FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ALINE BARROS SANTANA
AVALIAÇÃO DAS EXPRESSÕES PROTEICAS TECIDUAIS E CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE AMILÓIDE SÉRICA – A E ADIPONECTINA EM MULHERES COM
CÂNCER DE MAMA E RELAÇÃO COM OBESIDADE
CAMPINAS 2016
AVALIAÇÃO DAS EXPRESSÕES PROTEICAS TECIDUAIS E CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE AMILÓIDE SÉRICA – A E ADIPONECTINA EM MULHERES COM
CÂNCER DE MAMA E RELAÇÃO COM OBESIDADE
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências Médicas, na área de concentração em Ciências Biomédicas.
Orientadora: Profª. Drª. Sílvia de Barros Mazon ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ALINE BARROS SANTANA, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. SÍLVIA DE BARROS MAZON.
CAMPINAS 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ALINE BARROS SANTANAORIENTADOR: Sílvia de Barros Mazon
MEMBROS:
1. PROFª. DRª Sílvia de Barros Mazon
2. PROFª. DRª. Helenice Gobbi
3. PROFª. DRª. Márcia Carvalho Garcia
4. PROFª. DRª. Liliana Aparecida Lucci De Angelo Andrade
5. PROFª. DRª. Elaine Conceição de Oliveira
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho a
Profa. Dra. Sílvia de Barros Mazon - Departamento de Patologia Clínica/FCM, pela orientação.
Profa. Dra. Maria Salete da Costa Gurgel - Departamento de Tocoginecologia/FCM. Profa. Dra. Eliana Cotta de Faria - Departamento de Patologia Clínica/FCM.
Prof. Dr. José Vassalo – Departamento de Anatomia Patológica/FCM
Profa. Dra. Glauce Aparecida Pinto - Laboratório de Patologia Especializada (LAPE) do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM.
Dra. Luciana Regina Moreira – Laboratório de Citopatologia do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM
Marisa de Almeida Matsura - Laboratório de Patologia Especializada (LAPE) do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM
Carlos Ferreira Nascimento - Departamento de Patologia Investigativa do AC Camargo Cancer Center
Cleide Aparecida Moreira Silva - Câmara de Pesquisa/FCM.
Aos funcionários da secretaria do Departamento de patologia Clínica: Paulo Henrique de Oliveira e Bruna de Almeida Bianchine
Aos funcionários da Seção de Imunologia da Divisão de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas – UNICAMP.
Aos funcionários da Seção de Bioquímica da Divisão de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas – UNICAMP.
Aos funcionários do serviço de Enfermagem da Unidade de Internação - Seção Oncologia do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM.
Rogéria Elias Malaquias (in memoriam) - Serviço de Arquivo Médico (SAME) do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM.
Aos funcionários da Seção de Coleta de Exames da Divisão de Patologia Clínica do HC/UNICAMP
Aos funcionários da Central de Recepção e Separação de Amostras da Divisão de Patologia Clínica do HC/UNICAMP.
Higor Campos do Nascimento – Laboratório de Imunorregulação FCM/UNICAMP A todas as pacientes da Unidade de Internação - Seção Oncologia do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM, participantes desta pesquisa.
Aos meus pais, Renato e Alice.
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão (FAEPEX).
Aos queridos amigos,
“Se temos de esperar, que seja para colher a semente boa que lançamos
hoje no solo da vida”.
Mulheres obesas apresentam risco aumentado para o câncer de mama, e este tem sido associado a uma alteração de mediadores inflamatórios e adipocinas. A obesidade cursa com um estado inflamatório subclínico e está intimamente relacionada a diversas comorbidades, incluindo a síndrome metabólica (SM). Na vigência da inflamação subclínica, as adipocinas amilóide sérica SAA e adiponectina APN, que possuem funções antagônicas, têm suas concentrações séricas alteradas. Além disso, ambas têm sido associadas com a instalação e a progressão do câncer de mama. O objetivo deste trabalho foi investigar em pacientes com câncer de mama, as relações das adipocinas SAA e APN com a obesidade, com a SM e com as características clínico-patológicas da doença. Desta forma, 196 pacientes na pré- ou pós-menopausa foram classificadas em três grupos: não obesas (NO), n= 42; sobrepeso/obesidade (SP/O), n= 103; e sobrepeso/obesidade com síndrome metabólica (SP/O-SM), n= 51 e todas foram submetidas à análise das concentrações séricas e da expressão proteica de SAA e APN em espécimes cirúrgicos provenientes de mastectomia ou quadrantectomia. As concentrações séricas de SAA foram determinadas por nefelometria e as de APN por imunoensaio enzimático (ELISA). A expressão tecidual das adipocinas foi analisada pelas técnicas de Tissue Microarray (TMA) e imunoistoquímica, em quatro diferentes áreas teciduais: epitélio tumoral (T), epitélio não tumoral (NT), tecido adiposo peritumoral (GP) e distante do tumor (GD). Os grupos SP/O (p=0,0028) e SP/O-SM (p=0,0013), demonstraram concentrações séricas mais elevadas de SAA do que o grupo NO e inversamente, concentrações mais reduzidas de APN (SP/O, p=0,0073 e SP/O-SM, p=0,0002). Concentrações séricas mais elevadas de SAA foram observadas em pacientes com tumores que não expressavam RE (RE-), tanto no grupo total (p=0,009), quanto no subgrupo NO (p=0,043). Também foram detectadas concentrações séricas mais elevadas de APN no grupo total de pacientes com tumores RE- (p=0,011). Estes resultados foram independentes de obesidade (IMC e CA) e estado menopausal. Em relação às análises de expressão proteica, no grupo total de pacientes foram detectadas diferenças de expressão de SAA entre todos os tecidos (≤ 0,0439), com expressão mais frequente nos tecidos adiposos GP (76,6%) e GD (87,9%), seguidos dos epitélios NT (61,7%) e T (40%). Também foi verificada expressão mais frequente de APN nos tecidos adiposos GP (94,4%) e GD (98,4%) em relação aos epitélios T (82,9%, p≤ 0,0115) e NT (9%, p< 0,0001), sendo que a diferença também foi significativa entre os epitélios T e NT (p< 0,0001). Quando os
que a de APN (p< 0,0001) e no epitélio NT 6,9 vezes mais frequente do que APN (p< 0,0001). A análise de frequência entre as proteínas nos diferentes tecidos dentro de cada subgrupo revelou expressão de SAA no epitélio NT aproximadamente 15 vezes mais frequente do que a de APN no grupo SP/O-SM (p< 0,0001). Em relação à associação da expressão das adipocinas com as características clínico-patológicas do câncer de mama, verificou-se elevada frequência de pacientes com ECP III que não expressavam SAA no tecido adiposo GP. Não foram detectadas associações entre as concentrações séricas e as expressões teciduais das proteínas investigadas. A demonstração de concentrações séricas mais elevadas de SAA e APN em pacientes com tumores RE- sugere um estímulo de respostas sistêmicas antagônicas na vigência de tumores mais agressivos. Já, a detecção de expressão diferencial de SAA e APN no epitélio T poderia ser associada aos efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos de APN no microambiente tumoral. Em contrapartida, SAA mais frequente no epitélio NT, poderia sugerir a presença de maior atividade inflamatória no ambiente peritumoral, que seria ainda mais exacerbada no grupo SP/O-SM.
