Avaliação de adesão microbiana em superfície de aço inoxidável e

O Quadro 8 mostra a relação entre as avaliações de processo de adesão de esporos de Bacillus sporothermodurans pelos processos de contagem em placas e a técnica de bioluminescência, em superfícies de aço inoxidável e de polietileno de baixa densidade (PEBD).

Quadro 8 - Logaritmo decimal (log10) de Unidades Relativas de Luz (URL) para ATP total e UFC/mL em superfícies de aç o inoxidável e polietileno aderidos com esporos de Bacillus sporothermodurans .

Superfície UFC/mL na suspensão

UFC/cm2 log10 UFC/cm2 URL log10 URL

Aço inoxidável 1,0X104 3,57X102 2,55 71 1,85 1,0X106 2,42X104 4,38 119 2,08 Polietileno 1,0X104 1,74X103 3,24 76 1,88 1,0X106 9,87X104 4,99 88 1,94

Constata-se que de acordo com a técnica da bioluminescência pode-se considerar que as superfícies estão em condições higiênicas satisfatórias. Todos os resultados encontram-se abaixo de 150 URL (log10<2,18). Por outro lado, avaliadas pela contagem padrão em placas as superfícies são classificadas como inadequadas para processamento de alimentos. Para o aço inoxidável, os logaritmos das contagens de esporos situaram entre 4,38 e 2,55 quando a adesão foi provocada utilizando-se suspensões de esporos cujos logarítmos da população (UFC/mL) eram de 6 e 4, respectivamente. Para o PEBD, nas mesmas condições de número nas suspensões os valores foram de 4,99 e 3,24, respectivamente. Considerando que APHA (1992) sugere que uma superfície está higienizada se apresentar até 2 UFC/cm2 (log10 de 0,3) e que outras instituições como a OMS e OPAS sugerem até 5,0x101 UFC/cm2 (log10 de 1,7). Assim, os resultados indicam superfícies inadequadas para processamento de alimentos.

Nas condições deste experimento, a técnica da bioluminescência não é apropriada para avaliar a presença de esporos de B. sporothermodurans em ambas superfícies. Estes resultados são compatíveis com várias pesquisas disponíveis na literatura. Uma delas que avaliou sistemas de bioluminescência, trabalhou com culturas puras de Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus casei para a avaliação destes sistemas. Verificou-se que usando concentrações crescentes das culturas não houve correlação entre o aumento de UFC/mL e URL (ODEBRECHT et al,. 2000).

Uma provável explicação para os resultados encontrados neste experimento seria que os esporos bacterianos não apresentam metabolismo, níveis de ATP ou transporte de elétrons detectáveis, não tendo energia suficiente para realizar a formação de luz. Assim, quando expostos ao complexo enzimático luciferina/luciferase produziriam menos bioluminescência quando comparados às células vegetativas (BAKER et al., 1992).

Em relação à quantidade de esporos aderidos, constata-se que ocorreu maior adesão em polietileno comparado ao aço inoxidável. A adesão microbiana em superfícies está associada a diversos fatores, que interrelacionados determinam a quantidade de microrganismos aderidos

(ZOTTOLA, 1997). Dentre eles, incluem -se a carga elétrica e a hidrofobicidade, que poderiam estar influenciando esta maior adesão de PEBD. Também, os processos de adesão podem ter influenciado na quantidade de esporos aderidos: os cupons de aço inoxidável eram imersos na suspensão de esporos e para o PEBD o processo era o inverso. Neste caso, a suspensão era adicionada à embalagem de PEBD.

Os resultados demonstram que os esporos de B. sporothermodurans têm a capacidade de aderir às superfícies avaliadas e esta adesão é afetada pelo número inicial de esporos na suspensão. Para o aço inoxidável, a adesão foi de 2,42% e 3,57% para os logaritmos dos números iniciais na suspensão de esporos de 4 e 6, e para o PEBD os valores foram de foi 9,9% e 17,4%, respectivamente. O número de esporos aderidos aumentou com o aumento da sua concentração na suspensão. Uma outra pesquisa usando o mesmo esporo e superfície, nos tempos de adesão de 12 horas e temperatura de 37ºC, mostrou porcentagens de adesão de 0,88 %, quando o log10 do número de esporos na suspensão era de 4,61 e 4,66% para log10 do número inicial de esporos igual 5,56 (CABRAL, 2001). A diferença entre as pesquisas, em relação ao número de esporos aderidos, deve-se, provavelmente aos diferentes tempos de adesão, de 12 e 24 horas, e ás temperaturas de adesão, 18 e 37°C, usadas nos experimentos.

