Avaliação do efeito dos parabenos na bioenergética mitocondrial

3.3.2.1. Modelo animal e manuseamento geral

O modelo animal e manuseamento geral foi o descrito em 3.3.1.1.

3.3.2.2. Delineamento experimental

O delineamento experimental foi o descrito em 3.3.1.2. Quando os machos atingiram a maturidade sexual, 2 meses após o nascimento, aproximadamente, deu-se início ao seu sacrifício por deslocamento cervical e decapitação, sendo imediatamente exsanguentados.

3.3.2.3. Isolamento de mitocôndrias

O processo de isolamento mitocondrial foi o descrito em 3.2.2.

3.3.2.4. Quantificação da proteína

Para a quantificação da proteína foi utilizado o método descrito em 3.2.3.

3.3.2.5. Atividade respiratória mitocondrial

O consumo de oxigénio pelas mitocôndrias isoladas foi medido polarograficamente usando um elétrodo de oxigénio do tipo (Estabrook, 1967) numa câmara fechada, com capacidade de 1,0 mL, com agitação magnética, a 30 °C. As taxas de respiração foram calculadas assumindo uma concentração de oxigénio (O2) de 450 nAt O/mL no meio

reacional a 30 °C.

A 1 mL de meio de reação (130 Mm de sacarose, 50 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 5

mM de KH2PO4, e 5 mM de Hepes, pH 7,2) foram adicionadas mitocôndrias (0,5 mg de

proteína) e deixou-se incubar durante 2 minutos a 30 °C. Induziu-se, posteriormente, um maior consumo de O2 pelas mitocôndrias (estado respiratório 2) com a adição de 5 µL de

succinato (complexo II). Nos casos em que o substrato respiratório foi o succinato, adicionou- se também ao meio de reação um inibidor do complexo I – rotenona 1,5 mM (1 µL), deixando-se incubar durante 2 minutos. Uma quantidade adequada de ADP 100 nmol foi depois adicionada para estimular o estado 3 (Chance e Williams, 1956). Após o consumo de todo o ADP adicionado, a respiração retomou uma velocidade lenta, assumindo o estado respiratório designado por estado 4 (Chance e Williams, 1956). O estado 3 foi induzido pela adição de adenosina 5́-difosfato (ADP;100 nmol), e a respiração desacoplada, por adição de FCCP 1 mM.

O ICR (índice de controlo respiratório) foi determinado pelo quociente entre a velocidade respiratória na presença de ADP (estado 3) e a velocidade respiratória após o consumo de ADP (estado 4) (Chance e Williams, 1956).

3.3.2.6. Quantificação do potencial elétrico transmembranar da mitocôndria

O potencial elétrico de membrana foi medido no espetrofluorímetro através da variação da fluorescência da safranina O num Varian Cary Eclipse usando os comprimentos de onda de excitação e emissão de 495 e 586 nm, respetivamente. Foi realizada uma incubação durante 2 minutos em 3 mL de meio de reação (130 Mm de sacarose, 50 mM de KCl, 5 mM de MgCl2,

5 mM de KH2PO4, e 5 mM de Hepes, pH 7,2), 1 mg de proteína (mitocôndrias), 3 µL de

safranina O e 2 µL de rotenona 1,5 mM (o registo iniciou-se passados 60 segundos de incubação).

A medida do potencial de membrana foi iniciada com succinato 5mM, deixando-se decorrer 1 minuto, momento em que se adicionaram 100 nM de ADP. Decorridos 3 minutos adicionou-se um desacoplador, neste caso 1 µL de FCCP 1mM, obtendo-se um registo como o indicado na figura 3.4.

Figura 3.4:Registo típico do potencial elétrico transmembranar mitocondrial pelo método da safranina O, para o grupo controlo e para os grupos tratados com metil e butilparabeno. Metilparabeno 100 mg/Kg peso corporal/dia (M100), Metilparabeno 200 mg/Kg peso corporal/dia (M200), butilparabeno 100 mg/Kg peso corporal/dia (B100) e butil parabeno 200 mg/Kg peso corporal/dia (B200).

Os dados obtidos foram calibrados utilizando um gradiente de K+. Para este fim, a fluorescência da safranina O foi registada na presença de 2 nM de valinomicina e um gradual aumento da concentração de K+ (0,2-120 mM) o que permitiu o cálculo da diferença de potencial transmembranar (Δψ) através da equação de Nernst assumindo uma matriz com [K+] = 150 mM.

3.3.2.7. Quantificação do peróxido de hidrogénio

Para a quantificação do peróxido de hidrogénio produzido, incubaram-se as mitocôndrias, isoladas de fresco (0,5 mg/mL), em tampão fosfato (KH2PO4 5 mM, EGTA 0,1

mM, MgCl2 3 mM, KCl 145 mM, Hepes 30 mM, pH 7,4) a 30 °C. Este meio foi ainda

suplementado com rotenona (2 µM), succinato (10 mM), ácido homovanílico (100 µM) e peroxidase de rábano (3 U/mL).