Palavras-chave: SAA – APN – obesidade - síndrome metabólica – inflamação - câncer
Obese women are at increased risk for breast cancer, and this condition has been associated with a change of inflammatory mediators and adipokines. Obesity is associated with a low grade chronic inflammation and it is closely related to several comorbidities including the metabolic syndrome (MetS). As part of low grade inflammation, the antagonistic adipokines serum amyloid A (SAA) and adiponectin (APN) have changes in their serum concentrations. In addition, both have also been associated with the development and prognosis of breast cancer. This study aimed to investigate the relationship of SAA and APN with obesity, MetS and with the clinical and pathological features of breast cancer. Thus, 196 patients were classified into three groups: non-obese (NO), n= 42; overweigh/obesity (OW/O), n= 103; and overweight/obesity with MetS (OW/O-MetS), n= 51 and all of them have had SAA and APN serum concentrations and protein expression in surgical specimens from mastectomy and quadrantectomy analyzed. The serum concentrations of SAA and APN were respectively determined by nephelometry and by enzymatic immunoassay (ELISA) and the protein expression by immunohistochemistry tissue microarray (TMA), was done for four different tissue tumor epithelium (T), non-tumor (NT), adipose tissue close to tumor (GP) and adipose tissue distant from tumor (GD). The OW/O (p= 0.0028) and OW/O-MetS (p= 0.0013) groups showed higher serum concentrations of SAA than NO group, and conversely, lower concentrations of APN (OW/O, p= 0.0073 and OW/O-MetS, p= 0.0002). Higher concentrations of SAA were observed in patients bearing RE -tumors from total p= 0.009, and NO group p= 0.043. Higher APN serum concentrations were also detected in patients with RE- tumors from the total group of patients (p=
0.011). Those results were independent of obesity (BMI and WC) and menopausal
status. Regarding protein expression in the total group of patients, adipose tissue close to tumor (GP) and distant from tumor (GD) had the higher frequencies of SAA expression, 76.6% and 87.0 respectively, followed by non-tumor (T), 61.7%, and tumor epithelium (T), 40%. Higher frequencies of APN expression were observed in GD (98.4%), GP (94.4%) and T (82.9%) samples, in contrast to 9.0% frequency in NT tissue (p <0.0001). Comparison analyses between SAA and APN expression in each tissue showed that in the tumor epithelium (T) APN frequency expression was 2.1 fold higher than SAA (p <0.0001) and in non-tumor epithelium (NT) SAA was 6.9 fold higher than APN (p <0.0001); in GP and GD APN was respectively 1.2 fold (p <0.0001) and 1.1 fold higher than SAA (p= 0.001 ). The subgroups analyses showed that in OW/O-MetS
cancer clinical and pathological features, we observed enhanced frequency of patients with ECP III, with no expression of SAA in adipose tissue GP. The results demonstrate direct and inverse association respectively of serum SAA and APN with obesity and MetS, but no correlation between adipokines serum concentrations. The fact that the concentrations of both, SAA as APN were related to RE- tumors, would suggest antagonist systemic responses in those patients. Opposite frequency expression between SAA and APN in T and NT epithelium could be associated with anti-proliferative and pro-apoptotic functions of APN.
Esquema 1: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com
tumores mamários RE positivos a partir da produção estrogênica extra glandular...24
Esquema 2: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com
tumores mamários RE positivos a partir da hiperinsulinemia que pode acompanhar a obesidade...26
Esquema 3: Esquematização da ação sinérgica dos mecanismos propostos para
explicar a relação da obesidade com a
carcinogênese...29
Esquema 4: Constituição inicial dos grupos de estudo: NO (não obesas) e SP/O
(sobrepeso-obesidade)...40
Esquema 5: Reagrupamento das pacientes em estudo: grupos NO, SP/O e
SP/O-SM...51
Figura 1: Blocos e lâminas pareadas e demarcadas com as áreas de interesse para
confecção do
TMA...45
Figura 2: Etapas geral do processo de construção dos blocos e obtenção dos cortes
de tissue microarray (TMA)...45
Figura 3: Comparação das concentrações séricas de SAA e APN entre os três
grupos de estudo de pacientes com câncer de
mama...54
Figura 4: Imagem representativa da reação imunoistoquimica de SAA nas quatro
regiões
estudadas...61
Figura 5: Imagem representativa da reação imunoistoquimica de APN nas quatro
Tabela 1: Escores finais obtidos pela análise simultânea dos parâmetros:
intensidade de reação e porcentagem de células reativas...47
Tabela 2: Classificação das variáveis dicotômicas...48
Tabela 3: Dados demográficos, antropométricos, bioquímicos e clinico-patológicos
entre os grupos NO e SP/O...50
Tabela 4: Dados demográficos, antropométricos, bioquímicos e clinico-patológicos entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM...53
Tabela 5: Análise de correlação entre SAA e APN no grupo total e nos subgrupos de
pacientes com câncer de mama...55
Tabela 6: Associação das concentrações séricas de SAA com as variáveis
clínico-patológicas da doença no grupo total e nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-SM...57
Tabela 7: Associação das concentrações séricas de APN com as variáveis
clínico-patológicas da doença no grupo total e nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-SM...59
Tabela 8: Comparação entre as frequências de expressão proteica de SAA e APN
nos microarranjos T, NT GD e GP dos espécimes cirúrgicos de carcinoma ductal invasivo da mama do grupo total de pacientes...64
Tabela 9: Comparação das frequências de expressão de SAA e APN entre os
microarranjos T, NT GD e GP dos espécimes de carcinoma ductal invasivo da mama no grupo total de pacientes...65
Tabela 10. Comparação da frequência da expressão entre SAA e APN nos
microarranjos T, NT GD e GP dos espécimes de carcinoma ductal invasivo da mama nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-SM de pacientes...67
nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-SM...69
Quadro 1: Critérios para identificação de síndrome metabólica nas pacientes em
estudo...41
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Português Inglês
AdipoR1 receptor para adiponectina-1 adiponectin receptor-1 AdipoR2 receptor para adiponectina-2 adiponectin receptor-2
AKT --- Kinase B protein
AMPK --- AMP activated protein kinase
APN Col-T adiponectina colesterol total adiponectin --- CA circunferência abdominal ---
ERK --- extracelular signal regulated
kinase
Gli glicose ---
HDL-Col lipoproteína de alta densidade high-density- lipoproteins HER2 receptor para fatores de crescimento human epidermal growth
factor receptor 2
IGF --- insulin-like growth factor
IMC índice de massa corpórea ---
IL-1 ínterleucina-1 ---
IL-6 interleucina-6 ---
LDL-Col lipoproteína de baixa densidade low - density lipoprotein
MAPK --- mitogen activated protein
kinase
mTOR --- mammalian target of
rapamycin
RP receptor de progesterona ---
SAA amiloide sérica A serum amyloid A
SHBG globulina ligante de hormônio sexual sex hormone-binding globulin
SM síndrome metabólica ---
TG triglicérides ---
TLR4 --- toll like receptor 4
TMA microarranjo tecidual tissue microarray TAM macrófagos associados ao tumor tumor associated
macrophages TNM T: extensão do tumor primário - N:
ausência ou presença e a extensão de metástase em linfonodos regionais - M: ausência ou presença de metástase à distância
---
TNF-α fator de necrose tumoral alfa tumor necrosis factor alpha TNBC tumores mamários triplo negativos triple negative breast cancer VR valor de referência