Pesquisa com cupons de aço inoxidável em formatos de cotovelo 90°, cilíndrico e T incubados com uma suspensão de aproximadamente 105 esporos/mL mostrou que os esporos de B. sporothermodurans possuem capacidade de se aderirem ao aço inoxidável. O log10 do número de esporos que permaneceram aderidos por cm2 foram, respectivamente 4,01, 3,88 e 4,03 (AKUTSU, 2001). E seus valores em porcentagem correspondentes foram 3,93, 2,55 e 4,46%. O Quadro 9 mostra que a determinação das URL é afetada pelas condições de adesão da E. coli. Assim, constatou-se que a suspensão microbiana centrifugada associada ao tempo de repicagem do microrganismo interferiu na avaliação pela técnica da bioluminescência e também na quantidade de células aderidas. Determinaram -se valores de 113 URL para ATP total e 5,9x102 UFC/cm2 de células aderidas ao aço inoxidável, quando a suspensão foi centrifugada e o tempo de 24 horas de repicagem. Sem a

centrifugação e com 12 horas de repicagem, os valores foram de 2397 URL e 1,05x104 UFC/cm2.

Quadro 9 - Logarítmo decimal (log10) de Unidades Relativas de Luz (URL) para ATP total, livre e microbiano e UFC/cm2 presente em superfícies de aço inoxidável aderidos com suspensão de Escherichia coli K12.

Condições de adesã o Tipo de ATP UFC/cm2 log10 URL log10

Centrifugada, intervalo de repicagem 24 horas, tempo de adesão de 24 horas.

Total 5,92X102 2,77 113 2,05

Total 1,05X104 4,02 2397 3,38

Livre - - 892 2,95

Não centrifugada, intervalo de repicagem de 12 horas, tempo de

adesão de 24 horas. Microbiano - - 1500 3,18

A literatura subsidia possíveis explicações para este resultado. CROMBRUGGE e WAES (1991a) mostraram que ocorre uma diminuição na quantidade de ATP durante o crescimento celular, havendo baixo conteúdo na fase estacionária, em relação às outras etapas. Mudanças na taxa metabólica afetarão o nível de ATP, e, consequentemente, situações subótimas e de estresse podem alterar o conteúdo de ATP. Além disso, as diferentes formas de extração incluindo a filtração, e também a centrifugação que são utilizadas levam a situação de estresse e consequentemente a queda de ATP. Neste experimento é provável que com repicagem de 12 horas as células que entraram em contato com a superfície estavam na fase logarítmica no início do processo de adesão. Este fato, associado com a presença de nutrientes, aumenta o número de células na superfície após 24 horas, que pode ser observado pelos resultados do ATP microbiano–1500 URL.

Neste caso, a quantidade de ATP microbiano foi cerca de 13 vezes maior que o ATP total para células centrifugadas e com repicagens de 24 horas (Quadro 9). Também, deve-se mencionar que na suspensão não centrifugada a quantidade de ATP não microbiano, em função da presença do meio de cultura, com certeza, é maior, afetando a quantidade de ATP total.

Nesta pesquisa, os resultados mostraram que para as células centrifugadas, a quantidade de ATP total determinada pela técnica da bioluminescência –113 URL– sugere que a superfície está em condições higiênicas adequadas. Já a técnica de contagem em placas revela condições higiênicas insatisfatórias – log10 do número de células aderidas por cm2 igual a 2,77. Para as células não centrifugadas, os métodos apresentam respostas semelhantes para o ATP total. Ambos sugerem que a superfície está em condições higiênicas insatisfatórias: 2400 URL e log10 do número de células aderidas por cm2 igual a 4,02. Conclui-se, assim, que a interpretação dos resultados da técnica da bioluminescência para avaliar a adesão microbiana tem que considerar dentre outros fatores as diferentes condições experimentais e a população microbiana.

