Faculdade de Engenharia de Alimentos
ERIKA GOMES SANTOS
INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO DE SÓDIO E SAIS SUBSTITUTOS AO CLORETO DE SÓDIO NA RESISTÊNCIA TÉRMICA DE
CLOSTRIDIUM DIFFICILE EM CALDO DE CARNE
CAMPINAS 2019
ERIKA GOMES SANTOS
INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO DE SÓDIO E SAIS SUBSTITUTOS AO CLORETO DE SÓDIO NA RESISTÊNCIA TÉRMICA DE
CLOSTRIDIUM DIFFICILE EM CALDO DE CARNE
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Dirce Yorika Kabuki
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ERIKA GOMES SANTOS E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. DIRCE YORIKA KABUKI.
CAMPINAS 2019
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Márcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647
Santos, Erika Gomes,
Sa59i SanInfluência da concentração de nitrito de sódio e sais substitutos ao cloreto de sódio na resistência térmica de Clostridium difficile em caldo de carne / Erika Gomes Santos. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
SanOrientador: Dirce Yorika Kabuki.
SanDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
San1. Clostridium difficile. 2. Produtos cárneos. 3. Esporos. I. Kabuki, Dirce Yorika. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Influence of the concentration of sodium nitrite and salts
substitutes to sodium chloride on the thermal resistance of Clostridium difficile in meat broth Palavras-chave em inglês:
Clostridium difficile Meat products Spores
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Mestra em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Dirce Yorika Kabuki [Orientador] Alessandra Regina da Silva Marques Renata Bromberg
Data de defesa: 27-02-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
______________________________________________________________________ Profa. Dra. Dirce Yorika Kabuki
Faculdade de Engenharia de Alimentos, FEA, UNICAMP Orientadora
______________________________________________________________________ Dra. Alessandra Regina da Silva Marques
LABTERMO Membro Titular
______________________________________________________________________ Dra. Renata Bromberg
Instituto de Tecnologia de Alimentos, ITAL Membro Titular
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria de Pós- Graduação da Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Gostaria de agradecer aos meus pais, irmãos e sobrinhos pelo amor, apoio e incentivo em todas as etapas.
Agradeço ao Prof. José Luís e à Profa. Dirce por terem me aceitado como orientada. Em especial, agradeço à professora Dirce pelo acompanhamento, pela confiança, pela amizade, por todos os ensinamentos, pela experiência de PED e por estar sempre presente.
A todos da LabTermo, obrigada pela oportunidade e aprendizado em microbiologia. Agradeço à Profa. Pilar pela confiança e pelos valiosos ensinamentos. Alê, você é uma pessoa maravilhosa, muito obrigada pela amizade, pelos conselhos e orientação no “mundo da micro”, aprendi muito com você!
A todos os professores, funcionários e alunos da área de Microbiologia, muito obrigado pela ajuda! Ju, Aninha e Norma não há palavras suficientes para agradecer por todo apoio durante o mestrado!
À minha amiga Ju Carusi & família, que tornaram a jornada mais leve e os dias mais alegres.
Aos amigos de laboratório Marina, Taísa, Andrea, Matheus, Caio, Murilo e Karen agradeço pelo carinho, pelos risos e por toda ajuda.
Aos queridos amigos da Casa da ABU, obrigada pela paciência, convivência, amizade, ajuda e ensinamentos. Fabi, Eltermann, Sydnei, Ricardo, Lucas, Thais, Baker, Aline e Érika foi muito divertido morar com vocês!
Agradeço a todos da IPBG e da ABU pela amizade, ajuda e ensinamentos, guardarei com carinho todas as lembranças!
À Sufis/Gecoq da Conab, muito obrigada pelo apoio e compreensão.
A todos os professores e funcionários da Faculdade de Engenharia de Alimentos agradeço pela contribuição na minha formação.
Agradeço aos professores membros da banca de defesa, todas as contribuições e sugestões tornaram meu trabalho melhor.
Agradeço ao CNPq pelo apoio financeiro.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) código de financiamento 001.
A infecção causada por Clostridium difficile (CDI) está associada ao tratamento com antibióticos e pode variar desde diarreia a grave colite pseudomembranosa. Os fatores de risco relacionados ao CDI incluem longos períodos de hospitalização, exposição a antibióticos, comorbidades subjacentes e idade superior a 65 anos. Recentemente, os casos de CDI têm sido observados na comunidade, em populações consideradas de baixo risco, tais como os jovens. Diversas pesquisas mostram que animais são portadores assintomáticos de C. difficile, assim a transmissão por meio de alimentos de origem animal é uma potencial fonte de contaminação. Todavia, faltam estudos para comprovar a transmissão da doença por alimentos. Além disso, os esporos de C. difficile podem resistir por até 2 h a 71°C em solução salina tamponada. O objetivo desta pesquisa foi estudar a ocorrência de C. difficile em produtos cárneos, os parâmetros de resistência térmica (D e z) de seus esporos em caldo de carne (72°C, 77°C e 82°C) e a influência da concentração de nitrito de sódio e sais substitutos na resistência térmica de esporos de C. difficile a 72°C, em caldo de carne, por meio de um delineamento fatorial 22, com triplicata no ponto central. Foram analisadas 45
amostras de produtos cárneos adquiridas em estabelecimentos comerciais, entretanto nenhuma amostra apresentou contaminação por C. difficile. Na temperatura 72°C, a curva de sobreviventes para os esporos de C. difficile, em caldo de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2, apresentou desvio de
linearidade (cauda), sendo que o tempo para primeira redução decimal (δ), determinado de acordo com o modelo Weibull, proposto por Mafart et al. (2002), nessa temperatura foi de 31,87 min. Já nas temperaturas de 77°C e 82°C, o valor de D calculado por regressão linear foi de 14,04 min e 4,23 min, respectivamente. O valor de z obtido por regressão linear foi de 11,4°C, com coeficiente de ajuste de 0,988. Foi verificado que a substituição parcial (50%) de cloreto de sódio por uma mistura de cloreto de potássio (50%) e cloreto de cálcio (50%) não afetou a resistência térmica de C. difficile a 72°C em caldo de carne pH 5,3, ao nível de
The infection caused by Clostridium difficile (CDI) is associated with antibiotic treatment and can range from diarrhea to severe pseudomembranous colitis. Risk factors related to CDI include long period of hospitalization, exposure to antibiotics, underlying comorbidities and age over 65 years. Recently, cases of CDI have been observed in the community, in people considered to low risk, such as young people. Several studies show that animals are asymptomatic carriers of C. difficile, so the transmission from animal food is considered a potential source of contamination. Although there have been no confirmed cases of any foodborne disease caused by C. difficile. In addition, C. difficile spores may survive for 2 h at 71° C in phosphate buffered saline. The aim of this study was to investigate the C. difficile occurrence in meat products, the parameters of thermal resistance of C. difficile spores in meat broth (72°C, 77°C and 82°C) and the influence of the concentration of sodium nitrite and substitute salts in the thermal resistance of C. difficile spores at 72°C in meat broth, by a factorial design 22, with triplicate at the central point. A total of 45 samples
of meat products purchased at commercial establishments were analyzed, although contamination with C. difficile was not found. At 72°C, the survival curve for the C. difficile spore in meat broth, pH 5,3, with 2% NaCl and 150 ppm NaNO2 showed linearity deviation (tail), the time for first decimal reduction (δ), determined according to the Weibull model, proposed by Mafart et al. (2002) at this temperature was 31,87 min. At temperatures of 77°C and 82°C, the D value calculated by linear regression was 14,04 min and 4,23 min, respectively. The z value obtained by linear regression was 11,4°C, with a coefficient of adjustment of 0.988. It was found that the partial replacement (50%) of sodium chloride by a mixture of potassium chloride (50%) and calcium chloride (50%) did not affect the thermal resistance of C. difficile at 72°C in meat broth pH 5,3 at a significance level of 95%. Although sodium nitrite did not inhibit C. difficile growth, the combined effect of sodium nitrite concentration and temperature on thermal resistance was statistically significant (p-value <0.05).
