AVALIAÇÃO DAS CORRELAÇÕES ENTRE AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS E AS

pacientes e nos subgrupos.

Não foram observadas correlações entre as concentrações séricas e as expressões proteicas de SAA e APN no grupo total de pacientes ou nos subgrupos (dados não mostrados).

6- DISCUSSÃO

Com o objetivo de estudar a relação da obesidade com o câncer de mama foram constituídos os grupos de pacientes com sobrepeso/obesidade (SP/O) e não obesas (NO), e a classificação foi feita segundo o Índice de Massa Corpórea (IMC) e ou a Circunferência Abdominal (CA). Pacientes consideradas obesas ou com sobrepeso foram aproximadamente 3,7 vezes mais frequentes do que as não obesas.

As concentrações séricas de Col-T, LDL-Col, HDL-Col, VLDL-Col, triglicérides e glicose são parâmetros estreitamente relacionados à obesidade (Krause et al., 2007) e também ao câncer de mama (Rodrigues dos Santos et

al, 2014). Dentre os parâmetros analisados em nosso trabalho, observamos

que as concentrações de triglicérides apresentaram-se mais elevadas e as de HDL-Col mais reduzidas no grupo SP/O. Além disso, encontramos maior frequência de valores alterados de triglicérides e HDL-Col em relação aos parâmetros de referência, nas pacientes com SP/O.

Outros autores demonstraram um aumento significativo nas concentrações de triglicérides e VLDL-Col e redução nas concentrações de HDL-Col em pacientes com câncer de mama (Kokoglu et al., 1994, His et al., 2014). As baixas concentrações de HDL-Col, em particular, têm sido frequentemente associadas ao risco de câncer de mama tanto na pré e quanto na pós-menopausa (Furberg et al 2004 e Kim et al., 2009) bem como ao pior prognóstico (Fan et al., 2015). Uma vez constatada a alta frequência de parâmetros bioquímicos alterados no grupo SP/O, observamos que 51 pacientes (33,1%) deste grupo apresentaram o número de critérios suficientes para serem caracterizadas com a síndrome metabólica (SM), dando origem assim ao terceiro grupo: SP/O-SM.

Estes resultados corroboram os de Kim e colaboradores (2009), que observaram concentrações alteradas de HDL-Col e triglicérides em mulheres com câncer de mama e constataram que o estado dislipidêmico comum à síndrome metabólica (SM), associava-se ao risco aumentado para o câncer de mama. De fato, a detecção do aumento de triglicérides e redução da HDL-Col tem sido relatada em estudos que relacionam o câncer de mama com a SM (Capasso et al., 2011, Calip et al., 2014).

No presente trabalho, o critério de cutoff de CA adotado para a classificação dos grupos encontra respaldo em estudos recentes, que demonstram que a medida da circunferência abdominal apresenta melhor associação com vários distúrbios metabólicos, do que outras medidas antropométricas (van Dijk et al., 2012, Rheme et al., 2013). Seguindo este raciocínio, nossa hipótese era de encontrarmos estágios mais avançados da doença no grupo de pacientes com SP/O. De fato verificamos maior frequência

do ECP III em pacientes com SP/O, posteriormente localizada no grupo de pacientes com SP/O-SM, quando comparadas com pacientes NO.

Além de ser produzida pelo fígado, a SAA é uma adipocitocina também produzida pelos adipócitos e é capaz de mediar diretamente a inflamação associada à obesidade (Zhao et al., 2010). Adicionalmente, em conjunto com outros mediadores inflamatórios, leva os adipócitos à inflamação crônica, que é acompanhada pela infiltração de células do sistema imune, como os macrófagos (Hotamisligil, 2006; Poitou, 2005; Yang Rong-Ze et al., 2006). A inflamação crônica contribui de forma importante para o desenvolvimento e progressão do câncer, por meio de processos complexos, tais como a infiltração de macrófagos no tecido mamário pré-maligno (Schwertfeger et al., 2006; De Nardo e Coussens, 2007). Desta forma, a obesidade poderia influenciar, via SAA e outros mediadores inflamatórios, o desenvolvimento de inflamação crônica, que levaria ao câncer de mama.