A maior adesão para as células não centrifugadas, provavelmente, deve-se ao fato de que nutrientes do meio de cultura auxiliam o processo de adesão e facilitam o crescimento microbiano, com provável produção

de exopolissacarídeos, após o período de 24 horas, partindo de uma cultura com 12 horas de repicagem.

As porcentagens de adesão das células de E. coli K12 foram de 0,0012% e 0,068% para células centrifugadas e não centrifugadas, respectivamente. Comparando-se esses resultados com células de

Listeria inoccua L6a e Staphylococcus aureus ATCC 6538, nas quais a

adesão em aço inoxidável foi de 2,0X101 e 5,0X101 para tempo 0 e 5,0X104 e 1,0X105 após 12 horas respectivamente (PARIZZI, 1999).

Células de S. aureus e de E. coli apresentaram a capacidade de aderir em PEBD a diferentes temperaturas de adesão e com diferentes números iniciais de células (SILVA, 2000). Os percentuais de adesão para

S. aureus variaram de 0,009% a 0,106% a 8°C e de 0,036 a 0,107% a 18°C.

Para E. coli, os valores percentuais de adesão variaram de 0,001 a 0,006% a 8°C e de 0,002 a 0,028 a 18°C.

Já, a adesão de Listeria monocytogenes em vidro sob condições de imersão a 37°C após 48 horas foi de 1X105 UFC/cm2 (CHAE et al., 2000).

A adesão em aço inoxidável de Pseudomonas aeruginosa e

Enterococcus faecium foi de, respectivamente 5,83% e 2,21%, após 12

horas e 18oC (FIGUEIREDO et al., 1999), a maior adesão de Pseudomonas

aeruginosa, pode ser explicada pela maior produção de

exopolissacarídeo, que possui papel importante na adesão dos microrganismos às superfícies (ZOTTOLA, 1997).

4.4. Avaliação do procedimento de higienização em linha de leite pasteurizado pelas técnicas da bioluminescência e contagem de aeróbios mesófilos.

As análises de variâncias, apresentadas nos Quadros 10 e 11, mostram que a quantidade de ATP total expressa em log10 de URL, e o número de mesófilos aeróbios, expresso em log10 de UFC/cm2 respectivamente, apresentaram diferenças significativas (p<0,01), entre as diferentes superfícies de equipamentos e utensílios de uma linha de pasteurização de leite e, também, quando estes parâmetros foram avaliados antes e após o

procedimento de higienização. Por outro lado, não houve interação significativa dos fatores superfície e higienização.

Quadro 10 - Análise de variância dos logaritmos decimais (log10) de Unidades Relativas de Luz (URL) para ATP total em diferentes superfícies de uma linha de pasteurização de leite, antes e após o procedimento de higienização. FV GL QUADRADO MÉDIO Superfície 5 0,9077* Higienização 1 3,1569** Sup x Higienização 5 0,2690 ns Resíduo 24 0,3380

** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste F * Significativo a 5% de probabilidade pelo teste F ns não significativo

Quadro 11 - Análise de variância dos logaritmos decimais (log10) de contagem de mesófilos aeróbios, expressa em UFC/cm2, em diferentes superfícies de uma linha de pasteurização de leite, antes e após o procedim ento de higienização.

FV GL QUADRADO MÉDIO

Superfície 5 2,6787**

Higienização 1 37,7626**

Sup x Higienização 5 0,7096 ns

Resíduo 24 0,4653

** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste F ns não significativo

As superfícies de tanque de resfriamento leite cru (TRC) apresentou uma maior quantidade de ATP do que tanque de equilíbrio do pasteurizador (TEP), com log10 de URL respectivamente, 4,28 e, 3,26, quando analisado pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05) (Quadro12). Não houve diferença entre a quantidade de ATP total encontrada nas superfícies do

TRC, da desnatadeira (DES), do tanque de armazenamento leite pasteurizado (TLP), do caminhão tanque (CAT) e tanque empacotamento de leite pasteurizado (TEL). Também, não houve diferença significativa (p≥0,05) entre a quantidade de ATP total encontrado nas superfícies do TEP, do TEL, do CAT, do TLP e da DES.