cm - centímetro dL - decilitro g - grama h - hora kg - quilograma L - litro M - molar mg - miligrama min - minuto mL - mililitro mmHg - milímetro de mercúrio m2 - metro quadrado n - tamanho da amostra ng - nanograma nm - nanômetro
p - p valor, nível de significância estatística
pg - picograma
rpm - rotação por minuto ºC - graus Celsius
µg - micrograma
µL - microlitro
2. OBJETIVOS ... 36 2.1. OBJETIVO GERAL ...36 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...36 3. SUJEITOS E MÉTODOS ... 37 3.1. TIPODEESTUDO ... 37 3.2. TAMANHO AMOSTRAL...37
3.3. SELEÇÃO DOS SUJEITOS...38
3.3.1 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO ...39
A. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ...39
B.CRITÉRIOS DE XCLUSÃO...39
3.3.2 CONSTITUIÇÃO INICIAL DOS GRUPOS...39
3.4. COLETADESANGUE ... 40
3.5.QUANTIFICAÇÃODASCONCENTRAÇÕESSÉRICASDECOLESTEROLTOTAL EFRAÇÕES,TRIGLICERÍDEOSEGLICOSE ... 40
3.6. CARATERIZAÇÃODASÍNDROMEMETABÓLICAENTREASPACIENTES ... 41
3.7. QUANTIFICAÇÃODASCONCENTRAÇÕESSÉRICASDESAA ... 41
3.8. QUANTIFICAÇÃODASCONCENTRAÇÕESSÉRICASDEAPN ... 42
3.9. COLETADASINFORMAÇÕESCLÍNICOPATOLÓGICAS ... 43
3.10. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE SAA E APN NAS QUATRO REGIÕES ESTUDADAS DA MAMA DAS PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA...44
A- CONSTRUÇÃO DO MICROARRANJO DE TECIDOS - TISSUE MICROARRAY (TMA)...44
B- ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA PARA INVESTIGAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS SAA E APN ... 46
C- INTERPRETAÇÃO DO ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO...47
3.11. ANÁLISES DE DADOS...48
4. RESULTADOS...49
4.1 DADOS DEMOGRÁFICOS, ANTROPOMÉTRICOS, BIOQUÍMICOS E CLÍNICO-PATOLÓGICOSENTREOSGRUPOSNOESP/O...49
4.2. DADOS DEMOGRÁFICOS, ANTROPOMÉTRICOS, BIOQUÍMICOS E CLÍNICO-PATOLÓGICOSENTREOSGRUPOSNO,SP/OESP/O-SM ... 51
4.4 ANÁLISES DA CORRELAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE SAA E APN NO GRUPO TOTAL E NOS SUBGRUPOS NO, SP/O E
SP/O-SM...55
4.5. ASSOCIAÇÃODASCONCENTRAÇÕESSÉRICASDESAAEDEAPNCOMAS VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DA DOENÇA NO GRUPO TOTAL E NOS SUBGRUPOSDEPACIENTES...56
4.6. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE SAA E APN DAS PACIENTESCOMCÂNCERDEMAMA ... ...60
4.6.1. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA DE SAA E DE APN NOS MICROARRANJOS T,NT,GD E GP DOS ESPÉCIMES CIRÚRGICOS NO GRUPO TOTAL DE PACIENTES...63
4.6.2. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE SAA E DE APN ENTRE OS MICROARRANJOS T, NT,GD E GP DOS ESPÉCIMES CIRÚRGICOS NO GRUPO TOTAL DE PACIENTES...64
4.6.3 COMPARAÇÃO ENTRE AS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA DE SAA E APN NOS MICROARRANJOS T, NT, GD, E GP DOS ESPÉCIMES CIRÚRGICOS NOS SUBGRUPOS DE PACIENTES...66
4.6.4 COMPARAÇÕES DAS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA DE SAA E APN ENTRE OS MICROARRANJOS TECIDUAIS NOS SUBGRUPOS DE PACIENTES NO, SP/O E SP/O-SM...67
4.6.5 ASSOCIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE SAA E APN COM AS CARACTERÍSTICAS CLÍNICO PATOLÓGICAS DOS TUMORES...70
4.6.6 AVALIAÇÃO DAS CORRELAÇÕES ENTRE AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS E AS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO TECIDUAL DE SAA E APN NO GRUPO TOTAL DE PACIENTES...70 5. DISCUSSÃO ... 70 6. CONCLUSÕES... 77 7. REFERÊNCIAS ... 78 8. APÊNDICES...112 9. ANEXOS...116
1. INTRODUÇÃO
A obesidade tem aumentado consideravelmente no mundo todo e sua prevalência mais que dobrou no período entre 1980 e 2014 (WHO, 2015). Em 2014 a Organização Mundial de Saúde anunciou que 1,9 bilhões de adultos apresentavam sobrepeso, e entre eles, mais de 600 milhões eram obesos (WHO, 2015). No Brasil, pesquisas realizadas pelo Ministério da Saúde mostraram que 52,5% dos adultos apresentavam sobrepeso. A incidência de obesidade nos adultos era de 17,9%, com igualdade entre os gêneros e com frequência mais elevada nas faixas entre 45-64 anos (Ministério da Saúde, 2015).
A obesidade impacta negativamente a saúde da mulher de muitas formas: acarreta maior risco para o desenvolvimento de diabetes (Gallagher et
al., 2008) e doença arterial coronariana (Weiss et al., 2009), prejudica a
contracepção e a fertilidade (Lash e Armstrong, 2009), diminui a intenção, o início e a duração da amamentação (Hilson et al., 2004) e contribui para o aumento do risco de mortalidade neonatal e de malformações (Kristensen et
al., 2005 e Stothard, 2009). Também tem sido associada à depressão (Yu et al., 2015; Arterburn et al., 2012), bem como ao alto risco para o
desenvolvimento de vários cânceres. Casos novos de câncer em adultos têm sido atribuídos ao excesso de peso corporal (Arnold et al., 2015). Evidências clínicas mostram que o aumento das medidas de obesidade, tais como, índice de massa corpórea (IMC) e circunferência abdominal (CA), estão associadas com o aumento da prevalência de certos cânceres, como próstata, pâncreas (Pischon et al., 2008; Gonzalez et al., 2006; Calle et al., 2003; Renehan et al., 2008; Wolin et al., 2010), endometrial (Kaaks et al., 2002; Jenabi et al., 2015) cervical (Maruthur et al., 2009), ovariano (Leitzmann et al., 2009)e de mama (Kuhl, 2005; Goodwin et al., 2015) e também pode prejudicar a resposta aos tratamentos de quimioterapia e radioterapia, levando a um prognóstico inferior ao esperado em indivíduos obesos (Vucenik et al., 2012; Griggs et al., 2005; Wong et al., 2009).
A agência internacional de pesquisa em câncer (IARC/WHO) anunciou uma estimativa de 14,1 milhões de novos casos de câncer em 2012. Entre
eles, o câncer de mama é o câncer mais frequentemente diagnosticado e responsável pela causa de morte entre as mulheres no mundo todo, com uma estimativa de 1,7 milhões de novos casos e 521,900 mortes em 2012, contabilizando 25% dos casos e 15% das mortes causadas pelo câncer entre as mulheres (WHO 2012; Torre et al., 2015).
No câncer de mama, em particular, a obesidade tem se mostrado responsável pelo aumento de 30 a 50% na taxa de acometimento de mulheres na pós-menopausa (Tehard, 2006). Todavia, em mulheres mais jovens o papel da obesidade é controverso. Nessas mulheres, a obesidade poderia ser um fator protetor para câncer de mama e não um fator de risco (Rose e Vona-Davis 2010). Entretanto, outros autores demonstraram que mulheres obesas na pré-menopausa apresentam risco aumentado para o câncer de mama, e este tem sido associado a uma alteração de mediadores inflamatórios e adipocinas (Alokail et al., 2009). Além do estado hormonal, alguns estudos indicam que o aumento do IMC está associado ao câncer de mama mais agressivo e a um período de sobrevida mais reduzido (Porter et al., 2006, Carmichael 2006; Haakinson et al., 2012; Copson et al., 2015; Kamineni et al., 2013; Chan et al., 2014). Diante do exposto, algumas teorias propõem mecanismos que poderiam levar à compreensão parcial desta associação.
Entre as hipóteses propostas para explicar a associação entre câncer de mama e obesidade na pós-menopausa, a primeira delas considera a concentração mais elevada de estrógeno circulante proveniente da aromatização de andrógenos no tecido adiposo de mulheres obesas em comparação ao de mulheres magras na pós-menopausa (Lorincz e Sukumar, 2006). Nesta fase o estrógeno é produzido quase exclusivamente nos pré- adipócitos do tecido adiposo pela aromatização do esteróide androestenediona C19 em estrona (Judd et al., 1982; Key et al., 2003). O aumento do peso corporal faz com que esta produção extraglandular de estrógeno também aumente, elevando a concentração plasmática de estrógeno em mulheres obesas na pós-menopausa. (Baglietto et al., 2009).