No presente estudo, as concentrações de SAA foram mais elevadas em pacientes com SP/O e SP/O-SM do que em pacientes NO. As análises de correlação demonstraram relação direta de SAA com o IMC e a CA (dados não mostrados), confirmando que concentrações mais elevadas de SAA estão presentes no grupo SP/O, estando de acordo com a literatura (Yang Rong-Ze,

et al., 2006; Poitou et al., 2006). Além disso, concentrações mais elevadas de SAA têm sido associadas com alterações metabólicas, como no cenário encontrado na SM (Bremer et al., 2013). Altas concentrações de SAA já foram relacionadas com a porcentagem de gordura, com o IMC e com a CA em pacientes com carcinoma mamário (Dee et al., 2012; Santana et al., 2013), todavia, pelo nosso conhecimento até o momento, ainda não foram demonstradas em portadoras de câncer mamário com SM.

Alguns estudos têm demonstrado que a SAA se associa com o risco de câncer de mama ou pior prognóstico (Pierce et al., 2009; Santana et al., 2013). Neste trabalho não encontramos correlação entre as concentrações séricas de SAA e o estadiamento clínico-patológico da doença (ECP). Mas, as concentrações séricas de SAA apresentaram-se mais elevadas, naquelas com tumores que não expressavam RE (RE-), confirmando nossos resultados

anteriores em estudo realizado apenas com pacientes na pós-menopausa (Santana et al., 2013). O resultado demonstrado no grupo total de pacientes foi também observado no subgrupo de pacientes NO, sugerindo uma associação independente de obesidade e de estado menopausal. Esta observação pode ser constatada quando as análises foram ajustadas para IMC, CA e estado menopausal.

Uma possível explicação para a associação de SAA com receptores RE- já foi sugerida em publicação anterior (Santana et al., 2013), que considerou a habilidade da SAA de induzir a síntese de TNF (Husby et al., 1994), e consequentemente influenciar a regulação positiva da produção de HIF1-α (Bilton e Booker, 2003) que, por sua vez, poderia atuar na repressão da expressão do RE (Ryu et al., 2011).

A APN é a proteína mais abundantemente produzida no tecido adiposo, e é inversamente associada à obesidade (Brakenhielm et al 2004; Galic et al 2010). Baixas concentrações de APN têm sido relacionadas com um aumento no risco de cânceres ocasionados pela obesidade (Mauro et al., 2015). Alguns estudos mostram a associação da hipoadiponectinemia com câncer de mama (Duggan et al., 2011; Dubois et al, 2013).

Em nosso estudo as concentrações de APN apresentaram-se mais reduzidas em pacientes com SP/O-SM quando comparadas com SP/O e NO. A APN exerce efeitos anti-inflamatórios e protege contra desordens metabólicas, tais como hiperglicemia, resistência à insulina, alterações no metabolismo lipídico e inflamação subclínica sistêmica (Lang e Ratke, 2009; Obeide et al., 2012). Dessa forma, nossos resultados poderiam sugerir associação da APN com as alterações metabólicas em pacientes do grupo SP/O-SM em particular, estando de acordo com estudos que relacionam APN com alterações metabólicas em outras doenças relacionadas à obesidade (Matsubara et al., 2002; Kazumi et al., 2002; Chedraui et al., 2014).

Alguns trabalhos demonstram que baixas concentrações de APN sérica têm sido associadas com um pior prognóstico de mulheres com câncer de mama tanto na pré quanto na pós-menopausa (Miyoshi et al., 2003; Mantzoros

et al., 2004; Tworoger et al., 2007; Korner et al., 2007). No presente trabalho,

APN apresentaram-se mais elevadas em pacientes do grupo total, com tumores que não expressavam receptor de estrógeno (RE-). A literatura é ainda controversa sobre a relação de APN com o status do RE. Ao lado de estudos que não encontraram qualquer associação entre APN e o status deste receptor hormonal (Tworoger et al., 2007), existem outros estudos controversos a respeito dos efeitos da APN sobre a linhagem tumoral mamária MCF-7, RE+. Enquanto alguns estudos evidenciaram um significativo efeito antiproliferativo de APN (Korner et al., 2007; Grossman et al., 2008; Jardé et al., 2009), outros demonstraram uma ação estimulatória da adipocina no crescimento desta linhagem celular (Pfeiler et al., 2008; Landskroner-Eige et al., 2009). Estudos in

