviventes ao tratamento térmico por plaqueamento em profundidade em meio RCA. A incubação das placas foi realizada em anaerobiose a 37°C por 48 h e os resultados expressos em esporos por mililitro (esporos/mL).

Para todas as temperaturas testadas usou-se um tubo TDT correspondente ao tempo zero que foi submetido apenas ao choque térmico para ativação dos esporos (80°C por 10 min).

Ressalta-se que o tempo entre a retirada de cada tubo TDT do banho termostático, o resfriamento em banho de gelo, a diluição decimal seriada e o plaqueamento foi inferior a 10 min.

A Tabela 3 contêm os intervalos de tempo nos quais foram retiradas as amostras de tubo TDT em cada temperatura de estudo, sendo que em cada ensaio foram realizadas 6 amostragens.

Tabela 3. Planejamento de amostragem para cada temperatura de ensaio. Temperatura (°C) Tempo de aquecimento (min) Intervalo de tempo para retirada de tubo

TDT (min)

72 160 32

77 70 14

82 25 5

4.4.3. Determinação dos parâmetros cinéticos de destruição térmica de

C. difficile

Os valores do parâmetro D (min) e do parâmetro z (°C) foram calculados por regressão da curva de sobrevivência (logaritmo do número de sobreviventes em função do tempo) e da curva de tempo de morte térmica (curva TDT) (logaritmo dos valores de D em função da temperatura), respectivamente (PFLUG, 1988).

Na temperatura de 72°C, a curva de sobreviventes apresentou desvio de linearidade pela presença de cauda. Foi calculado pelo software GInaFiT (GEERAERD; VALDRAMIDIS; VAN IMPE, 2005) o tempo para a primeira redução decimal (parâmetro δ72°C), de acordo com modelo Weibull, proposto por Mafart et al.

(2002).

4.4.4. Avaliação da resistência térmica a 72°C em diferentes concentrações de sais e de nitrito de sódio

A avaliação da combinação dos efeitos das concentrações de nitrito de sódio e blend de sais (cloreto de sódio, cloreto de cálcio e cloreto de potássio) na resistência térmica de C. difficile em caldo de carne a 72°C foi investigada por meio de um delineamento fatorial completo 22 com 3 repetições no ponto central (Tabelas 4 e 5).

Para a substituição do cloreto de sódio, foi utilizado um blend de sais composto de 50% de cloreto de cálcio e 50% de cloreto de potássio com o objetivo de evitar o gosto amargo de KCl e o sabor metálico do CaCl.

Nos EUA a recomendação para cozimento de produtos cárneos bovinos e suínos é atingir 71°C no centro geométrico do alimento, no entanto para produtos de aves a temperatura recomendada é 73,9°C (USDA, 2011). Como muitos produtos cárneos emulsionados possuem em sua formulação carne mecanicamente separada, nos ensaios de delineamento fatorial foi utilizada a temperatura 72°C.

Delineamentos fatoriais são amplamente utilizados em experimentos envolvendo diversos fatores em que é necessário investigar a interação dos fatores numa variável de resposta (MYERS; MONTGOMERY; ANDERSON-COOK, 2009).

Um delineamento fatorial completo consiste de todas as combinações possíveis entre todos os níveis de cada fator (COX; REID, 2000; RODRIGUES; IEMMA, 2014).

Um planejamento fatorial onde cada um dos k fatores de interesse tem apenas dois níveis é denominado de delineamento fatorial 2k, pois cada replicata possui 2k ensaios (MYERS; MONTGOMERY; ANDERSON-COOK, 2009).

A adição de pontos centrais em delineamentos fatorais permite o cálculo de resíduos e uma estimativa do erro padrão (RODRIGUES; IEMMA, 2014). Além disso, a adição de pontos centrais fornece proteção contra efeitos de curvatura quadrática e não afeta as estimativas dos efeitos em um delineamento de 2k

(MONTGOMERY; MCCARVILLE; CUSTER, 2009).

As estimativas dos efeitos dos fatores de um delineamento fatorial 22

podem ser convertidas em um modelo de regressão linear (Equação 1) que, por sua vez, pode ser usado para prever a variável resposta ( ) em qualquer ponto do espaço abrangido pelos níveis dos fatores no delineamento (MYERS; MONTGOMERY; ANDERSON-COOK, 2009).

Equação 1. Modelo de regressão linear.

Na Equação 1, _e são as variáveis codificadas que representam os dois fatores de interesse, já _{os s são os coeficientes de regressão} e _{é o termo para o} erro. Este modelo de regressão linear descreve um plano como superfície de resposta(MYERS; MONTGOMERY; ANDERSON-COOK, 2009).

Para cada ensaio da Tabela 4, foi adicionado ao caldo de carne com pH modificado (pH 5,3) a respectiva quantidade de nitrito e do blend de sais.

Tabela 4. Delineamento fatorial 22 com 3 repetições no ponto central para avaliação da combinação dos efeitos das concentrações de nitrito de sódio e blend de sais na resistência térmica de C. difficile a 72°C.

Ensaio Concentração de Nitrito de Sódio (ppm) ( ) Blend ( ) 1 100 2 g de NaCl; 0 g de KCl; 0 g de CaCl2 2 200 2 g de NaCl; 0 g de KCl; 0 g de CaCl2 3 100 1 g de NaCl; 0,5 g de KCl; 0,5 g de CaCl2 4 200 1 g de NaCl; 0,5 g de KCl; 0,5 g de CaCl2 5 150 1,5 g de NaCl; 0,25 g de KCl; 0,25 g de CaCl2 6 150 1,5 g de NaCl; 0,25 g de KCl; 0,25 g de CaCl2 7 150 1,5 g de NaCl; 0,25 g de KCl; 0,25 g de CaCl2

Tabela 5. Variáveis e níveis utilizados no planejamento experimental.

Variável _-1 Níveis _{0 1} Concentração de Nitrito de Sódio (ppm) ( ) 100 150 200 Blend ( ) 1 g de NaCl; 0,5 g de KCl; 0,5 g de CaCl2 1,5 g de NaCl; 0,25 g de KCl; 0,25 g de CaCl2 2 g de NaCl; 0 g de KCl; 0 g de CaCl2

A resistência térmica de C. difficile foi determinada pela metodologia descrita no item 4.4.2, para a temperatura de 72°C.

O delineamento fatorial foi analisado utilizando o software Statistica 12 (Statsoft, Inc.) com 95% de significância.