Quadro12 - Médias dos logaritmos decimais (log10) de Unidades Relativas Luz .(URL) para ATP total em diferentes superfícies de uma linha de .pasteurização de leite, antes e após o procedimento de .higienização.

Superfícies Médias

Tanque de resfriamento de leite cru 4,28a

Desnatadeira 4,03a b

Tanque de leite pasteurizado 3,66a b

Caminhão tanque 3,55a b

Tanque de empacotamento de leite 3,40a b

Tanque de equilíbrio do pasteurizador 3,26 b

* Médias, com mesma letra, não diferem entre si, ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste

de Tukey.

Em relação às análises microbiológicas, constatou-se que as superfícies de DES e TRC apresentaram as maiores contagens de mesófilos aeróbios – log10 de 2,91 e 2,85, respectivamente. Estas superfícies apresentaram diferença significativa ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05), pelo teste de Tukey no número de microrganismos quando comparadas às superfícies de TLP e CAT, cujos log10 foram, respectivamente, 1,47 e 1,39 (Quadro 13).

Não houve diferença significativa (p≥0,05) entre a contagem de mesófilos aeróbios nas superfícies da DES, do TRC, do TEP e do TEL. Por outro lado, não houve diferença significativa (p≥0,05) entre a contagem de mesófilos aeróbios nas superfícies do CAT, TLP, TEL e TEP.

Quadro 13 - Médias dos logaritmos decimais da contagem de mesófilos aeróbios, expressa em UFC/cm2, em diferentes superfícies de uma linha de pasteurização de leite, antes e após o procedimento de higienização.

Superfícies Médias

Desnatadeira 2,91a

Tanque de resfriamento de leite cru 2,85 a

Tanque de equilíbrio do pasteurizador 1,92ab

Tanque de empacotamento de leite 1,78ab

Tanque de leite pasteurizado 1,47 b

Caminhão tanque 1,39 b

* Médias, com mesma letra, não diferem entre si, ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey.

Os resultados mostram que para ambas as técnicas de avaliação do procedimento de higienização as superfícies da DES e do TRC foram aquelas que se apresentavam em piores condições higiênicas. No entanto, não há uma concordância entre as duas técnicas na classificação das condições higiênicas das demais superfícies. Os resultados sugerem, assim, não haver uma relação direta entre URL e UFC/cm2. Portanto, a técnica de ATP-bioluminescência apenas pode ser usada como indicadora das condições higiênicas associadas às quantidades de matéria orgânica na superfícies. Ou seja, se o procedimento de higienização foi efetuado corretamente ou não. Esta informação é importante, pois a presença de resíduo nas superfícies podem originar processos de adesão microbiana e formação de biofilmes (ZOTTOLA, 1997).

No experimento, o número de microrganismos aderidos indica uma adesão bacteriana, atingindo cerca de 104 UFC/cm2 e não formação de biofilmes.

A não relação entre as duas técnicas também foi constatada numa pesquisa com três sistemas comerciais de bioluminescência que foram utilizados em diversas etapas de sanificação de superfícies no sistema CIP,

numa cervejaria (ODEBRECHT et al., 2000). Além disso, estes pesquisadores verificaram que o aumento constante de unidades relativas de luz (URL) não acompanhou o aumento de contaminação microbiana.

Os resultados mostram que tanto a concentração de ATP total e a contagem de mesófilos aeróbios foram diferentes (p<0,05) quando se comparou antes e após o procedimento de higienização, considerando todas as superfícies avaliadas. Para a contagem microbiana, encontrou-se o log10 de 3,08, correspondentes a 1,20 X103 UFC/cm2, antes da higienização e o log10 de 1,03, correspondentes a 1,10x101UFC/cm2, após a higienização (Quadro12). Verifica-se, portanto, que o procedimento de higienização reduziu, em média, a contagem de mesófilos de aeróbios em 99,1%. Para a concentração de ATP total, encontraram-se os valores de log10 de URL de 3,99, correspondentes a 9772 URL, antes da higienização e de log10 de URL de 3,40, corresponde a 2511 URL.