Figura 2. Casos de CDI nos Estados Unidos ... 30
Figura 3. A: PaLoc - tcdR, tcdB, tcdE, tcdA e tcdC. B: Genes codificadores da toxina binária - cdtR, cdtA e cdtB ... 33
Figura 4. Fluxograma de detecção de C. difficile por plaqueamento direto e com tratamento alcoólico para ativação de esporos ... 53
Figura 5. Produtos de amplificação dos genes tpi nos micro-organismos isolados de amostras de produtos cárneos (I1-I13) e nas cepas de referência de C. difficile (VPI) por meio da técnica da PCR ... 62
Figura 6. Curva de sobreviventes de C. difficile a 72°C, em caldo de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2 ... 66
Figura 7. Curva de sobreviventes de C. difficile a 77°C, em caldo de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2 ... 67
Figura 8. Curva de sobreviventes de C. difficile a 82°C, em caldo de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2 ... 67
Figura 9. Curva TDT. ... 73
Figura 10. Curva de sobreviventes a 72°C ... 74
Figura 11. Diagrama de Pareto (Equação 2) ... 75
Figura 12. Superfície de resposta para δ72°C (min) ... 79
Figura 13. Curva de contorno para δ72°C (min) ... 79
Tabela 2. Prevalência da contaminação de alimentos por C. difficile. ... 39 Tabela 3. Planejamento de amostragem para cada temperatura de ensaio. ... 59 Tabela 4. Delineamento fatorial 22 com 3 repetições no ponto central para avaliação da combinação dos efeitos das concentrações de nitrito de sódio e blend de sais na resistência térmica de C. difficile a 72°C. ... 61 Tabela 5. Variáveis e níveis utilizados no planejamento experimental. ... 61 Tabela 6. Parâmetros de resistência térmica a 72°C de C. difficile em caldo de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2. ... 67
Tabela 7. Parâmetros de resistência térmica a 77°C e a 82°C de C. difficile em caldo de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2. ... 68
Tabela 8.Resultados de δ72°C. ... 74 Tabela 9. Coeficientes de regressão do delineamento fatorial 22 para as variáveis concentração de NaNO2 e concentração de NaCl no blend. ... 75
Tabela 10. Análise de variância (ANOVA) do modelo linear proposto para a resistência térmica de C. difficile a 72°C em caldo de carne contendo NaNO2 e NaCl.
... 78 Tabela 11. Coeficientes de regressão para delineamento fatorial 22 para a variável concentração de NaNO2. ... 80
Tabela 12. Análise de variância (ANOVA) do modelo linear proposto para a resistência térmica de C. difficile a 72°C em caldo de carne contendo NaNO2, pH 5,3.
... 81 Tabela A1. δ72°C observados e δ72°C preditos (Equação 2). ... 119 Tabela A2. δ72°C observados e δ72°C preditos (Equação 3). ... 120
1. Introdução Geral... 14
2. Objetivos ... 16
3. Revisão Bibliográfica ... 17
3.1. Produção de carnes no Brasil ... 17
3.1.1. Cloreto de sódio na dieta e nos produtos cárneos... 18
3.1.2. Nitrito de sódio nos produtos cárneos ... 23
3.2. Clostridium difficile ... 25 3.2.1. Patogenicidade de C. difficile... 30 3.2.2. Ocorrência em alimentos ... 35 3.2.3. C. difficile no Brasil ... 46 3.3. Resistência térmica... 48 4. Material e Métodos ... 50
4.1. Prevalência de C. difficile em produtos cárneos processados ... 51
4.1.1. Amostras... 51
4.1.2. Detecção de C. difficile ... 51
4.1.3. Identificação dos isolados por Polymerase Chain Reaction ... 54
4.2. Micro-organismo ... 55
4.2.1. Preparo da suspensão de esporos de C. difficile ... 55
4.2.2. Contagem da suspensão de esporos ... 56
4.3. Crescimento de esporos de C. difficile em presença de nitrito de sódio ... 57
4.4. Avaliação da resistência térmica de esporos de C. difficile ... 57
4.4.1. Preparo de caldo de carne... 57
4.4.2. Resistência térmica de C. difficile ... 58
4.4.3. Determinação dos parâmetros cinéticos de destruição térmica de C. difficile ... 59
4.4.4. Avaliação da resistência térmica a 72°C em diferentes concentrações de sais e de nitrito de sódio ... 59
5. Resultados e Discussão ... 62
5.1. Detecção de C. difficile em produtos cárneos processados ... 62
5.3.2. Avaliação da influência das concentrações de NaCl e NaNO2 na
resistência térmica de C. difficile a 72°C ... 74
6. Conclusão ... 81
7. Referências ... 82
8. Apêndices ... 119
1. Introdução Geral
A carne e os produtos cárneos são gêneros alimentícios de grande interesse econômico. A carne desempenha um papel crucial na evolução humana e é um importante componente de uma dieta saudável e bem equilibrada devido à sua riqueza nutricional. O mérito nutricional da carne é função da sua composição de proteína de alto valor biológico, que contém todos os aminoácidos essenciais, bem como minerais biodisponíveis, vitaminas e micronutrientes como ferro, selênio, zinco e vitamina B12 (LEDESMA; RENDUELES; DÍAZ, 2016).
Os produtos cárneos emulsionados são muito populares e consumidos tanto em nível doméstico como no mercado de alimentação rápida (BETANHO; SHIMOKOMAKI; OLIVO, 1994; JIMENEZ-COLMENERO; CARBALLO; COFRADES, 2001). O consumo de produtos de origem animal, incluindo a carne e os produtos cárneos, tem expandido globalmente com o aumento da renda familiar. Em paralelo, a demanda por produtos seguros e de alta qualidade também cresceu com os novos conceitos de produto natural e produto rótulo limpo (ALAHAKOON et al., 2015).
Por outro lado, muitas pessoas acreditam que o consumo de carne e de produtos cárneos não é saudável porque o alto conteúdo de gordura, colesterol e antimicrobianos pode estar associado com o desenvolvimento de doenças degenerativas (SERRANO et al., 2007).
O sal tem sido utilizado desde os tempos antigos para preservação de produtos cárneos e constitui-se em um excelente realçador de sabor e aroma, além de ser o responsável pela textura característica dos produtos emulsionados, devido à extração das proteínas miofibrilares, que contribuem efetivamente para o aumento da capacidade de retenção de água, formação de gel e emulsão, bem como ligação de gordura na matriz cominuída e estabilizada após o cozimento. Assim, quanto maior a extração das proteínas miofibrilares, mais fácil é a incorporação de gordura nas massas, formando uma emulsão mais estável (TERRELL, 1983).
O consumo de sódio na maioria dos países excede a recomendação nutricional, o que preocupa as agências de saúde pública em todo o mundo devido à associação entre a elevada ingestão de sódio e o desenvolvimento de inúmeras doenças, principalmente a hipertensão (DAHL, 1972; FRIES, 1976; LAW; FROST;
WALD, 1991a; 1991b; 1991c; ADROGUÉ; MADIAS, 2007). A hipertensão, por sua vez, é considerada fator de risco para doenças cardíacas, doenças renais e acidente vascular cerebral (LEWINGTON et al., 2002).
Uma das maiores fontes de sódio na dieta é proveniente do cloreto de sódio que, por sua vez, é amplamente utilizado em produtos cárneos industrializados (WHO, 2003; ALIÑO et al., 2010) devido aos seus benefícios tecnológicos e as suas propriedades em conferir sabor, textura e extensão da vida útil (ARMENTEROS et al., 2012; SOFOS, 1983; TERRELL, 1983).
Por outro lado, a qualidade microbiológica dos produtos cárneos está associada às Boas Práticas de Fabricação, como o uso de matéria-prima de qualidade e condições adequadas de processamento.
Neste sentido, estudos têm demonstrado que alguns animais são portadores assintomáticos de C. difficile, assim a transmissão por meio de alimentos de origem animal é considerada como uma potencial fonte de contaminação (HENSGENS et al., 2012). O C. difficile já foi isolado a partir de bezerros (KEEL et al., 2007), cavalos (BÅVERUD et al., 2003), porcos (AL SAIF, BRAZIER, 1996; COSTA et al., 2013; KEEL et al., 2007), aves (ZIDARIC et al., 2008), avestruzes (FRAZIER et al., 1993), entre outros.
C. difficile é um bactéria Gram-positiva, anaeróbia, produtora de esporos e toxinas. As toxinas produzidas pelo C. difficile causam diarreia, podendo evoluir para colite pseudomembranosa levando à dilatação de cólon, sepse e até morte. Este agente é uma das principais causas de diarreia associada ao tratamento prévio com antibióticos (CURRY, 2010).
A microbiota intestinal, tanto do homem como dos animais, quando íntegra, impede a colonização pelo C. difficile. Todavia, os antibióticos constituem o principal fator de alteração da microbiota, provocando a sua substituição por micro-organismos resistentes aos antimicrobianos em uso, os quais proliferam e podem provocar quadros patológicos diversos (CARRICO et al., 2008).
