Avaliação do crescimento de Byssochlamys fulva e Neosartorya fischer

A avaliação do crescimento dos fungos B. fulva e N. fischeri foi realizada utilizando os métodos de medida do crescimento radial e quantificação de ergosterol nas colônias que cresceram na superfície do suco de maçã solidificado. Foram analisados os crescimentos em diferentes temperaturas de incubação (10, 15, 20, 25 e 30 ºC).

As análises foram realizadas em duplicata, em placas de Petri de 150x15 mm preenchidas com suco de maçã e ágar com diferentes teores de sólidos solúveis (12, 20, 25, 35, 45, 55 e 70 ºBrix) e, respectivamente, diferentes atividades de água (0,99; 0,98; 0,97; 0,95; 0,93, 0,88 e 0,75), tratadas térmicamente a 115 ºC/1 minuto (MIORELLI, 2009). As placas contendo o suco solidificado foram individualmente inoculadas em câmara de fluxo laminar depositando-se uma alçada da suspensão de microrganismos, preparada conforme descrito no item 3.1, no centro de cada placa. Posteriormente, as placas foram incubadas a 10, 15, 20, 25 e 30 ºC, durante 3 meses ou até que o crescimento do fungo atingisse toda a placa. As placas foram fechadas e sua borda foi recoberta com filme de PVC transparente, para minimizar a perda de água e evitar contaminação do material.

A Figura 3.1 apresenta o fluxograma da metodologia de preparo do meio de crescimento e avaliação do crescimento de B. fulva e N. fischeri em suco de maçã solidificado

Figura 3.1 Fluxograma da metodologia de preparo o meio de crescimento e avaliação do crescimento de B. fulva e N. fischeri em suco de maçã solidificado.

Suco de maçã (70 ºBrix)

Ajuste dos sólidos solúveis (12, 20, 25, 35, 45, 55 e

70 ºBrix)

Tratamento térmico (115 ºC / 1 min)

Inoculação B. fulva e N. fischeri (depositar uma alçada de microrganismo no centro da placa)

Incubação a 10, 15, 20, 25 e 30o_C

Medida do diâmetro da colônia (diariamente) Determinação da atividade de água (0,99; 0,98; 0,97; 0,95; 0,93, 0,88 e 0,75) Ágar

A escolha da concentração de sólidos solúveis utilizadas neste trabalho foi baseada no fato dos sucos de maçã normalmente serem comercializados nas concentrações próximas a 12 ºBrix, a 20 ºC, de acordo com o MAPA, 45 ºBrix, para suco concentrado congelado (clarificado ou não) e 70 ºBrix, para suco concentrado de alto teor de sólidos solúveis. As demais concentrações (20, 25, 35 e 55 ºBrix) foram escolhidas por estarem entre as três principais concentrações.

As culturas foram consideradas sem crescimento quando as alterações visíveis para o inóculo não ocorreram depois de 90 dias.

3.4.1 Medida do Diâmetro da Colônia

Os dados foram a média de medições em oito colônias, em 4 posições diferentes, para cada placa resultando em valores médios dos diâmetros lidos em um mesmo instante. Os cálculos foram baseados nos diâmetros médios calculados a partir de todas as quatro medidas do diâmetro lidas em um determinado ponto. A mudança do tamanho do diâmetro foi considerada a expressão do crescimento do fungo. Desta forma, foram geradas as curvas de crescimento expressas pela variação do diâmetro da colônia (mm) em função do tempo (h).

Para permitir melhor monitoramento do diâmetro da colônia de fungos, previamente à inoculação, as placas foram marcadas com traços perpendiculares em sua base, como é ilustrado na Figura 3.2.

Figura 3.2 Placa com marcação em sua base para monitoramento do crescimento do diâmetro da colônia.

Segundo Gibson et al. (1994) o diâmetro mínimo das colônias deve ser considerado no tempo em que estas atingirem 3 mm, sendo este o tamanho mínimo possível de ser observado a olho nu e necessário para o produto ser rejeitado pelo consumidor.

Foi realizado um plaqueamento de controle do suco de maçã e ágar, sem inoculação dos fungos estudados, na concentração de 12 ºBrix e incubado a cada temperatura testada para verificação se o meio estava livre de microrganismos.

3.4.2 Avaliação da Cinética de Produção de Ergosterol na Biomassa Fúngica e Comparação com o Método de Medida Radial de Crescimento

Para determinação do teor de ergosterol, as colônias (mais o suco de maçã solidificado) de B. fulva e N. fischeri foram retiradas inteiras quando as colônias atingiram os tamanhos de aproximadamente 30, 60, 90, 120 e 150 mm ao longo do tempo de incubação, depois se procedeu a extração para quantificação de ergosterol. Os experimentos para extração de ergosterol foram realizados nas condições de crescimento do fungo na concentração de sólidos solúveis de 12 °Brix e temperaturas de 10, 15, 20, 25 e 30 °C.

Para extração do ergosterol das amostras (colônia de fungo contendo suco de maçã solidificado) foi aplicado o método de Gourama e Bullerman (1995) modificado. As colônias de fungo foram extraídas com 40 mL de KOH 10 % em metanol através de agitação magnética por 30 minutos. Alíquotas de 10 mL foram transferidas para tubos com tampa de rosca e colocados em um banho de água (55-60 °C) por 20 min. Os tubos foram, em seguida, resfriados em banho de gelo. Adicionou-se 3 mL de água e 2 mL de hexano aos tubos e agitou-se em Vortex por 1 min. Após a separação das camadas, a camada superior (hexano) foi transferida para um frasco com tampa. A extração com hexano foi repetida duas vezes com 2 mL de cada vez. O hexano foi evaporado através de fluxo de nitrogênio. Para quantificação do ergosterol, os extratos secos foram dissolvidos em 2 mL de metanol e filtrados em filtros de acetato com poro de 0,45 µm. As amostras foram injetadas em (HPLC) utilizando bomba Parkin Elmer Series 200, com detector UV visível Parkin Elmer Series 200, contendo coluna Brownlee Analytical C18 5 μm (4,6 x 250 mm) com poro de 100 Å. O comprimento de onda foi fixado em 282 nm (MARÍN et al., 2008). A fase móvel foi metanol a 1 mL/min e utilizou-se padrão de Ergosterol

Sigma® para curva de calibração em concentrações entre 0 e 10 mg/L (FREIRE, 2006). A Figura 3.3 apresenta o fluxograma com a metodologia para extração de ergosterol.

Figura 3.3 Fluxograma para extração de ergosterol em amostras de suco de maçã solidificado e fungo.

3.5 Modelagem matemática das curvas de crescimento de B. fulva e