Além da aromatase, a enzima 17- β-hidroxiesteróide desidrogenase, responsável pela conversão da estrona em estradiol biologicamente ativo, está presente no tecido adiposo (Rose e Vona Davis 2014). A obesidade não só
aumenta a produção de estrógeno na pós-menopausa, como aumenta também a sua biodisponibilidade. Cerca de 1 a 2 % do estradiol circula no plasma em sua forma não ligada (livre); 30 a 50 % circula em sua forma não funcional, ou seja, se liga com alta afinidade à globulina ligante de hormônio sexual (SHBG) que controla a sua biodisponibilidade e acesso a células alvo; mas o restante circula ligado fracamente à albumina se tornando uma potencial fonte de estradiol livre (Vona-Davis e Rose 2013).
O estrógeno é um importante fator biológico na promoção de câncer de mama e tem sido associado à progressão para fenótipo invasivo e metastático em significativa parcela dos tumores mamários humanos (Vona-Davis e Rose, 2007). Todavia, a capacidade de responder à ação deste hormônio é dependente da presença e concentração de receptores de estrógeno (RE) nas células tumorais (Hemsell et al., 1974; Lorincz e Sukumar, 2006). Desta forma, a associação do estrógeno com o desenvolvimento do câncer mamário poderia ser decorrente de sua ação na proliferação das células epiteliais mamárias, ativando vias de sinalização intracelular mediadas pelos RE (Yager 2000; Strong et al., 2013) (esquema 1).
Este mecanismo poderia explicar a associação da obesidade com tumores mamários RE positivos, mas não a relação da obesidade com tumores RE negativos (Godden et al., 1992; Hou et al., 2007)
Esquema 1: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com tumores
mamários RE positivos a partir da produção estrogênica extraglandular. Adaptado de Wang X
et al., 2015.
Alguns estudos demonstram que altas concentrações séricas de glicose têm sido associadas ao aumento do risco de câncer de mama tanto em mulheres na pré- quanto na pós-menopausa (Alokail et al., 2009; Gunter et al., 2009; Kabat 2009; Sieri et al., 2012).
A obesidade pode desencadear a resistência à insulina, com consequente aumento da glicose circulante, que pode fazer com que o pâncreas produza o hormônio insulina em excesso, na tentativa de equilibrar a glicemia. Este estado hiperinsulinêmico, também está presente em indivíduos que apresentam Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) (De Bruijin et al., 2013). A literatura demonstra como segunda hipótese para explicar a associação do câncer de mama com a obesidade que a resistência à insulina, hiperglicemia, hiperinsulinemia e uma grande biodisponibilidade do fator de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF-1) são anormalidades metabólicas diretamente relacionadas com o risco de câncer de mama (Krebs et al., 2006; Larson et al.,
2007; Gunter et al., 2009; Kabat et al., 2009; Sundaram et al., 2013). A insulina possui ações mitogênicas, e durante a formação tumoral, por meio de seu receptor, pode ativar vias que conduzem a eventos proliferativos. (Garg et al., 2014). A expressão dos receptores 1 de insulina (IRS1) é aumentada no tecido mamário com câncer, particularmente naqueles com alto grau de diferenciação (Sisci et al., 2007). Deste modo, a insulina pode ativar tanto a via ERK (extracelular signal-regulated kinase) quanto a via PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase), levando ao desenvolvimento tumoral, pela perda de integridade epitelial e aumento na migração e invasão celular (Chan et al., 2007; Frasca et
al., 2008). A insulina, tanto como seu receptor, possui alta homologia com o
IGF-1 e seu receptor, o IGF-1R, e desta forma, ambos os ligantes podem agir por meio de ambos os receptores (Gunter et al., 2008).
Ao lado de suas ações mitogênicas, a insulina e o IGF-1 podem ativar a transcrição do RE em linhagens celulares de câncer de mama (Moscho e Mantozoros, 2002), como demonstrado pela ação sinérgica entre IGF-1 e estradiol na ativação transcricional dos RE (Yee e Lee, 2000). De fato, a produção estrogênica pode ser modulada pela insulina, levando à gênese tumoral (Jalving et al., 2010) (esquema 2).
Adicionalmente, a hiperinsulinemia crônica inibe a síntese hepática da SHBG. Esta globulina, que é uma glicoproteína plasmática se liga com alta afinidade aos esteróides sexuais e controla a sua biodisponibilidade e acesso a células alvo. Deste modo, a inibição da síntese de SHBG contribui para o aumento da biodisponibilidade de andrógenos e estrógenos circulantes (Madigan et al., 1998).
Esquema 2: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com tumores
mamários RE positivos a partir da hiperinsulinemia que pode acompanhar a obesidade. Adaptado de Wang X et al., 2015.
Além das hipóteses acima, outros autores, ao relacionarem a obesidade com câncer de mama, referem a importância de outros fatores secretados pelo tecido adiposo coletivamente chamado de adipocinas ou adipocitocinas como: adiponectina, leptina, resistina, TNF, IL-6, IL-8, IL1β, (Frayn et al., 2003; Lorincz e Sukumar, 2006; Vona-Davis e Rose, 2007). Sugerindo assim, a terceira hipótese.
O tecido adiposo é composto por adipócitos, pré-adipócitos, fibroblastos, macrófagos e vasos sanguíneos. Integrados, estes componentes funcionais revelam que o tecido adiposo não é apenas um depósito de energia, mas também age como órgão endócrino que controla uma grande diversidade de funções biológicas de forma, autocrina, parácrina e endócrina (Hotamisligil et
al., 1995; Skurk et al., 2007; Wang et al., 2015). Fatores secretados pelo tecido
Na obesidade, a hipertrofia e hiperplasia do tecido adiposo conferem uma característica disfuncional ao tecido. Este estado inicia uma ação crucial em muitas doenças relacionadas à obesidade como inflamação, resistência à insulina e câncer (P. Br 2015). O aumento do tecido adiposo, especialmente o tecido adiposo branco, produz um grande número de citocinas ou adipocinas (TNF, IL-6, IL-8, IL1β) que apresentam um aumento local e sistêmico em mulheres obesas (Harvey et al., 2011 e Subbaramaiah et al., 2011).
A localização do tecido adiposo apresenta um papel fundamental nas complicações metabólicas da obesidade. Por isso, o tecido adiposo intra-abdominal, localizado próximo ao fígado, é especialmente associado a um perfil metabólico anormal (Jensen et al., 2008). Em comparação à gordura subcutânea, a gordura visceral apresenta maior infiltração macrofágica e o aumento da concentração de citocinas inflamatórias na circulação do sistema porta hepático, o que leva à inflamação crônica subclínica sistêmica (Fontana
et al., 2007; Harman-Boehm et al., 2007).
A inflamação crônica subclínica é causada pela secreção alterada de adipocinas no tecido adiposo disfuncional e este estado pode alterar o metabolismo lipídico e de glicose, além de contribuir para o risco de doenças coronarianas em indivíduos com obesidade abdominal (Trayhum, 2005; Ferrante et al., 2007).
A transformação maligna tem sido estreitamente associada à inflamação crônica e as secreções de citocinas pró-inflamatórias e proteínas de fase aguda podem representar a principal causa para esta estreita conexão. A inflamação crônica aumenta o risco de vários cânceres e está associada com o desenvolvimento e progressão tumoral (Sica et al., 2008; Hursting et al., 2010).
Em indivíduos obesos, os adipócitos, além de secretarem citocinas inflamatórias e outras adipocinas, também secretam a proteína de fase aguda amilóide sérica A (SAA), que possui ação pró-inflamatória (Poitou et al., 2006) e os fatores de crescimento endotelial (VGF) e IGF-1 (Miyazawa-Hoshimoto et
al., 2003). VGF e IGF-1 estimulam a via de sinalização PI3K/Akt
sobrevivência, migração e invasão celular promovendo hiperplasia, crescimento tumoral e formação metastática (Ungefroren, 2015).