Houve duas principais mudanças na epidemiologia da CDI ao longo dos últimos anos. A primeira foi um aumento na incidência e severidade de CDI associado ao tratamento hospitalar, com muitos surtos, altas taxas de mortalidade e pior resposta ao tratamento. Isto foi em grande parte atribuída ao surgimento e disseminação do ribotipo NAP1/027, mas outros fatores, como o aumento no uso de
fluoroquinolonas, também podem estar envolvidos. A segunda mudança tem sido o crescente aparecimento da doença na comunidade, o que inclui indivíduos jovens e pessoas tradicionalmente consideradas de baixo risco (DUPONT et al., 2008; WEESE, 2010).
Várias pesquisas sobre C. difficile em alimentos estão sendo publicadas em outros países, no entanto, no Brasil, ainda são escassos os trabalhos científicos nesta área. Poucos trabalhos sobre a resistência térmica de C. difficile ou a detecção do micro-organismo em alimentos processados foram encontrados na literatura. Portanto, os objetivos deste trabalho foram determinar os parâmetros de resistência térmica de C. difficile em caldo de carne, verificar sua ocorrência em produtos cárneos e determinar o perfil toxigênico dos isolados.
2. Objetivos
Os objetivos desta pesquisa foram:
Determinar a ocorrência de C. difficile em produtos cárneos;
Determinar a influência de nitrito de sódio no crescimento de C. difficile em meio de cultura;
Determinar os parâmetros de resistência térmica (D e z) do C. difficile em caldo de carne a 72°C, 77°C e 82°C;
Determinar o efeito da concentração de nitrito de sódio e sais substitutos ao cloreto de sódio na resistência térmica do C. difficile em caldo de carne, pH 5,3, a 72°C.
3. Revisão Bibliográfica
3.1. Produção de carnes no Brasil
Preve-se que a produção global de carne bovina irá crescer 1% em 2019, atingindo aproximadamente 63,6 milhões de toneladas (USDA, 2018).
O Brasil é um grande produtor mundial de proteína animal e tem no mercado interno o principal destino de sua produção. Em 2016, a produção brasileira de carnes (bovina, suína e de aves) foi estimada em 26,35 milhões de toneladas (EMBRAPA, 2017a). Já em relação à carne bovina, em 2015 o país se posicionou com o maior rebanho de gado bovino (209 milhões de cabeças), o segundo maior consumidor (38,6 kg/habitante/ano) e o segundo maior exportador (1,9 milhões toneladas), sendo que 80% da carne bovina consumida pelos brasileiros são produzidas no próprio país (EMBRAPA, 2017b).
De acordo com as projeções do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), a produção de carne (bovina, suína e aves) deverá aumentar em 12,6 milhões de toneladas até 2018/2019, o que corresponde a um acréscimo de 51% em relação à produção de carnes de 2008 (MAPA, 2016b).
Por outro lado, o consumo de carne e de produtos cárneos tem sido associado ao aumento dos riscos de desenvolvimento de doenças crônicas, como obesidade, câncer e acidente vascular cerebral. As mudanças nas exigências dos consumidores e a crescente concorrência tem impulsionado a busca de novos ingredientes e novas tecnologias para processamento de produtos cárneos (WEISS et al., 2010).
No que diz respeito aos suínos, o uso de alimentação controlada, à base de ração de milho e farelo de soja, junto com o bom manejo, permitem que a produção alcance ótimo níveis zootécnicos e de conversão alimentar. A adoção desses métodos em conjunto com a evolução genética permitiu a redução de gordura da carne em 31%, bem como do colesterol (10%) e das calorias (14%) (MAPA, 2016a).
3.1.1. Cloreto de sódio na dieta e nos produtos cárneos
A ingestão de sódio em todo o mundo está acima da necessidade fisiológica, que é de 230 a 460 mg/dia. A maioria da população adulta tem ingestão média de sódio maior que 2.300 mg/dia e para muitos, principalmente em países asiáticos, a ingestão é maior que 4.600 mg/dia (BROWN, 2009).
De acordo com dados publicados pela WHO (2007; 2010), a ingestão de sódio nos Estados Unidos foi estimada em 3.466 mg/dia e no noroeste do Japão em torno de 10.600 mg/dia. No Canadá a estimativa foi de 3.500 mg/dia (PENZ; JOFFRES; CAMPBELL, 2008). No Brasil, a partir dos dados da Pesquisa de Orçamento Familiar de 2008/2009 (POF) realizada pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2010), estima-se que a ingestão média de sódio é de 4.700 mg/dia por pessoa (equivalente a quase 12 g de sal). A maior parte do sódio disponível para consumo foi proveniente do sal de cozinha e de condimentos a base desse sal (76,2%). A fração proveniente de alimentos processados com adição de sal representou 9,7% do total de sódio no quinto inferior da distribuição da renda per capita e 25% no quinto superior (SARNO, 2010).
Em contrapartida, nos Estados Unidos a principal fonte de ingestão de sódio são os alimentos processados, representando 77% (SEBASTIAN, 2013). Na França, esse número chega a 80% (DELAHAYE, 2013) e no Reino Unido os produtos a base de carne vem em segundo lugar como maior fonte do consumo diário de sódio, atrás somente dos produtos a base de cereal, isto representa 980 mg/dia do consumo total de 2.560 mg/dia (WHO, 2007). Já nos países asiáticos e em muitos países africanos, o sal adicionado no preparo do alimento e presente em molhos e temperos representa a principal fonte de sódio da dieta (IBRAHIN et al, 1995). De acordo com a Avalição de Saúde e Nutricional Chinesa (Chinese Health and Nutrition Survey) realizada em 2002, 72% da ingestão de sódio foi proveniente de sal adicionado durante o preparo dos alimentos e 8% proveniente de molho de soja (LI et al., 2005).
O consumo excessivo de sal pode levar ao aumento do volume de sangue, causando pressão sobre os vasos, aumentando as chances de desenvolver hipertensão arterial. Projeções indicam um aumento de 1,15 bilhões de hipertensos
em países em desenvolvimento até 2025. Existe uma variabilidade na prevalência global de hipertensão, estando presente em 35% da população latino americana, 20 a 30% da população chinesa e indiana e 14% nos países da África (MITTAL; SINGH, 2010). A alta ingestão de sódio ainda está relacionada com a formação de cálculos renais (CIRILLO et al., 1994), câncer de estômago (TSUGANE et al., 2004), asma (CAREY et al., 1993) e osteoporose (DEVINE et al., 1995; MARTINI et al., 2000).
Evidências indicam que a redução do consumo de sódio diminui riscos de doenças cardiovasculares (COOK et al., 2007; CHANG et al., 2006; PENZ; JOFFRES; CAMPBELL, 2008). A ingestão diária de menos de 2 g de sódio é benéfica para a pressão arterial e não apresenta efeito adverso significativo sobre os lipídios do sangue, os níveis de catecolaminas ou a função renal (BROWN, 2009).
A OMS recomenda que sejam consumidos no máximo 2.000 mg de sódio/dia por pessoa, o equivalente a 5.000 mg de cloreto de sódio (WHO, 2012).
Entre todas as categorias de alimentos industrializados, os produtos cárneos contribuem com aproximadamente 16-25% do consumo total de sódio recomendado (WHO, 2003).
Trinta e duas iniciativas para redução do consumo de sal em diferentes países foram identificadas, sendo a maior parte na Europa (19 países). A maioria dos países possuem metas de consumo de sal variando de 5.000 a 8.000 mg/dia. Vinte e seis dessas estratégias foram conduzidas pelo governo, cinco por organizações não governamentais e uma por indústria. Essas estratégias incluíram reformulação de alimentos, iniciativas de sensibilização dos consumidores e ações de rotulagem (WEBSTER et al., 2011).
A Finlândia representa um dos melhores exemplos de campanhas de redução de sódio a nível mundial. Na década de 70, os trabalhos foram iniciados com regulamentação das indústrias de alimentos, educação dos consumidores, reformulação de produtos, rotulagem e ações voluntárias das indústrias de alimentos. Este esforço resultou na redução de 40% do consumo de sódio, em 1972 o consumo era 5.600 mg/dia, já em 2002 era 3.200 mg/dia (APPEL et al., 2012; KARPPANEN; MERVAALA, 2006).