Decorridos 15 minutos de incubação parou-se a reação pela adição de 500 µL de tampão glicina a 2 M (pH 12) contendo EDTA a 25 mM e transferiu-se a mistura reacional para um tudo de eppendorf que se colocou em gelo. Seguidamente centrifugou-se a amostra (5 min, 9000 x g) e transferiu-se o sobrenadante para uma célula de quartzo 3 mL. A fluorescência do sobrenadante foi lida a um comprimento de onda de excitação de 312 nm e

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0, 0 0, 4 0, 8 1, 2 1, 5 1, 9 2, 3 2, 7 3, 1 3, 5 3, 8 4, 2 4, 6 5, 0 5, 4 5, 8 6, 1 6, 5 6, 9 7, 3 7, 7 8, 1 8, 4 8, 8 In te n si da de da f luo re sc ên ci a (u. a .) Control M100 M200 B100 B200

de emissão de 420 nm. A concentração do peróxido de hidrogénio foi determinada com base numa curva padrão de peróxido de hidrogénio, preparado no momento.

3.3.2.8. Atividades enzimáticas dos complexos mitocondriais

3.3.2.8.1. Preparação das membranas mitocondriais

As mitocôndrias foram isoladas conforme descrito no item 3.2.2. e congeladas até ao momento da sua utilização. Estes organelos foram então submetidos a 5 ciclos de congelamento e descongelamento por forma a atingir-se a rotura completa das mitocôndrias. Os fragmentos membranares foram utilizados para a avaliação da atividade enzimática de alguns complexos da cadeia respiratória.

3.3.2.8.2. Atividade do complexo I

A atividade do complexo I ou nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) ubiquinona oxidorredutase foi determinada seguindo a oxidação de nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida, sal dissódico (NADH), a 340 nm (ε = 6,22x106 mol-1. cm-1), com agitação constante, a 30 °C num leitor de microplacas (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA), (Kiebish et al., 2008).O ensaio foi realizado num tampão contendo fosfato de potássio (50 mM, pH 7,4), 4 µL de KCN 2 mM, 10 µL de MgCl2 5 mM, 2,5 mg/mL de BSA, antimicina 2,5 mM e

decilubiquinona 0,1 mM. Ao meio adicionaram-se membranas mitocondriais (0,3-0,6 mg/mL) e a reação teve início com a adição de NADH 10 mM. A atividade enzimática foi medida durante 3 minutos e registada de 7 em 7 segundos após o início da reação.

Para o cálculo da atividade foi subtraído o declive obtido na presença de rotenona (2 uL a 1.5 mM), sendo o resultado final expresso em nmol NADH/min/mg proteína.

3.3.2.8.3. Atividade do complexo IV

A atividade do complexo IV, Citocromo c oxidase, foi medida espetrofotometricamente (Trounce et al., 1996) num leitor de microplacas (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) a 550 nm. Os ensaios enzimáticos foram realizados a 30 °C, em meio de reação padrão

contendo tampão Tris-HCl 10 mM, KCl 120 mM a pH 7.0, suplementado com 0,3-0,6 mg/mL de proteína. A reação foi iniciada pela adição de 20 µL de citocromo c reduzido 0,016 mM, e o declive da reação foi registado por 30 segundos na presença do inibidor do complexo IV (KCN 100 mM). O citocromo c foi previamente preparado pela redução de citocromo c com excesso de ditionito de sódio (Cassina e Radi, 1996). A atividade do complexo IV foi expressa em nmol de citocromo c oxidado.min-1.mg de proteína-1, utilizando-se o seu coeficiente de extinção molar com o valor de 19.103 mol-1..cm-1.

3.3.2.8.4. Atividade da citrato sintase

A atividade da citrato sintase foi determinada, seguindo o decréscimo da absorção de DTNB a 412 nm, usando um leitor de microplacas (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA), a 30o C (Srere, 1969; Bergmeier, 1970). O tampão de ensaio continha Tris-HCl 200 mM, pH 8,0, DTNB 1,01 mM, TritonX-100 (0,02%), oxaloacetato 1 mM e Acetil-CoA 0,37 mM. A reação foi iniciada pela adição de mitocôndrias rotas (0,3-0,6 mg / mL). Os resultados foram expressos em atividade da citrato sintase.min-1.mg de proteína-1.

3.3.3. Análise estatística

Os resultados são apresentados como média±SD de quatro ou mais experiências independentes. Os dados foram analisados utilizando o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). As comparações múltiplas foram realizadas utilizando one- way ANOVA. Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA student’s t-test e Newman- Keuls Multiple Comparison Test com um nível de significância de P <0,05.

3.4. EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA DOS PARABENOS (BUTIL E