No câncer de mama, estudos revelam que a inflamação crônica relacionada à obesidade estabelece um microambiente que favorece a mutagênese, proliferação de células neoplásicas e formação tumoral com alto potencial metastático (Lithgow e Covington, 2005; Rose e Vona Davis, 2014). Sua associação com a promoção de carcinogênese tem sido demonstrada por processos complexos, como a polarização de macrófagos associados ao tumor (TAM), via ação de citocinas inflamatórias TNF, IL-6, IL-8, IL1β e subsequente produção de fatores de crescimento tumoral (Ulrich et al., 2006; Schwertfeger
et al., 2006; De Nardo e Coussens, 2007).
A inflamação crônica pode induzir a angiogênese e grande número de fatores angiogênicos incluindo VEGF, que é induzido por TNF- através da ativação da via NF-kappa B (Yoshida et al., 1997). O processo de angiogênese e adipogênese é coordenado por uma interação parácrina mediada amplamente por VEGF secretado de pré-adipócitos e macrófagos. Esta íntima relação é demonstrada em humanos pela associação direta entre IMC, gordura corporal total e concentração plasmática de VEGF (Brakenhielm et al., 2004)
Nos últimos anos, as adipocinas SAA e APN, que possuem funções
antagônicas, têm recebido notável destaque na literatura por suas associações com aspectos metabólicos e inflamatórios ligados à obesidade (Matsubara et
al., 2002; Hoffstedt et al., 2004; Kim et al., 2005; Yang Rog Ze et al., 2006;
Poitou et al., 2006; Lappalainen et al., 2008; Zhao et al., 2010; Esfahani et al., 2015). Além disso, ambas têm sido relacionadas com o câncer de mama. Estudos relatam que concentrações aumentadas de SAA (O’Hanlon et al., 2002; Pierce et al., 2009) e, inversamente, concentrações diminuídas de APN (Myoshi et al., 2003; Jarde et al., 2011) correlacionam-se com risco aumentado para o desenvolvimento e o pior prognóstico do câncer mamário (esquema 3).
Esquema 3: Esquematização da ação sinérgica dos mecanismos propostos para explicar a
relação da obesidade com a carcinogênese. Adaptado de Mauro et al., 2015.
Amilóide Sérica-A (SAA)
Atualmente sabe-se que a inflamação crônica tem um papel no desenvolvimento e progressão do câncer, e este processo pode ser associado à secreção de citocinas pró-inflamatórias, entre outros mecanismos fisiopatológicos (Schottenfeld, 2006).
A proteína amilóide sérica A (SAA) é uma biomolécula de fase aguda, que atua tanto em processos homeostáticos quanto patológicos (Eklund et al., 2012). Ela é sintetizada pelo fígado (Ramadori et al., 1985, Betts et al., 1991; Raynes et al., 1991), e a sua secreção aumenta na presença de citocinas inflamatórias (i.e. IL-1β, IL-6 and TNF-). No período entre 5 ou 6 horas após o início da reação aguda, as concentrações de SAA no sangue podem aumentar em até 1.000 vezes (Steel e Whitehead, 1994). Ela é uma proteína de 12 kDa, que pertence a família de apolipoproteinas, (Levin et al., 1973, Anders et al., 1975; Rosenthal et al., 1976; Bendit e Erikssen 1977; Skogen et al., 1979) e atraiu interesse devido a deposição fibrosa de proteína amiloide A (AA) que é produto da clivagem de SAA, em doenças inflamatórias crônicas associadas à amiloidose (Bendit e Eriksen,1971). Embora a SAA tenha quatro isoformas, em humanos, a SAA-1 é a isoforma mais abundante (Steel e Whitehead, 1994).
A SAA é secretada também pelo adipócito e está envolvida no transporte de colesterol, na degradação da matriz extracelular e no recrutamento de células inflamatórias para o sítio da inflamação (Schultz 1990; Ulhar 1999;
Manley et al., 2006, Poitou et al., 2009). A partir da detecção de sua síntese pelo tecido adiposo (Sjöholm et al., 2005; Yang et al., 2006) esta proteína vem sendo aventada como um sensível marcador biológico de obesidade, com potencial uso clínico na avaliação de ganho e redução de adiposidade (Poitou
et al., 2006; Lappalainen et al., 2008).
Em relação às doenças malignas, há mais de três décadas a SAA já era associada ao seu desenvolvimento, especialmente ao processo metastático (Rosenthal et al., 1979) com o seu valor destacado no monitoramento de câncer de próstata (Kaneti et al., 1984), e associação com inflamação e com o estágio do câncer de mama (Weinstein et al., 1984; Biran et al. ,1986). Posteriormente, em um estudo prospectivo, a SAA e a proteína C reativa (PCR) foram consideradas fatores prognósticos para o câncer de mama, pela detecção de concentrações mais elevadas de ambas, em portadoras de tumores mais avançados. Desta forma, postulou-se que estas proteínas poderiam ser utilizadas tanto na avaliação de risco, quanto na indicação da progressão do câncer mamário (O’Hanlon et al., 2002; Dowling et al., 2012; Zhang et al., 2012). E ainda, Pierce e colaboradores (2009) também demonstraram que concentrações mais elevadas de SAA foram associadas à sobrevida global reduzida destas pacientes.
Resultados de ensaios in vitro demonstram que a SAA é capaz de estimular a síntese e secreção de citocinas pró-inflamatórias em neutrófilos e monócitos humanos (Ribeiro et al., 2003). Por outro lado, citocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6 e TNF-α agindo sobre os hepatócitos e monócitos podem aumentar a síntese e liberação da SAA no organismo (Raynes e McAdam 1991, Husby et al., 1994). Levando em conta a ação recíproca entre SAA e citocinas inflamatórias presentes na obesidade, esta conexão garantiria a manutenção do estado inflamatório crônico (Poitou et al., 2006; Lappalainen
et al., 2008). Além disso, a SAA, pela sua propriedade de se ligar a proteínas
da matriz extracelular, como laminina e heparina, somada à sua ação quimiotática para monócitos e leucócitos (Urieli-Shoval et al., 2002; Preciado-Patt et al., 1998), pode contribuir para a manutenção de um microambiente inflamatório crônico. Ainda neste contexto, a modificação das proteínas da matriz extracelular, poderia levar ao aumento da ativação de plasminogênio e
produção de metaloproteinases (MMPs), contribuindo para a redução de interação entre células epiteliais e matriz extracelular, e subsequente para a carcinogênese e invasão das células tumorais (Ancsin e Kisilevsky 1999).
Estudos in vitro demonstraram que a SAA é capaz de agir sobre os receptores TLR4 de macrófagos e deflagrar uma resposta via ERK ½ / p-38 e MAPK (mitogen-activated protein kinase), resultando na produção de óxido nítrico (NO) (Sandri et al., 2008). O NO é considerado uma espécie reativa de oxigênio (ROS), que ao entrar em contato com o oxigênio torna-se um radical livre (NO•), o qual rapidamente se transforma em peroxinitrito (ONOO-). Esta última molécula é responsável por lesar moléculas como DNA e RNA (Vasconcelos et al., 2007). Desta forma, a SAA poderia estar indiretamente envolvida neste mecanismo carcinogênico.
Embora a literatura ainda não tenha demonstrado a expressão proteica de SAA no epitélio tumoral de pacientes com câncer de mama, a expressão de SAA-3 foi relatada em células das linhagens tumorais mamárias MCF-7 e T47-D (Larson et al., 2003). Sua alta expressão foi também detectada em células tumorais de cabeça e pescoço, mas não em células não tumorais. (Shinriki, 2010). Além disso, a sua expressão também foi demonstrada em células epiteliais de carcinoma de ovário, e revelou correlação direta com a agressividade do tumor (Urieli-Shoval, 2010).
É conhecido que, no início do desenvolvimento tumoral, macrófagos associados ao tumor (TAM) liberam citocinas pró-inflamatórias, tais como TNFα e IL-6 (Zamarrom et al., 2011), que por sua vez possuem a capacidade de induzir SAA (Raynes e McAdam 1991, Husby et al., 1994). Desta forma, a presença de SAA favoreceria a amplificação da inflamação no ambiente peritumoral.