No Canadá, a indústria tem reformulado produtos para redução de sódio. O chamado “Sodium Working Group” foi formado pelo governo em 2007 com apoio dos
setores alimentícios e da saúde para supervisionar a redução de sódio na dieta de acordo com a Referência Dietética de Ingestão Americana e Canadense “Canadian and American Dietary Reference Intakes” (MOHAN; CAMPBELL; WILLIS, 2009). Em 2010 o grupo publicou o relatório “Estratégias para Redução de Sódio no Canadá” (Sodium Reduction Strategy for Canada), que inclui 33 recomendações. O objetivo é reduzir o consumo de sódio na população de uma média de 3.400 mg/dia para 2.300 mg/dia em 2016, com novas metas para redução posterior. É ainda recomendado que seja considerado como ingestão adequada 1.500 mg/dia para a idade adulta, com níveis mais baixos para outras faixas etárias (CAMPBELL; STRANG; YOUNG, 2011).
Na França, as estratégias para redução no consumo de sódio, iniciaram em 2004, com colaboração das indústrias. Foram realizadas reformulações de produtos e desenvolvimento de rotulagens opcionais para teor de sódio, porém sem uma regulamentação.
Todavia, não ocorreram muitas mudanças para a indústria alimentícia, exceto para o setor de panificação (WHO, 2007).
Lançada em 2003, a campanha de redução da ingestão de sódio no Reino Unido teve como objetivo reduzir o consumo de sal de 9.500 mg/dia para 6.000 mg/dia, equivalente a uma redução no consumo de sódio de 3.700 para 2.400 mg/dia através da reformulação de alimentos processados, campanhas de sensibilização dos consumidores e melhoria das informações nutricionais nas embalagens (APPEL et al., 2012; INSTITUTE OF MEDICINE, 2004). A experiência do Reino Unido também destaca a importância de organizações não governamentais (ONGs) na formação de políticas, como por exemplo, o Consensus Action on Salt and Health, uma ONG composta por peritos científicos formada em 1996, com o intuito de aumentar a consciência sobre os perigos da ingestão excessiva de sal. Seus esforços têm sido fundamentais para convencer tanto o governo quanto as indústrias de alimentos para prosseguir com a redução do sal (HE; MACGREGOR, 2009).
Nos Estados Unidos, no período entre 2001/2002 a 2005 houve um aumento no consumo de sódio de 3.329 mg/dia para 3.436 mg/dia (MOHAN; CAMPBELL, WILLIS, 2009). Os governos estaduais e municipais estão desenvolvendo iniciativas para reduzir o consumo de sódio na população e a nível federal o programa Pessoas
Saudáveis 2020 (Health People 2020). O Instituto de Medicina do Canadá e dos Estados Unidos estabeleceu um nível tolerável de ingestão de 2.300 mg/dia para adultos (HE; MACGREGOR, 2009; INSTITUTE OF MEDICINE, 2004).
Desde 2010, o governo brasileiro promove, por meio do Ministério da Saúde, discussões com instituições e organizações envolvidas direta e indiretamente com a redução do consumo de sódio. Em relação aos alimentos processados, estabeleceu-se em 2007, um termo de cooperação entre o Ministério da Saúde e a Associação Brasileira das Indústrias de Alimentação (ABIA), principal associação representativa do setor produtivo no Brasil, com o objetivo de trabalhar propostas para a reformulação desses alimentos (NILSON; JAIME; RESENDE, 2012). De acordo com a RDC nº 360 de 2003, da Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA), o valor diário de referência (VDR) adotado para o sódio é de 2.400 mg (BRASIL, 2003).
Um dos principais desafios na redução de sódio, para a indústria de alimentos, esbarra no aspecto econômico, visto que o cloreto de sódio é um dos ingredientes mais baratos utilizados no processamento de produtos cárneos e é o responsável por auxiliar o desenvolvimento das propriedades funcionais, sensoriais e de conservação nos produtos (DESMOND, 2006).
A maioria dos produtos cárneos processados e emulsionados contêm quantidades variadas de sal e são associados como produtos com alto conteúdo de sódio. A principal fonte do sódio é o NaCl, porém outros ingredientes utilizados também afetam o conteúdo final de sódio nesses produtos, tais como: tripolifosfato de sódio, nitrato de sódio, eritorbato ou ascorbato de sódio, nitrito de sódio e glutamato monossódico (MAURER, 1983).
A Pesquisa de Orçamento Familiar (POF) 2008/2009 apresentou tabelas de composição nutricional de alimentos consumidos no Brasil, nas quais os teores de sódio para salsicha foram de 1.74,71 mg/100 g, salsicha light 1.257 mg/100 g, mortadela 930 mg/100 g e mortadela light 716 mg/100 g (IBGE, 2010).
Paes et al. (2011) avaliaram nove marcas de salsichas embaladas à vácuo do mercado brasileiro, foram encontrados os seguintes teores de sódio 745 mg/100 g, 900 mg/100 g, 870 mg/100 g, 1.010 mg/100 g, 1.100 mg/100 g e 1.355 mg/100 g.
Sais clorados (KCl, MgCl2 e CaCl2), fosfatos e sais orgânicos, são
consequentemente uma redução de sódio na elaboração de produtos processados (RUUSSUNEN, POULANNE, 2005).
O KCl exerce um efeito de percepção de gosto salgado semelhante ao NaCl, enquanto MgCl2 e CaCl2 exercem um efeito de percepção de gosto salgado menor.
Porém, efeitos sensoriais indesejáveis como sabor amargo e metálico são percebidos quando esses sais substitutos são utilizados (PÉREZ-JUAN; FLORES; TOLDRÁ, 2007).
O cloreto de potássio é o substituto do sal mais utilizado em alimentos com baixo ou reduzido teor de sal/sódio. Entretanto, a substituição de cloreto de sódio por cloreto do potássio superior a 50% resulta em gosto amargo e na perda do gosto salino (DESMOND, 2006). Diversas pesquisas atuais concentram-se em minimizar os gostos amargo e metálico por meio do uso combinado de cloreto de potássio com outros sais supressores do gosto amargo (como glutamato monossódico, sulfato de magnésio e aminoácidos) (KILCAST; DEN RIDDER, 2007).
A redução do teor de sal sem utilização de algum sal substituto pode resultar em um sabor brando indesejável e uma significativa perda de outros atributos, tais como vida útil, textura ou retenção de água. O uso de mistura de sais ou cloreto de potássio ajuda a manter a força iônica que exerce importante efeito funcional nos produtos cárneos (TERRELL, 1983).
A substituição de aproximadamente 35% de NaCl (2,5%) por cloreto de potássio (KCl) ou cloreto de magnésio (MgCl2) em salsichas de carne suína ou peru,
não apresentou alteração da aceitabilidade global do produto recém produzido, com decréscimo na aceitação global após 6 semanas de armazenamento refrigerado (HAND, TERRELL, SMITH, 1982).
Bidlas e Lambert (2008) avaliaram a capacidade de cloreto de potássio em substituir o NaCl como um agente conservante. Neste estudo, foi verificado que o KCl em uma substituição molar direta de 1:1, possui efeito conservante similar ao sal comum.
Horita et al. (2011) testaram diferentes concentrações e combinações de NaCl, KCl, MgCl2 e CaCl2 em mortadelas com teor reduzido de gordura. A
substituição de 50% de NaCl por KCl, não apresentou diferença significativa em relação a proposta com 2% de NaCl. Além disso, a substituição do cloreto de sódio por outros sais não comprometeu a estabilidade microbiológica em até 45 dias de
prateleira, especialmente com relação ao crescimento de micro-organismos psicrotróficos.
Pesquisas tem demonstrado que o aumento na ingestão de potássio, que proporcionalmente eleva o nível de potássio plasmático, inversamente se associa à diminuição da pressão sanguínea e à diminuição da mortalidade por acidente vascular cerebral e por doenças cardíacas (WHELTON, 1997; 1999).
3.1.2. Nitrito de sódio nos produtos cárneos
Nitratos e nitritos são aditivos alimentares, classificados como conservantes de acordo com a Legislação Brasileira de Alimentos, ou seja, são substâncias adicionadas aos alimentos que visam evitar sua deterioração (BRASIL, 1998). Além do papel de conservante, os nitritos são utilizados no processo de cura de produtos cárneos para retardar o processo de oxidação dos lipídios evitando a rancidez e a formação de off-flavor, fixar e desenvolver cor pela formação de nitrosomioglobina, pigmento de coloração rósea (ALMUDENA; LIZANO, 2001; PETENUCI et al., 2004).