Os resultados evidenciam, ainda, que o número médio de mesófilos aeróbios nas superfícies encontra-se acima das recomendações da APHA (1992) - 2UFC/cm2- mas atendem as recomendações de outros órgãos como a OMS e a OPAS - 50 UFC/cm2. Pode-se, assim, concluir que as superfícies após a higienização estavam em condições higiênicas adequadas se for usada uma especificação menos rígida do que aquela proposta pela APHA. No entanto, as superfícies estavam em condições higiênicas insatisfatórias, quando avaliadas pela técnica do APT total, que determinou a concentração de 2511 URL, muito acima de 150 URL, recomendando (BIOTRACE, 2000).

Durante o experimento, constatou-se uma grande variação nas medidas de URL e também que o controle apresentava leituras diferentes. Embora, não tenha sido feito nenhuma análise estatística, acredita-se que estes fatos podem afetar a avaliação das condições higiênicas das superfícies. De forma semelhante, ODEBRECHT et al. (2000) observaram também que alguns kits já continham bioluminescência antes mesmo de sua aplicação em superfícies, e sugeriu que isto poderia interferir na análise dos resultados, aumentando o valor de URL.

Uma outra maneira de se avaliar as técnicas de contagem de mesófilos aeróbios e a de bioluminescência é pela porcentagem de superfícies higienizadas que atendem as recomendações da APHA, da OMS em relação à

contagem de mesófilos aeróbios e que atendem à recomendação da técnica de ATP-bioluminescência.

Verifica-se pelo Quadro 14, que a técnica da bioluminescência, considerou 100% das superfícies em condições higiênicas insatisfatórias, quanto ao procedimento de higienização. A contagem microbiana detectou 50% de superfícies em condições higiênicas insatisfatórias, considerando a recomendação da APHA e 28% a recomendação da OMS.

Quadro 14 - Porcentagem de superfícies considerada não higienizadas por diferentes recomendações.

Recomendação Porcentagem

APHA até 2 UFC/cm2* 50

OMS até 50 UFC/cm2* 28

ATP Total até 150 URL* 100

* Valores para superfícies consideradas em condições higiênicas satisfatórias

** Valores para superfícies consideradas em situação de alerta para as condições higiênicas.

*** Valores para superfícies consideradas em condições higiênicas insatisfatórias.

Novamente, estes resultados suportam a hipótese de que a técnica de ATP-bioluminescência apresenta resultados diferentes dos métodos de contagem bacteriana, sugerindo a influência de resíduos, oriundos da má higienização, na medida da quantidade de ATP total nas superfícies.

Resultados de uma pesquisa que avaliou quatro plantas de processamento de leite com problemas de vida-de-prateleira deste produto, utilizando a técnica de ATP-bioluminescência e a técnica de contagem padrão total, para 86 locais na linha de pasteurização confirmam a não consistência entre as avaliações feitas pelas duas técnicas (MURPHY et al. 1998). A técnica de ATP-bioluminescência considerou como em condições higiênicas satisfatórias (< 100 URL) 31 superfícies avaliadas, que corresponde 36%.

No entanto, em 65% dessas superfícies foram encontrados microrganismos contaminantes pela técnica de contagem padrão. Este resultado sugere que o método convencional é mais sensível que o de ATP

quando o ATP total é inferior a 100 URL. Nas 11 superfícies (12,8%) consideradas suspeitas pela técnica do ATP-bioluminescência (100 a 149 URL) foram detectados microrganismos contaminantes em 91%, e para as 44 superfícies (51,2%) considerados não higienizados (>150 URL), foram detectados microrganismos contaminantes em 78% dos locais pela técnica de contagem padrão e em 22% dos locais não foram detectados microrganismos. Este resultado sugere que a técnica de ATP bioluminescência detecta ATP não microbiano presente em resíduos de filme de leite.