Adiponectina (APN)
Com função antagônica à SAA, a APN é uma adipocina envolvida em vários processos biológicos do corpo humano e foi descrita como o primeiro peptídeo do tecido adiposo a apresentar concentrações diminuídas na obesidade (Ouchi et al., 1999). A APN é uma proteína de 244 aminoácidos, 30
kD de peso molecular codificada no cromossomo humano 3q27. Ela é secretada pelo tecido adiposo em quantidade inversamente proporcional ao IMC (Takahashi et al., 2000; Rajala e Scherer, 2003; Ryan et al., 2003; Yuan et
al., 2006). Sua estrutura se origina de um domínio amino-terminal não-globular,
um domínio colágeno-símile e um domínio carboxi-terminal globular (Scherer et
al., 1995) e pode ser secretada nas formas de trímero (3 × 1) baixo peso
molecular (LMW), hexâmero (3 × 2) médio peso molecular e 18 monômeros (3 × 6) multímero, este último constituindo a forma de alto peso molecular (HMW) (Rajala e Scherer, 2003; Pajvani et al., 2003; Wang et al., 2008). Em humanos, as concentrações presentes na circulação sanguínea são relativamente altas, variando de 0,5 a 30 µg/mL (Whitehead et al., 2006), entretanto é reduzida em indivíduos com resistência à insulina e obesidade visceral (Lang e Ratke, 2009). Uma vez sintetizada pelos adipócitos, ela exerce seus efeitos biológicos, principalmente por meio de seus receptores, AdipoR1 e AdipoR2 (Yamauchi et
al., 2003).
Baixas concentrações de APN também têm sido relacionadas com um aumento no risco de cânceres associados à obesidade (Mauro et al., 2015). Em relação ao câncer de mama, alguns estudos mostram a associação da hipoadiponectinemia com risco aumentado para o seu desenvolvimento e pior prognóstico (Myoshi et al., 2003; Jardé et al., 2011; Duggan et al., 2011; Dubois
et al., 2013).
Grande parte da ação da APN no câncer ocorre via AMPK
(AMP-activated protein kinase), que por sua vez, interfere na sinalização do crescimento celular, por meio da via mTOR (mammalian target of rapamycin), e inibe a promoção da carcinogênese (Shackelford et al., 2009; Taliaferro et al., 2009).
O tratamento de linhagens celulares de carcinoma mamário com APN recombinante humana demonstrou sua ação sobre a via PI3K/AKT, por diminuir a fosforilação desta, com consequente redução do crescimento e proliferação celulares (Fresno et al., 2004). E também, outros estudos in vitro, com linhagens celulares de câncer de mama e endométrio mostraram que a APN inibiu a sinalização da via ERK1/2, afetando sua função mitogênica e
exercendo efeitos anti-proliferativos e apoptóticos (Dieudonne et al., 2006; Cong et al., 2007).
Ensaios realizados com as linhagens celulares de câncer mamário humano, MDA-MB-231 e T47D, estimuladas com APN, demonstraram que estas foram induzidas à apoptose e apresentaram significativa diminuição da síntese de DNA e da proliferação celular (Kang et al., 2005; Wang et al., 2006). Além disso, a APN inibiu o crescimento de outras duas linhagens celulares Hs578T e SK-BR-3, mas não o crescimento das linhagens, MCF-7 e HCC-38 (Kang et al., 2005). Entretanto, outros pesquisadores demonstraram que o crescimento das linhagens, MCF-7 foi negativamente regulado pela APN (Dieudonne et al.,2006; Arditi et al., 2007). Em concordância com resultados experimentais, baixas concentrações de APN sérica têm sido associadas com um pior prognóstico em mulheres com câncer de mama na pós-menopausa (Miyoshi et al., 2003; Mantzoros et al., 2004; Tworoger et al., 2007) e na pré-menopausa (Korner et al., 2007), ao passo que, altas concentrações séricas foram correlacionadas com aumento de sobrevida global (Duggan et al., 2011). Todavia, um estudo caso-controle demonstrou que baixas concentrações séricas de APN não se correlacionaram com o risco aumentado para o câncer de mama (Gaudet et al., 2010). Por outro lado, Grossmann e colaboradores (2010), reportam que hipoadiponectinemia tem sido associada ao aumento do risco para câncer de mama e com a expressão de um fenótipo agressivo e metastático.
Quanto à expressão tecidual, os estudos são ainda controversos. Karaduman e seu grupo (2007) demonstraram que a expressão tecidual de APN em pacientes com câncer de mama foi significativamente maior do que em controles e sugeriram que a alta expressão de APN detectada no câncer de mama estava associada ao aumento do risco para a neoplasia. A APN e seus receptores foram associados à invasividade do câncer de mama (Jeong et al., 2011) e a expressão de APN foi mais elevada no carcinoma ductal invasivo (CDI) do que no in situ, forma menos grave da doença (Jardé et al., 2008). Todavia, estes últimos autores demonstraram expressão maior de APN no epitélio adjacente ao tumor do que no epitélio tumoral. Além disso, um estudo recente mostrou a ausência de associação entre a expressão tecidual de APN
e tumores mamários triplo negativos (TNBC), considerados de pior prognóstico (Cubukc et al., 2014). Sonmez e colaboradores (2011), por sua vez, sugerem que os mecanismos regulatórios da APN parecem ser diferentes na circulação e no tecido de pacientes com câncer de mama, pois as concentrações séricas de APN foram inversamente correlacionadas com a sua expressão tecidual tumoral.
Tanto a hipoadiponectinemia, como altas concentrações de SAA, além de se correlacionarem com obesidade e câncer de mama, se associam com a síndrome metabólica (SM) (Bremer et al., 2011).
A obesidade leva a várias disfunções, incluindo alterações no metabolismo lipídico, da glicose e da função arterial, e estas alterações encontram-se associadas com o estado inflamatório subclínico (Alberti et al., 2009). A síndrome metabólica pode ser caracterizada por cinco critérios: obesidade central, redução de HDL- colesterol, elevação de triglicérides, hipertensão arterial e hiperglicemia, sendo que a presença de três destes fatores é suficiente para o diagnóstico de SM (NCEP-ATP III, 2005). O depósito do tecido adiposo que se relaciona fortemente com a SM é o tecido adiposo visceral, que por ser o mais metabolicamente ativo é responsável pela inflamação subclínica sistêmica, devido à secreção de citocinas pró-inflamatórias. (Gilbert et al., 2013).
Nos últimos anos a síndrome metabólica (SM) tem sido associada ao risco, tanto para o desenvolvimento, como para o pior prognóstico do câncer de mama (Rosato et al., 2011; Bao et al., 2013). Um estudo de coorte, com aproximadamente 20.000 mulheres, demonstrou associação entre SM e o risco para o câncer de mama em mulheres na pós-menopausa, mas não em mulheres na pré-menopausa (Agnoli et al., 2015). Alguns estudos demonstram a sua associação com fenótipos mais agressivos em pacientes na pós-menopausa. Healy e colaboradores (2010) relataram que 51% das pacientes que possuiam tumores mamários entre os estágios II e IV apresentavam SM. Além disso, Maiti e seu grupo (2010) observaram que a SM foi mais prevalente em pacientes com tumores triplo negativos do que aquelas que não apresentavam esta característica clínico-patológica, sugerindo possíveis interações entre as alterações metabólicas e a gravidade dos tumores. Em
relação à sobrevida livre de progressão, em um estudo com 110 pacientes com câncer mamário, acompanhadas por cinco anos, os autores demonstraram que 95% daquelas que apresentaram SM ao diagnóstico desenvolveram metástase (Pasanisi et al., 2006).
Além disso, alguns estudos sugerem o desenvolvimento da SM na vigência do tratamento quimioterápico (Levine et al.,1991; Campbell et al, 2007; Arpino et al., 2015; Vagenas et al., 2016). Nestes estudos, pacientes que faziam uso de quimioterapia adjuvante apresentaram um aumento significativo na adiposidade corporal, seja no aumento da massa de gordura ou na alteração da localização desta adiposidade e também apresentaram alteração do perfil lipídico, com consequente desenvolvimento da SM. Todavia, ainda não estão bem estabelecidos quais fatores poderiam levar ao desenvolvimento do ganho de peso e subsequentes alterações metabólicas durante o tratamento do câncer mamário.