O termo “curado” relativo a produtos cárneos processados é entendido universalmente como a adição de nitrito ou nitrato juntamente com sais e outros ingredientes à carne para melhorar a preservação (PEGG; SHAHIDI, 2000). Para produtos curados, o nitrito é um ingrediente único e diferencial, para o qual não há substituto capaz de prover as características desejadas nos produtos como salsicha, mortadela, bacon e presunto (SEBRANEK; BACUS, 2007).
O nitrito de sódio também é considerado um dos ingredientes essenciais na fabricação de produtos cárneos devido à inibição do crescimento de Clostridium botulinum (WEISS et al., 2010).
Além disso, a concentração de nitrito em produtos cárneos curados diminui durante o processo de produção e a vida de prateleira. Pardi et al. (1994) estima que 50% do nitrito adicionado é perdido em 24 horas e menos de 10% permanece após 7 dias.
Apesar dos benefícios tecnológicos, a redução da utilização de nitritos tornou-se fundamental para a indústria pelo efeito tóxico do excesso de nitrito na dieta, com
a formação endógena de nitrosaminas que apresentam efeito cancerígeno (JAKSZYN; GONZALEZ, 2006).
A ingestão diária elevada de íons nitrito a partir de alimentos e água ocasiona acúmulo desses íons no sistema digestório, ocorrendo absorção e consequente entrada na corrente sanguínea. Estes íons podem agir sobre a hemoglobina, originando a metahemoglobina, a qual não transporta o oxigênio, limitando a capacidade do sangue de carregar oxigênio para os tecidos (YUE; SONG, 2006).
Nos Estados Unidos, é proibida a adição direta de nitrito ou nitrato em produtos cárneos naturais e processados orgânicos (USDA, 2005; USA, 2016). A estratégia utilizada pela indústria foi adicioná-los indiretamente por meio de ingredientes que em sua composição possuam alto teor nitrato, como sal marinho, condimentos e aromatizantes naturais. Outra alternativa é utilizar sucos concentrados ou o pó de vegetais vastamente conhecidos como fonte de nitrato, com concentração entre 1.500 e 2.800 ppm, como o aipo, a alface e a beterraba (SEBRANEK; BACUS, 2007).
A legislação vigente no Brasil estabelece como quantidade residual máxima para nitritos e nitratos, respectivamente, 150 mg/kg e 300 mg/kg (BRASIL, 1998).
Em uma pesquisa realizada em Recife sobre o teor residual de nitrito e nitrato de sódio em 54 amostras de salsichas tipo hot dog foi constatado que 56% das amostras estavam em desacordo com o limite máximo especificado para nitrato na legislação (300 mg/kg). Em relação ao nitrito, foi verificado que 18% das amostras apresentaram valores acima de 150 mg/kg (MELO FILHO; BISCONTINI; ANDRADE, 2004).
Já em Salvador, foi verificado que 44,44% das amostras de salsichas (5/11 salsichas de ave e 7/16 salsichas de carne suína e bovina com ave) apresentaram teor de nitrito acima de 150 mg/kg (ANDRADE; TRIGUEIRO, 2008).
Oliveira et al. (2017) analisaram a concentração de nitrito de sódio de 270 amostras de embutidos (salsicha, mortadela e linguiça frescal) de três diferentes marcas, obtidas no comércio de Avaré - SP e região. Entre esses produtos, a concentrações médias de nitrito variaram de 29,25 a 249,80 ppm. As amostras de linguiça das marcas A e C apresentaram um teor de nitrito superior a 150 ppm.
3.2. Clostridium difficile
O C. difficile é uma bactéria anaeróbia estrita, heterotrófica (YUILLE et al. 2015) e mesófila que pode ser encontrada no solo, na água e no trato digestório de mamíferos (BAUER; KUIJPER, 2015; LAWSON et al., 2016). As colônias de C. difficile em meio ágar C. difficile moxalactan norfloxacina (CDMNA) apresentam coloração acinzentada ou branca, opacas, chatas ou pouco convexas, rizoídes ou circulares e de tamanho variando de 2 - 5 mm (GEORGE et al., 1979) e odor característico de esterco de cavalo (DELMÉE, 2001). Os esporos são ovais, subterminais e intumescidos (LAWSON et al., 2016).
Filogeneticamente, o C. difficile pertence à família Peptostreptococcaceae (LUDWIG et al., 2009). O gênero Clostridium é dividido em clusters baseados em análise de 16S rDNA, o C. difficile pertence ao grupo XI, outras espécies pertencentes a este cluster são o C. sordellii e C. bifermentans, Peptostreptococcus anaerobius e Eubacterium tenue (COLLINS et al., 1994).
Yutin e Galperin (2013) sugeriram a reclassificação de C. difficile para Peptoclostridium difficile. Recentemente o C. difficile foi rebatizado como Clostridioides difficile (LAWSON et al.,2016).
Em 2013, o odor característico do micro-organismo possibilitou a identificação da infecção em pessoas por um cachorro durante um surto da doença num hospital em Amsterdã. O cão foi treinado para sentar ou deitar quando identificasse à presença do odor específico do C. difficile, a análise pelo cão consistiu em andar entre as camas dos pacientes na ala do hospital. O cachorro realizou 651 análises, envolvendo 371 pacientes, foram identificados corretamente 12 dos 14 casos de CDI (sensibilidade 86%) e 346 dos 357 participantes CDI negativos (especificidade de 97%) (BOMERS et al., 2014).
O micro-organismo foi descrito em 1935 por Hall e O‟Toole, isolado das fezes de neonatos sadios, nascidos em Denver. Inicialmente foi denominado de Bacillus difficilis devido à dificuldade em isolar e manter o micro-organismo em cultura pura. Hall e O‟Toole observaram que a injeção da cultura líquida ou do filtrado do meio que continha o C. difficile em animais experimentais apresentou efeito tóxico,
causando lesões, parada respiratória e morte (HALL; O‟TOOLE, 1935; LYERLY; KRIVAN; WILKINS, 1988).
A colite associada ao tratamento com antibiótico foi observada pela primeira vez em 1950, quando o uso crescente de cloranfenicol e tetraciclina foram relacionados com o aumento da incidência de colite pseudomembranosa (PMC) (GEORGE, 1984).
Na década de 1970, a PMC atingiu proporções epidêmicas, tornando-se uma complicação comum ao uso de antibióticos. O tratamento com antibióticos foi considerado o fator desencadeante da PMC, possivelmente pela eliminação das bactérias entéricas, favorecendo o C. difficile (KELLY et al., 1994; LYERLY, KRIVAN, WILKINS, 1988).
Todavia, somente em 1977 é que foi identificada nas fezes dos pacientes a toxina que causava mudanças citopáticas nos tecidos (LARSON et al., 1977). Bartlett et al. (1978) identificaram o C. difficile como o produtor desta toxina e o agente etiológico da PMC associada ao tratamento com antibióticos.
Basicamente, qualquer antibiótico pode facilitar a infecção por C. difficile, porém, os antibióticos de amplo espectro com atividade contra as bactérias entéricas são os mais comuns (KELLY et al., 1994).
A infecção causada por C. difficile (CDI) varia desde diarreia autolimitada a PMC, megacólon tóxico, sepse e morte (AMY; JOHANESEN; LYRAS, 2015; RUPNIK; WILCOX; GERDING, 2009).
Os fatores de risco relacionados ao CDI incluem período longo de hospitalização, exposição prolongada aos antibióticos, comorbidades subjacentes e idade superior a 65 anos (BADGER et al., 2012).
Para o crescimento do micro-organismo, após a ingestão de esporos, é essencial que a microbiota intestinal esteja desequilibrada, típica, mas não exclusivamente por efeito de antibióticos (KELLY et al., 1994; MOORE et al., 2013; SORG; SONENSHEIN, 2008). O tratamento com antibióticos é o fator de risco mais importante por causar alteração da microbiota, favorecendo a colonização pelo C. difficile e subsequente infecção (JOHNSON; GERDING, 1998). O desenvolvimento da doença também esta associado à falha da resposta imunológica contra as toxinas produzidas pelo C. difficile (SANCHEZ-HURTADO et al., 2008).
O micro-organismo é adquirido, em muitos casos, a partir de origem exógena: de um indivíduo contaminado, de pessoas que cuidam do paciente ou indiretamente a partir de ambiente contaminado (PAREDES-SABJA; SHEN; SORG, 2014).
A forma vegetativa de C. difficile é sensível à presença de oxigênio e resiste por pouco tempo em condições aeróbias no ambiente. Já os esporos podem permanecer viáveis por longos períodos e resistir a diversos tipos de desinfetantes, favorecendo a contaminação ambiental, principalmente em hospitais (BUGGY; WILSON; FEKETY, 1983).