vitro realizados por Mauro e colaboradores (2014) demonstraram que o RE

estimula o efeito proliferativo da APN sobre a linhagem MCF-7, ao interagir com diferentes moléculas sinalizadoras, incluindo os receptores IGF-R1 e Adipo-R1, pelos quais a APN ativa a fosforilação de MAPK, levando à proliferação das células tumorais MCF-7. Já em relação ao status RE-, alguns autores demonstram que a APN media um efeito antiproliferativo, inibindo o crescimento da linhagem tumoral mamária MDA-MB-231 (RE-), através da regulação de genes envolvidos no ciclo celular, tais como, p53, Bax, ciclina D1 (Dos Santos et al., 2008; Grossman et al., 2008; Mauro et al., 2014). Mais recentemente, Mauro e colaboradores (2015) demonstraram que camundongos que receberam injeção de células MDA-MB-231 (RE-) pré-tratadas com APN exibiram tumores menores do que os controles que receberam células não tratadas, ao passo que o oposto foi verificado em animais que receberam células MCF-7 (RE+) pré-tratadas com APN. Desta forma, considerando o efeito benéfico da APN sobre tumores RE-, a constatação de concentrações mais elevadas de APN em pacientes com tumores RE- em nosso trabalho poderia sugerir uma resposta sistêmica frente a uma maior demanda de produção de APN, para exercício de sua ação antiproliferativa. Todavia, esta suposição necessita de embasamento experimental, não contemplado pelo presente desenho de estudo.

Para avaliar as expressões proteicas de SAA e APN no microambiente tumoral nós realizamos a técnica de Tissue Microarray (TMA), seguida de imunoistoquímica. Embora a literatura não demonstre a expressão proteica de SAA no componente epitelial tumoral de pacientes com câncer de mama, a

expressão de SAA-3 foi reportada em linhagens de células tumorais mamárias MCF-7 e T47D (Larson et al., 2003). Sua alta expressão foi também detectada em células tumorais de cabeça e pescoço, quando comparadas com células não tumorais (Shinriki et al.,2010) e em células epiteliais de carcinoma ovariano, com correlação direta da expressão de SAA com a agressividade do tumor (Urieli-Shoval et al., 2010).

Pelo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que demonstra a expressão proteica de SAA no componente epitelial tumoral e nas regiões adjacentes em espécimes de carcinoma mamário humano. Neste trabalho, nós observamos frequências ascendentes de expressão de SAA nas regiões estudadas: componente epitelial tumoral (T): 40%, componente epitelial não tumoral (NT): 61,7%, tecido adiposo próximo do tumor (GP) (76,6%) e tecido adiposo distante do tumor GD (87,9%).

A expressão proteica de APN no carcinoma mamário humano, entretanto, já foi observada por outros pesquisadores. Karaduman e colaboradores (2007) demonstraram que a expressão de APN em pacientes com câncer de mama foi significativamente mais frequente do que em controles (fibroadenoma) e sugeriram que a alta expressão detectada no câncer de mama estava associada ao aumento do risco para a doença. Um outro grupo também demonstrou que as expressões de APN e de seus receptores foram mais frequentes no carcinoma ductal invasor do que no carcinoma ductal in

situ, associando-as à forma mais grave da doença (Jeong et al., 2011).

No presente trabalho, no grupo total de pacientes nós encontramos expressão mais frequente de APN nos tecidos GP (94,4%), GD (98,4%) e no epitélio T (82,9%), mas frequência extremamente reduzida no epitélio NT (9%). A diferença de frequências de expressão de APN entre os epitélios T e NT observada em nosso trabalho está em oposição aos resultados de Jardé e colaboradores (2008), provavelmente por diferença metodológica.

Ao compararmos as expressões entre SAA e APN nos diferentes microarranjos do grupo total e dos subgrupos de pacientes, observamos expressão mais frequente de APN em relação às de SAA em três das quatro regiões estudadas (T, GP e GD). Já no epitélio NT, a expressão de SAA foi 6,9

mais frequente do que a de APN no grupo total de pacientes e ainda mais frequente no subgrupo SP/O-SM (cerca de 15 vezes).

A análise de TMA foi realizada de forma individual para os quatro diferentes componentes teciduais. Entretanto, o fato deles todos pertencerem ao mesmo microambiente tumoral, condiciona os resultados a uma interpretação conjunta.