Vários estudos demonstram o aumento de biomarcadores inflamatórios na circulação sanguínea, na vigência da SM, sugerindo um estado pró-inflamatório associado a ela (Eckel et al., 2005, Cornier et al., 2008). Bremer e colaboradores (2011) compararam as concentrações de vários biomarcadores inflamatórios circulantes e observaram concentrações de SAA mais elevadas e de APN mais reduzidas em portadores de SM do que em indivíduos saudáveis. Deste modo, a detecção da SM ao diagnóstico do carcinoma mamário através de biomarcadores como a SAA e a APN, poderia auxiliar no manejo de tais pacientes, tanto em relação ao tipo de terapia adjuvante, como no controle da adiposidade e na mudança de estilo de vida.
Existem muitas pesquisas que buscam respostas para a influência da obesidade e de suas alterações metabólicas sobre o câncer de mama, incluindo sua relação com as adipocinas inflamatórias. Entretanto, devido à alta complexidade das funções e interações dessas adipocinas na obesidade, os mecanismos precisos ainda não foram elucidados. Além disso, como os tumores mamários estão expostos tanto às adipocinas circulantes quanto às produzidas localmente nos adipócitos adjacentes, a íntima asociação entre as celúlas tumorais mamárias e os adipócitos poderia favorecer uma ação mais direta das adipocinas sobre o microambiente tumoral. Neste cenário, a
exploração das relações das adipocinas SAA e APN com o câncer de mama, obesidade e SM, constitui-se assunto ainda inesgotado. Desta forma, a proposta do presente trabalho considera a possibilidade de que pacientes com concentrações mais elevadas de SAA e mais reduzidas de APN apresentarão características clínico-patológicas de maior gravidade e esta condição será dependente de obesidade e SM. Já, nos espécimes cirúrgicos mamários destas pacientes, espera-se encontrar expressão diferencial das adipocinas pesquisadas, fato este ainda não demonstrado na literatura.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Investigar, em pacientes com câncer de mama, as relações das adipocinas SAA e APN com a obesidade e com as características clínico-patológicas da doença.
2.2. Objetivos Específicos
1- Comparar as concentrações séricas de SAA e APN entre os grupos de pacientes não obesas (NO) e com sobrepeso/obesidade SP/O.
2- Investigar a presença de síndrome metabólica (SM) entre as pacientes em estudo.
3- Comparar as características clínico-patológicas do câncer de mama: estadiamento clínico-patológico (ECP), status dos receptores de estrógeno (RE), de progesterona (RP) e do fator de crescimento epidérmico tipo 2 humano (HER2), entre os grupos de pacientes.
4- Investigar as correlações entre as concentrações séricas de SAA e APN no grupo total e nos subgrupos de pacientes.
5- Investigar a associação das concentrações séricas de SAA e de APN com as características clínico-patológicas do câncer de mama no grupo total e nos subgrupos de pacientes.
6- Comparar a frequência de expressão entre as proteínas SAA e APN em cada regiaõ tecidual do espécime cirúgico mamário das pacientes: epitélio tumoral (T), epitélio não tumoral (NT), gordura peritumoral (GP) e gordura distante do tumor (GD), no grupo total e nos subgrupos de pacientes.
7- Comparar as frequências de expressão de cada proteína entre as diferentes regiões teciduais, no grupo total e nos subgrupos de pacientes.
8- Investigar a associação das frequências de expressão de SAA e de APN com as características clínico-patológicas do câncer de mama no grupo total e nos subgrupos de pacientes.
9- Investigar as correlações entre as concentrações séricas e as frequências de expressão tecidual no grupo total e nos subgrupos de pacientes.
3.0 SUJEITOS E MÉTODOS
3.1. Tipo de Estudo
Trata-se de estudo transversal com portadoras de câncer de mama. As pacientes foram atendidas nos ambulatórios de Patologia Mamária e Oncologia Clínica do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti - Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM) pertencente à Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
3.2. Tamanho Amostral
Para definição do tamanho amostral foi levada em consideração a frequência de portadoras de câncer de mama não obesas, atendidas nos ambulatórios de Patologia Mamária e Oncologia Clínica do CAISM-UNICAMP, que corresponde a 37% do total de atendimentos (cerca de 350 casos/ano)
para essa doença (Zorlini et al., 2008). Desta forma, o tamanho da amostra total (n= 258) foi determinado a partir de estimativa aproximada entre a frequência de portadoras de câncer de mama não obesas (n= 129) pareada com o número de portadoras com sobrepeso/obesidade.
Todavia, na prática, a soma de critérios (IMC e CA) para a composição do grupo de não obesas (NO) impediu o alcance do tamanho amostral teórico. Isto se justificou pelo fato da frequência de não obesas de 37% (Zorlini et al., 2008) só ter levado em conta o IMC. Na realidade, a frequência de não obesas verdadeiras (duplo critério) é bem mais baixa, devido à alta frequência de adiposidade central entre as pacientes. Além disso, os critérios de seleção no presente estudo limitaram ainda mais o alcance do tamanho amostral teórico. Desta forma, a amostra final foi composta por 196 pacientes: 42 no grupo NO e 154 no grupo SP/O.
3.3. Seleção dos sujeitos
Entre 2009 a 2014 foram selecionadas, consecutivamente, pacientes
com diagnóstico de câncer de mama ductal invasivo que foram internadas na unidade de Oncologia Cirúrgica do CAISM-UNICAMP para o tratamento cirúrgico.
A agenda das pacientes que seriam submetidas à cirurgia mamária era obtida na Divisão de Oncologia, com antecedência de 15 dias. No dia da internação, com o objetivo de constatar a possibilidade de participação da paciente na pesquisa, os dados eram verificados nos prontuários médicos e segundo os critérios de inclusão e exclusão (Check List – Apêndice I) a paciente era convidada ou não a participar do estudo.
Após leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – (TCLE – Apêndice II) a paciente era entrevistada quanto aos seus dados demográficos, hábitos alimentares e de atividade física (Questionário – Apêndice III), e também eram obtidos os seus dados antropométricos: peso, altura, circunferência abdominal (prega umbilical). O índice de massa corpórea (IMC), foi calculado utilizando-se a fórmula peso (kg)
/ estatura (m)2, que foi categorizado segundo a classificação da OMS (2009), IMC normal de 18,5-24,99 kg/m2, sobrepeso de 25,0-29,9kg/m2 e obesidade ≥ 30 kg/m2. A aferição da circunferência abdominal (CA) foi realizada na altura da prega umbilical e o ponto de corte para CA normal (≤ 88 cm) foi estabelecido de acordo com Jansen et al., 2004.
3.3.1 Critérios de seleção
A- Inclusão
Para o grupo de pacientes com sobrepeso/obesidade: presença de câncer de mama, IMC ≥ 25 kg/m2 (sobrepeso) ou ≥ 30 kg/m2
(obesidade) e /ou presença de gordura abdominal (CA > 88 cm) eaceite em participar do estudo proposto.
Para o grupo de pacientes não-obesas: presença de câncer de mama, ausência de gordura abdominal, IMC ≤ 24.9 kg/m2
(CA ≤ 88 cm), ausência de perda de peso acentuado e aceite em participar do estudo proposto.
B- Exclusão
Não foram incluídas no estudo pacientes com IMC abaixo do normal, tratamento quimioterápico e/ou radioterápico prévio, presença de outro tipo de câncer associado, sinais clínicos e/ou relato de infecções ou inflamações agudas ou crônicas, relato de doença auto-imune, relato de doenças pulmonares crônicas, recusa em participar do estudo proposto e reposição hormonal.