Edwards et al. (2016) demonstraram que os esporos apresentam alta resistência ao etanol, peróxido de hidrogênio e clorofórmio, enquanto células vegetativas de C. difficile foram rapidamente destruídas por esses agentes.
Os esporos de C. difficile possuem ultraestrutura semelhante à dos esporos de outras espécies do gênero Clostridium e Bacillus. Entretanto as análises por microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelaram que a camada externa do exósporo de esporos de C. difficile exibem várias características únicas (BARRA-CARRASCO et al., 2013; GIL et al., 2017; PERMPOONPATTANA et al., 2011). O exósporo da maioria dos isolados de C. difficile apresenta projeções semelhantes a cabelo (Figura 1), similar ao exósporo de esporos de Bacillus cereus (PAREDES-SABJA; SHEN; SORG, 2014).
Pesquisas indicam que as proteínas das camadas mais externas do exósporo apresentam papel relevante nas interações entre o esporo e as células do hospedeiro (BARRA-CARRASCO et al., 2013; PHETCHARABURANIN et al., 2014), semelhante ao verificado aos esporos de B. cereus (STEWART, 2015).
Análises por MET de células Caco-2, modelo do adenocarcinoma de cólon humano, demonstraram que as projeções semelhantes a cabelos presentes na superfície dos esporos de C. difficile R20291 estavam próximas à membrana plasmática e às microvilosidades das monocamadas indiferenciadas e diferenciadas de células Caco-2, sugerindo que estas projeções do exósporo de C. difficile favorecem a aproximação dos esporos e das células epiteliais do intestino (MORA-URIBE et al., 2016).
Além disso, foi verificado que não há espaço entre o exósporo e a capa do esporo, a camada mais externa do esporo está em contato direto com a capa do esporo, de forma semelhante à camada mais externa de esporos de Bacillus subtilis
(BARRA-CARRASCO et al., 2013; PAREDES-SABJA; SHEN; SORG, 2014; STEWART, 2015).
Díaz-González et al. (2015) identificaram 184 proteínas no exósporo de esporos de C. difficile: 7 proteínas de revestimento da capa dos esporo/exósporo; 7 proteínas possivelmente envolvidas com a resistência dos esporos; 6 possivelmente envolvidas na patogenicidade; 13 proteínas não caracterizadas e 146 proteínas citosólicas. As camadas subjacentes do esporo de C. difficile são semelhantes aos observados em outros esporos bacterianos (GIL et al., 2017).
Segundo Barra-Carrasco et al. (2013), a proteína rica em cisteína do exósporo do C. difficile (CdeC - C. difficile exosporium cysteine - rich protein), é essencial na morfogênese do exósporo, das projeções semelhantes a cabelo e na resistência à agentes físicos e químicos. Nesta pesquisa foi verificado que os esporos da cepa mutante de C. difficile, sem o gene responsável pela formação da CdeC, apresentaram menor resistência ao etanol e ao calor, praticamente ausência do exósporo e não foi observado projeções semelhantes a cabelo.
Figura 1. Ultraestrutura do esporo do C. difficile R20291, ribotipo 027, esta cepa apresenta os genes tcdA, tcdB, cdtB e não possui o gene ctdA. O exósporo (Ex) e a capa do esporo (Ct) estão identificados na figura (BARRA-CARRASCO et al., 2013).
A CDI é causada por toxinas produzidas durante a fase logarítmica de crescimento das células vegetativas (RUPNIK; WILCOX; GERDING, 2009).
Os principais fatores de virulência do C. difficile são duas exotoxinas: a toxina A (TcdA) e a toxina B (TcdB), formadas por monocadeias polipeptídicas de alto peso molecular com múltiplos domínios e estruturas com funcionalidades distintas (MONAGHAN, 2015). Além disso, algumas cepas de C. difficile produzem uma
toxina binária C. difficile transferase (CDT), associada a casos mais severos da doença (SCHWAN et al., 2014).
Recentemente, a epidemiologia das infecções por C. difficile tem se tornado complexa, com casos de CDI sendo observados na comunidade (FREEMAN et al., 2010; GUPTA; KHANNA, 2014). Além do aumento na incidência de CDI, também tem sido verificado aumento na gravidade da infecção, altas taxas de recorrência sintomática e aumento significante nas taxas de mortalidade, ocorrendo em populações antes consideradas de baixo risco, como pacientes jovens sem doença prévia e mulheres peri-parto (FREEMAN et al., 2010; GAREY et al., 2008; YE et al., 2016).
Um dos fatores relacionados com a crescente letalidade de CDI foi o aparecimento de cepas hipervirulentas conhecidas como North American Pulsed Field type 1 (NAP1), Endonuclease de Restrição (Restriction Endonuclease - REA) tipo BI e a designação baseada na tipagem molecular por meio de ribotipagem 027 (NAP1/BI/027) (COHEN et al., 2010; FREEMAN et al., 2010; TO; NAPOLITANO, 2014).
As cepas hipervirulentas são caracterizadas pela produção significativamente maior das toxinas TcdA e TcdB e pela sua resistência à fluoroquinolonas; muitas vezes produzem mais esporos, em comparação com outras linhagens e sintetizam a toxina binária CDT (SCHWAN et al., 2014).
O ribotipo 027 foi identificado pela primeira vez na província do Québec (Canadá), em 2005, como causa de surtos hospitalares de infecção severa com alta taxa de mortalidade (LOO et al., 2005).
O C. difficile é a principal causa de infecção nosocomial em países desenvolvidos (ELLIOT et al., 2017). Nos Estados Unidos, a taxa de mortalidade por CDI varia entre 5 e 10%, resultando em mais de 14.000 mortes por ano (DUBBERKE; OLSEN, 2012; HONDA; DUBBERKE, 2014). O ônus econômico anual é estimado em 5,4 bilhões de dólares, dos quais 4,7 bilhões de dólares correspondem aos custos para o sistema de saúde e 725 milhões de dólares correspondem aos gastos comunitários indiretos (DESAI et al., 2016).
A incidência de CDI aumentou substancialmente nos últimos anos (Figura 2). De acordo com os dados do Projeto de Custo e Utilização do Sistema de Saúde (Healthcare Cost and Utilization Project), a incidência de CDI nos Estados Unidos,
como qualquer tipo de diagnóstico, no ano 2000 foi 134.518 casos, já em 2014 foi 361.945 casos (HCUP, 2017).
Figura 2. Casos de CDI nos Estados Unidos (Adaptado de HCUP, 2017).
A CDI adquirida na comunidade corresponde a um quarto de todos os pacientes diagnosticados com CDI (KARLSTROM et al., 1998; KHANNA et al., 2012; NOREN et al., 2004).
Estudos recentes indicam que, após admissão em hospitais, é estimado que 8% das pessoas tornam-se portadores assintomáticos de cepas toxigênicas de C. difficile e, para estes o risco de desenvolvimento de CDI é maior quando comparado com pacientes não portadores do micro-organismo (ZACHARIOUDAKIS et al., 2015).
Várias pessoas que tiveram o trato digestório colonizado por cepas toxigênicas de C. difficile tornaram-se portadores assintomáticos (KYNE et al., 2000; LOO et al., 2011; MCFARLAND et al., 1986; SHIM et al., 1998). Todavia, o papel desempenhado por portadores assintomáticos na transmissão de CDI ainda não foi determinado (DONSKEY; KUNDRAPU; DESHPANDE, 2015).
3.2.1. Patogenicidade de C. difficile
As toxinas TcdA e TcdB entram nas células por endocitose mediada por receptor (PAPATHEODOROU et al., 2010).
0 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 N ° de c a s os de CD I (E U A ) Ano
Ambas as toxinas TcdA e TcdB são glicosiltransferases (GTPAses) que inativam as GTPases da célula hospedeira, causando ruptura do citoesqueleto de actina, o que resulta em apoptose. Isto produz a perda da barreira epitelial intestinal pela abertura das junções entre as células, aumentando a permeabilidade intestinal e o acúmulo de fluidos, seguido pelo aparecimento de diarreia (JANK; AKTORIES, 2008; VOTH; BALLARD, 2005).
As toxinas TcdA e TcdB também induzem a liberação de citocinas que conduzem à ativação de neutrófilos, mastócitos, nervos entéricos e neurônios sensoriais dentro da lâmina própria do intestino. Estes, por sua vez, induzem a liberação de neuropeptídeos e citocinas pró-inflamatórias que resultam na resposta inflamatória e a formação de pseudomembrana (SHEN, 2012; SUN; HIROTA, 2015).