Desta forma, a relação inversa entre as frequências de expressão de APN e SAA nos epitélios T e NT poderia indicar, por um lado, a necessidade dos efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos de APN contra as células tumorais, como demonstrado por Luo e colaboradores (2005), e, por outro lado, a demanda de seus efeitos antiinflamatórios, pela frequência mais elevada de SAA no epitélio NT, representando maior atividade inflamatória no ambiente peritumoral, que seria ainda mais exacerbada no grupo SP/O-SM.

No presente estudo, a demonstração de maior frequência de pacientes com ECP III e ausência de expressão de SAA em seus espécimes de tecido adiposo peritumoral (GP) poderia representar o resultado de mecanismos imunossupressores na vigência de tumores mais avançados. Conforme citado anteriormente, no início do desenvolvimento tumoral há evidências de instalação de resposta inflamatória em resposta ao tumor (Zamarrom et al., 2011). Todavia, com a persistência desta resposta, há ativação de células T reguladoras (Treg) TCD4+ CD25+ FoxP3+, que ao inibirem a resposta imunológica, inibiriam a inflamação (Zamarrom et al., 2011; Cruz-Merino et al., 2013). Alternativamente, as células tumorais, como um mecanismo de evasão da resposta imunológica, poderiam produzir moléculas imunossupressoras, que estimulariam a manutenção e a ação das células Treg (Gajewski et al., 2006; Huang e Mellor, 2014). Desta forma, com a inibição da resposta imunológica, além da progressão do tumor, haveria supressão da resposta inflamatória e, consequentemente, de SAA.

Os resultados séricos das proteínas estudadas no presente trabalho demonstram a associação entre inflamação, obesidade, SM, e gravidade do carcinoma invasor de mama.

Conforme ressaltado anteriormente, a SM resultante da quimioterapia impacta negativamente a sobrevida das pacientes, uma vez que a literatura

demostra um aumento do risco para o desenvolvimento de metástases em pacientes com SM (Pasanisi et al., 2006; Berrino et al.,2014).

Desta forma, estudos futuros voltados para a definição de cutoffs precisos das concentrações de SAA e APN, para seu emprego como biomarcadores de obesidade e/ou de SM no momento do diagnóstico da doença, poderão auxiliar na orientação do melhor tratamento destas pacientes, tanto em relação ao tipo de terapia adjuvante, como no controle da adiposidade e na mudança de estilo de vida, visando melhorar o prognóstico destas pacientes.

Além disso, a demonstração de expressão diferencial de SAA e APN nos epitélios tumoral (T) e não tumoral (NT) levanta hipóteses de possíveis mecanismos existentes no microambiente tumoral. Assim, a investigação mais aprofundada destas questões poderá contribuir para o melhor entendimento da fisiopatologia do carcinoma mamário.

6- Conclusões

1. Pacientes com SP/O apresentaram concentrações séricas de SAA mais elevadas e de APN mais reduzidas na comparação com pacientes NO. 2. Foi verificado que 33,1% das pacientes que constituíam o grupo SP/O

apresentaram SM.

3. O ECP III foi mais frequente em pacientes com SP/O-SM na comparação com pacientes NO.

4. Não foi encontrada correlação entre as concentrações séricas de SAA e APN no grupo total ou nos subgrupos de pacientes.

5. As concentrações séricas de SAA apresentaram-se mais elevadas em pacientes com tumores RE-, no grupo total e no subgrupo NO. As concentrações de APN, foram mais elevadas em pacientes com tumores RE-, no grupo total.

6. No grupo total de pacientes foi verificado que a expressão de APN foi 2,1 vezes mais frequente do que SAA no epitélio T, e inversamente a de SAA foi 6,9 vezes mais frequente no epitélio NT. Quanto aos subgrupos, pacientes com SM não expressaram APN no epitélio NT. 7. Foram verificadas frequências ascendentes de expressão de SAA nos

epitélios T, NT, GP e GD, com diferença significativa entre todos eles. Em relação à APN, foram verificadas expressões mais frequentes nos tecidos adiposos GP e GD, que se diferenciaram dos epitélios T e NT, sendo que o epitélio T apresentou expressão 9,2 vezes mais frequente do que o epitélio NT.

8. Foi observada alta frequência de ECP III entre as pacientes com tumores que não expressaram SAA no tecido GP.

9. Não foram encontradas correlações entre as concentrações séricas e as expressões teciduais das proteínas.

7- Referências

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