3.3.2 Constituição inicial dos grupos
O grupo de pacientes com sobrepeso/obesidade (SP/O) foi composto por pacientes com IMC ≥ 25 kg/m2
e CA > 88 cm e alguns casos de pacientes com somente uma das duas medidas elevadas. Já o grupo de pacientes não
obesas (NO) foi composto exclusivamente por pacientes com IMC ≤ 24,9 kg/m2
e CA ≤ 88 cm (esquema 4).
Esquema 4: Constituição inicial dos grupos de estudo: NO (não obesas) e SP/O
(sobrepeso-obesidade).
3.4 Coleta de sangue
No dia da cirurgia, as pacientes em jejum prévio de 12 horas, foram submetidas à coleta de duas amostras de 8 mL de sangue (em tubos Vacuette® com gel separador e ativador de coágulo). Após 30 minutos à temperatura ambiente, para retração do coágulo, o sangue foi centrifugado por 10 minutos, a 2.500 r.p.m. (centrífuga Beckman-GPR, Indianápolis, IN, EUA) a 25°C. O soro foi distribuído em alíquotas de 500 µL em microtubos tipo
eppendorf. Uma das alíquotas era encaminhada imediatamente para análise
bioquímica e as demais armazenadas a -80ºC até o momento das demais análises.
3.5 Quantificação das concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicerídeos e glicose.
As concentrações séricas de colesterol total (Col-T) e frações (LDL-Col, HDL-Col), triglicerídeos (TG) e glicose, foram determinadas por métodos enzimático-colorimétricos no mesmo dia em que as amostras foram coletadas, imediatamente após sua centrifugação, em sistema de automação (Boehringer Mannhein Hitachi 917-Roche-Basileia, Suíça) utilizando reagentes comerciais da Roche (Mannhein, Alemanha) e expressos em mg/dL. Estas análises são rotineiramente realizadas na Seção de Bioquímica da DPC do HC/UNICAMP. Para o perfil lipídico foram adotados os valores de referência que seguem as recomendações da V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da
Aterosclerose (2013) e para a glicose, as Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes (2009). Valores de referência adotados: Col-T< 200 mg/dL, LDL-Col< 160 mg/dL, HDL-Col ≥ 50 mg/dL (para mulheres), TG< 150 mg/dL, Gli< 100 mg/dL.
3.6 Caracterização da síndrome metabólica (SM) entre as pacientes em estudo.
Os resultados das análises bioquímicas foram utilizados para estimar a frequência de pacientes com Síndrome Metabólica (SM), que, no presente trabalho, foi definida a partir da presença de três ou quatro dos seguintes critérios:
Quadro 1: Critérios para identificação de Síndrome Metabólica nas pacientes
Critérios Definição
Circunferência abdominal 88 cm Glicemia de jejum# ≥ 100 mg/dL
Triglicérides ≥ 150 mg/dL HDL-colesterol < 50 mg/dL
Adaptado de: National Cholesterol Education Program Adult Treatment
Panel III e #International Diabetes Federation. Worldwide definition of the
metabolic syndrome .Circulation. 2005; 112: 2735–52.
O parâmetro hipertensão arterial não foi considerado no presente trabalho, pela impossibilidade de diagnóstico clínico fidedigno, visto que as pacientes incluidas no estudo tiveram apenas um contato com o pesquisador, na véspera do procedimento cirúrgico. Além disso, a maioria das pacientes era encaminhada de outros serviços e a totalidade não apresentava registro de diagnóstico de hipertensão arterial em seus prontuários.
3.7 Quantificações das concentrações séricas de SAA
As concentrações de SAA foram determinadas nas amostras de soro, por meio do kit comercial SAA Látex N (SIEMENS, Marburg, Alemanha), de alta sensibilidade (0,82 mg/L). As reações de micro-aglutinação em látex foram
realizadas de acordo com as recomendações do fabricante e detectadas por nefelometria (BN Prospec, SIEMENS, Munique, Alemanha).
O método é inteiramente automatizado; partículas de poliestireno revestidas com um anticorpo monoclonal específico para SAA humana, ao serem misturadas com as amostras de soro, agregam-se com estas proteínas formando micro-aglutinados. Esses agregados dispersam luz quando irradiados. A intensidade desta dispersão é dependente das concentrações das respectivas proteínas na amostra e a quantificação das concentrações séricas é automaticamente realizada a partir de uma curva padrão, determinada a cada ensaio. A curva padrão é realizada a partir de 7 diluições seriadas do padrão SY SAA N, calibrado pelo padrão internacional da proteína SAA sérica - lote nº 92/680. Além disso, um controle interno (SY SAA), com concentração conhecida, é aferido em cada corrida. Os coeficientes de variação intra e interensaio foram menores do que 2% e 5%, respectivamente. Os ensaios foram realizados exclusivamente para esta pesquisa, na Seção de Imunologia da Divisão de Patologia Clínica (DPC) do HC/UNICAMP.
3.8 Quantificações das concentrações séricas de APN
As concentrações de adiponectina foram determinadas nas amostras de soro, por meio do kit comercial de Imunoensaio Multiplex da marca Millipore (Billerica, MA, EUA) Catálogo # HADK1MAG-61K (adiponectina) - Lote: 103203. A sensibilidade do kit para cada analito foi de 21pg/mL.
A tecnologia xMAP (MAP=MultipleAnalyteProfiling, x= sua variável ex: citocinas, endócrino, oligo), envolve um processo exclusivo que cora microesferas magnéticas com dois fluoróforos. Utilizando proporções precisas de dois fluoróforos, podem ser criados 100 conjuntos diferentes de microesferas – cada uma delas com uma assinatura baseada em “código de cores” e que podem ser identificadas pelo instrumento MagPix™.
Anticorpos de captura específicos para o analito (adiponectina) estão imobilizados nas microesferas através de ligações covalentes não reversíveis. Após a incubação dos padrões e das amostras de soro diluídas com as microesferas, o analito se liga aos anticorpos de captura localizados na superfície das respectivas microesferas. Após ser feito o procedimento de
lavagem automatizada, para a retirada do excedente que não se ligou aos anticorpos específicos, é feita a incubação com anticorpos de detecção biotinilados. Outra lavagem é realizada, para eliminação do que não se ligou e é feita uma incubação com o conjugado estreptavidina-ficoeritrina, que se liga ao anticorpo biotinilado e emite sinal fluorescente. O resultado final é um ensaio “sanduíche” realizado com microesferas, que é lido pelo equipamento MagPix (Softwarex Ponent/Analyst versão 4.2.), onde as micoresferas são capturadas por uma placa magnética e a classificação é feita por 2 lasers, o primeiro detecta (classifica) a microesfera (o código de cor para o ensaio) e o segundo quantifica o sinal de fluorescência em cada microesfera.
O ensaio foi considerado válido quando os controles de qualidade estavam dentro da faixa esperada (Controle baixo: 21,9-45,6 pg/mL; Controle alto: 126,8-263,5 pg/mL). Os coeficientes de variação intra e interensaio foram menores do que 1%.
3.9 Coletas das informações clínico-patológicas
As informações clínico-patológicas das pacientes foram coletadas dos prontuários médicos, com o auxílio da Profa Dra Maria Salete da Costa Gurgel, do Departamento de Tocoginecologia – CAISM-FCM-UNICAMP, aproximadamente 60 dias após a cirurgia mamária. Estas incluíram o estadiamento clínico-patológico (ECP) da doença, bem como os resultados do exame anátomo-patológico e o status dos receptores RE, RP e HER2. O ECP foi determinado de acordo com o sistema TNM: T- extensão do tumor primário, N- ausência ou presença e a extensão de metástases em linfonodos regionais, M- ausência ou presença de metástase à distância (INCA, 2004).
As características anatomopatológicas dos tumores foram determinadas a partir de amostras do tecido tumoral provenientes de peças cirúrgicas obtidas por mastectomia ou quadrantectomia. Após análise macroscópica, os fragmentos tumorais foram fixados em formalina, incluídos em parafina e seccionados. Os cortes histológicos foram corados por hematoxilina e eosina, para determinação do tipo histológico do tumor, bem como de seus graus de diferenciação histológica e nuclear. Estes últimos são classificados de acordo