A importância das toxinas A e B para a patogenicidade da CDI tem causado polêmica. Antigamente, acreditava-se que a toxina A era o principal fator de virulência no CDI, contudo estudos recentes utilizando cepas mutantes de C. difficile (produzindo apenas a toxina A ou B) mostraram que somente a TcdB é essencial para a virulência (LYRAS et al., 2009).
Já em estudos posteriores, com modelos de infecção em hamster e cepas mutantes de C. difficile, foi observado que tanto as cepas TcdA-/TcdB+ como as cepas TcdA+/TcdB- foram capazes de causar a doença (KUEHNE et al., 2010; KUEHNE; CARTMAN; MINTON, 2011).
Além da cepa hipervirulenta NAP1/BI/027, outras cepas emergentes de ribotipo 017 e 078 estão sendo associadas a casos graves da doença na Ásia e Europa (BOUILLAUT; SELF; SONENSHEIN, 2013; DRUDY et al., 2007; KIM et al., 2008).
A toxina CDT é composta por duas cadeias: uma molécula apresenta atividade de ADP-ribosiltransferase (CDTa) e o segundo componente (CDTb) está envolvido na ligação da toxina às células do hospedeiro e é responsável pela translocação da enzima para o citosol. A CDT age sobre G-actina inibindo a polimerização da actina, o que facilita a colonização por indução da formação de saliências de células (GERDING et al., 2014).
As cepas que produzem CDT, na ausência de TcdA e TcdB, foram observadas em casos de CDI em indivíduos imunocomprometidos (ANDROGA et al., 2015; ECKERT et al., 2015; GRANDESSO et al., 2016).
Além desses fatores, o C. difficile é capaz de formar um biofilme sobre superfície abiótica, mas a robustez do biofilme formado varia entre linhagens. As células bacterianas são incorporadas numa matriz composta de DNA, proteínas e polissacarídeos, incluindo várias proteínas da parede celular e toxinas (TcdA) (JANOIR, 2016; PANTALÉON et al., 2015; SEMENYUK et al., 2014). A formação de biofilme por C. difficile é modulada por reguladores centrais (Spo0A e LuxS), e por componentes de superfície tais como os flagelos e cisteína protease Cwp84 (DAWSON et al., 2012; PANTALÉON et al., 2015).
Existem fortes evidências sobre a capacidade de C. difficile formar biofilme in vivo. Em um estudo com ratos foi observado que as células de C. difficile formaram aglomerados em associação ao tecido danificado, o que poderia sugerir a formação de microcolônias (LAWLEY et al., 2009). Pesquisas demonstram que células de C. difficile alocam-se em comunidades multicelulares em associação com a mucosa do hospedeiro (SEMENYUK et al., 2015). Sabe-se que os biofilmes contribuem com a resistência aos antibióticos de C. difficile, bem como com o estresse de oxigênio (DAWSON et al., 2012; SEMENYUK et al., 2014) e em promover a persistência de esporos resistentes (CROWTHER et al., 2014). No entanto, torna-se necessário definir mais precisamente o papel da formação de biofilme em CDI e suas recorrências.
Os genes tcdA e tcdB que codificam, respectivamente, as toxinas TcdA e TcdB estão no lócus de patogenicidade (Pathogenicity locus - PaLoc), fragmento de 19,6 kb (BRAUN et al., 1996). Também estão codificados no PaLoc três genes acessórios: tcdR, regulador positivo; tcdC, regulador negativo e tcdE, gene que codifica uma proteína similar a holina (HUNDSBERGER et al., 1997), requerido para liberação de toxina (GOVIND; DUPUY, 2012) (Figura 3). Em cepas não toxigênicas, o PaLoc é substituído por um fragmento de 115/85 pb (BRAUN et al., 1996; DINGLE et al., 2014).
Quanto à toxina CDT, os genes cdtA e cdtB codificam, respectivamente os componentes CDTa e CDTb, situados numa região cromossômica de 6,2 kb, conhecido como CdtLoc. Também está presente o gene cdtR, regulador requerido para expressão (CARTER et al., 2007). Nas cepas que não produzem a toxina binária, essa região é substituída por uma sequência de 68 pb (CARTER et al.,
2007). O cdtR também mostrou regular a produção das toxinas A e B em algumas cepas (LYON et al., 2016).
Figura 3. A: PaLoc- tcdR, tcdB, tcdE, tcdA e tcdC. B: Genes codificadores da toxina binária - cdtR, cdtA e cdtB (Adaptado de ELLIOTT et al., 2017).
A identificação por PCR-ribotipagem é um dos métodos utilizados para caracterizar os isolados de C. difficile (Tabela 1). Já a classificação do perfil toxigênico das cepas de C. difficile é baseada na variabilidade da região cromossômica que codifica as toxinas TcdA e TcdB (PaLoc), em relação a cepa de referência VPI 10463. Cada tipo toxigênico possui cepas com alterações idênticas nesta região do PaLoc. Atualmente são conhecidos 34 tipos toxigênicos, sendo que a cepa VPI 10463 pertence ao tipo 0 (RUPNIK; JANEZIC, 2016).
A compreensão das alterações nos genes tcdA e tcdB e, consequentemente das propriedades funcionais das variantes das TcdA e TcdB, é fundamental em estudos epidemiológicos, em desenvolvimento de vacinas e no diagnóstico molecular (DINGLE et al., 2014; LANIS et al., 2013; RUPNIK, 2008).
Existem várias razões pelas quais diferentes tipos toxigênicos podem se correlacionar com as diferentes formas da doença, por exemplo, a produção de toxinas com propriedades distintas. Já foi demonstrado para algumas linhagens que as toxinas produzidas diferem nas propriedades catalíticas em relação à cepa VPI 10463 (CARMAN et al., 2011).
A heterogeneidade da sequência de aminoácidos nas toxinas resulta em alterações na imunorreactividade, especificidade do substrato e efeito citopático (RUPNIK, 2008).
Tabela 1. Classificação por tipo toxigênico e correlação com ribotipo.
Tipo TcdA TcdB CDT Ribotipo Cepa
0 + + - 087 VPI 10463 0/v + + + 131 597B I + + - 102 EX 623 II + + - 103 AC 008 IIIa + + + 080 SE 844 IIIb + + + 027 R 12087 IIIc + + + 251 CH6230 IIId + + + SLO 042 3073 IIIe + + + 251 AI 541 IV + + + 023 55767 V + + + 045 SE 881 VI + + + 127 51377 VII + + + 063 57267 VIII - + - 017 1470 IXa + + + 019 51680 IXb + + + 244 TFA/V20-1 IXc + + + 109 8785 IXd + + + SLO 228 1732874 Xa - + + 591 (CE) 8864 Xb - + + SLO 032 J9965 XIa - - + 033 IS 58 XIb - - + 288 (CE) R 11402 XIc - - + 033 OCD 5/2
XId - - + 153 (CE) TFA/V14-10
XII + + - 258 IS 25 XIII + + - 070 R 9367 XIVa + + + 111 R 10870 XIVb + + + 122 R 9385 XVI - + + 078 SUC36 XVIII + + - 014 K095 XIX + + - 018 TR13
Cont. Tabela 1.
Tipo TcdA TcdB CDT Ribotipo Cepa
XX + + - SLO 005 TR14 XXI + + - SLO 035 CH6223 XXII + + + 027 CD07-468 XXV + + + 027 7325 XXVI + + - 050 (CE) 7459 XXVII + + - SLO037 KK2443/2006 XXVIII + + + 126 CD08-070 XXIX + + - 001 CD07-140 XXX - + + SLO 101 ES 130 XXXI - + + SLO 098 WA 151 XXXII - + - 151 (CE) 173070 XXXIII + + - SLO 086 2402 XXXIV - + - SLO 201 CD10-055
Fonte: RUPNIK; JANEZIC (2016).
3.2.2. Ocorrência em alimentos
C. difficile tem sido isolado de diversos animais e de grande variedade de alimentos, todavia faltam evidências para confirmar a hipótese de uma doença transmitida por alimentos ou zoonose. A Tabela 2 mostra um resumo da detecção de C. difficile em alimentos.
Provavelmente a primeira descrição de C. difficile em alimentos foi realizada em 1996, por Broda e colaboradores. Nesse estudo o micro-organismo foi isolado de amostras deterioradas de carne embalada a vácuo.
Em Glasgow (Escócia), das 40 amostras analisadas de saladas prontas para consumo, em 3 (7,5%) foi observado à presença de C. difficile. Dois isolados foram identificados como ribotipo 017 (toxina A-/B+) e o outro isolado foi identificado como ribotipo 001 (BAKRI et al., 2009).
No Irã, esporos de C. difficile foram detectados em 1,36% (5/368) das amostras de alimentos prontos para o consumo. A maior prevalência foi observada em amostras de salada (4,29%), seguido pelo iogurte árabe (2%) (RAHIMI; AFZALI; BAGHBADORANI, 2015). Já para as carnes, a maior incidência de C. difficile foi encontrada em carne de búfalo (9%), carne caprina (3,3%), carne bovina de gado de
corte jovem (1,7%), carne bovina de gado leiteiro adulto (0,94%) e carne ovina (0,9%) (RAHIMI; JALALI; WEESE, 2014).
Em uma casa de repouso na Bélgica foram coletadas amostras de 246 superfícies do ambiente e 188 amostras de alimentos. O C. difficile foi detectado em uma amostra (0,53%) de uma a refeição composta por linguiça de porco, molho de mostarda e salada de cenoura, preparada na cantina da casa de repouso. O isolado foi identificado como ribotipo 078 (RODRIGUEZ et al., 2015).
Um estudo realizado com 40 amostras obtidas em 5 pontos de venda no Texas (Estados Unidos da América - EUA) detectou C. difficile em 3 amostras (7,5%): uma amostra de carne suína moída, uma amostra de chouriço de porco e uma amostra de carne de peru moída (HARVEY et al., 2011).
Mooyottu et al. (2015) analisaram 300 amostras de carne (100 amostras de carne suína, 100 amostras de carne bovina moída e 100 amostras de carne de frango), obtidas a partir de mercearias geograficamente distantes em Connecticut (EUA). O C. difficile foi observado em 2% das amostras de carne suína.
Em outra pesquisa realizada na Bélgica, o C. difficile foi identificado em 2,3% (3/133) das amostras de carne bovina (duas amostras de hambúrguer e uma amostra de carne moída) e em 4,7% (5/107) das amostras de carne suína (duas amostras de carne suína moída, duas amostras de linguiça suína e uma amostra de linguiça fresca chipolata) (RODRIGUEZ et al., 2014).
Em Costa do Marfim, Kouassi et al. (2014) analisaram 172 amostras de rim bovino cozido e 223 amostras de carne bovina cozida adquiridas de vendedores ambulantes entre 2009 e 2010. Foi verificada a incidência de 12,4% de C. difficile nas amostras (11,04% em rim e 13,45% em carne).
Em Ontário (Canadá), o C. difficile ribotipo 078 foi detectado em 12,8% (26/203) das amostras de carne de frango (sobrecoxa, coxa e asa) adquiridos em pontos de venda. Em relação aos cortes de carne, foram positivas 9% (10/111) das amostras de coxa, 18% (13/72) das amostras de asas e 15% (3/20) das amostras de sobrecoxa (WEESE et al., 2010).
Na Austrália, um estudo analisou raízes vegetais de cultivo orgânico e tradicional (batata, beterraba, cebola e cenoura), foi observada a incidência de contaminação por C. difficile de 30% (30/100) das amostras. Apresentaram resultado positivo para C. difficile 55,6% das amostras de batata orgânica, 50% das amostras
de batata de cultivo convencional, 22,2% das amostras de beterraba orgânica, 5,6% das amostras de cebola orgânica e 5,3% de cenoura orgânica. Foram identificados como cepas toxigênicas 51,2% (22/43) dos isolados, predominantemente A+B+CDT- (81,8%, 18/22). Um isolado apresentou perfil A+B+CDT+ (2,3%) (LIM et al., 2018).
Em hospitais, na região central da Itália, foi detectada a presença de cepas toxigênicas de C. difficile em 0,6% (2/350) das amostras de alimentos, sendo a incidência de 0,3% (1/296) em amostra de alimento cozido (carne de frango) e de 1,96% (1/54) em alimento não cozido (salada de alface) (PRIMAVILLA et al., 2019).
Troiano et al. (2015) constataram a ocorrência de C. difficile em moluscos bivalves comestíveis no sul da Itália. Foram investigadas 925 amostras, das quais 3,9% continham C. difficile. Dezoito isolados apresentaram perfil toxigênico A+/B+ e um isolado apresentou o perfil A-/B+. Os genes para a toxina binária foram detectados em 22,2% dos isolados. Quanto ao ribotipo, foram detectados: o 078/126 em 22,2% dos isolados, o 010 em 19,4% dos isolados e o 001 em 8,3% dos isolados.
Norman et al. (2014) verificaram a prevalência de C. difficile em amostras de peixes e frutos do mar adquiridas em supermercados no Texas (EUA). O C. difficile foi encontrado em 4,5% (3/67) das amostras (uma amostra de mexilhão, uma amostra de salmão e uma amostra de camarão).
Na Slovênia, uma pesquisa analisou a prevalência de C. diffcile em 154 amostras de vegetais folhosos e raízes (64 amostras de alface de cordeiro, 22 amostras de alface, 11 amostras de folhas de dente de leão, 2 amostras de alface jovem, 2 amostras de rúcula, 2 amostras de radicchio, uma amostra mista de vegetais folhosos, 15 amostras de gengibre e 75 amostras de batata). Resultado positivo para a presença de C. difficile foi verificado em 18,2% (28/154) das amostras (28% das amostras de batata, 9,4% das amostras de vegetais folhosos e 6,7% das amostras de gengibre). Foram isoladas 115 cepas de C. difficile, a incidência de cepas toxigênicas foi 8,7% (10/115) dos isolados, predominantemente o ribotipo 014/020 (TKALEC et al., 2019).
Rodriguez-Palacios et al. (2010) demonstraram que os esporos de C. difficile sobrevivem por 2 h a 71°C. Assim, o processamento térmico atualmente aplicado nas indústrias de produtos cárneos pode ser insuficiente para reduzir esporos de C. difficile para um nível aceitável.
A fonte de contaminação dos animais é desconhecida, todavia foram observadas as mesmas cepas em animais e em seres humanos, indicando que a fonte de contaminação pode ser comum ou que os animais podem ser a fonte de contaminação da população (WEESE, 2010).
Alimento Quantidade total de amostras Prevalência de contaminação por C. difficile (%)
Observações Local Referência
Bibliográfica Produtos cárneos (linguiça, carne bovina/suína/peru moída, choriço e linguiça de fígado de porco)
88 42,00 73% dos isolados identificados como ribotipo 078 e 27% dos isolados
identificados como ribotipo 027 Tuscon (EUA) Songer et al. (2009)
Carne bovina, suína e
de frango 84 0 - Áustria Indra et al. (2009)
Salada pronta para
consumo 40 7,50
75% dos isolados identificados como ribotipo 017 (A-/B+) e 25% dos isolados identificados como ribotipo
001
Glasgow
(Escócia) Bakri et al. (2009)
Carne moída mista (amostras compostas
por carne suína e carne bovina)
70 4,29
66,67% dos isolados identificados como ribotipo AI-57 (AI refere a isolado na Áustria) e 33,33% dos isolados identificados como ribotipo
053
Áustria Jöbstl et al. (2010)
Carne bovina
embalada a vácuo 13 15,38
Foram analisadas 8 amostras deterioradas e 5 amostras não
deterioradas
Estado de São
Paulo Marques (2010)
Cont. Tabela 2. Alimento Quantidade total de amostras Prevalência de contaminação por C. difficile (%)
Observações Local Referência
Bibliográfica
Produtos cárneos
(varejo) 40 7,50
Foram analisadas amostras de carne suína moída, chouriço de
porco e carne de peru moída Texas (EUA) Harvey et al. (2011) Peixes e frutos do mar 119 4,80 80% dos isolados identificados como ribotipo 078 e 20%
apresentaram perfil toxigênico A-/B- Canadá Metcalf et al. (2011)
Carne (bovina moída, bovina peça, suína e
de frango) 147 11,50
6,25% dos isolados apresentaram pelo menos um gene de virulência avaliado (A-/B+), 35% dos isolados apresentaram os genes tcdA e tcdB (A+/B+) e 58,75% dos isolados não apresentaram os genes tcdA e tcdB
(A-/B-)
Campinas Tsuchiya (2012)
Produtos cárneos 102 2,00 Isolados identificados como ribotipo 078 Pittsburgh (EUA) Curry et al. (2012) Produtos de carne
suína 31 35,48 Isolados identificados como ribotipo 078 Pittsburgh (EUA) Curry et al. (2012)
