Avaliação do efeito do IDR-1018 e IDR-1002 no tratamento de infecção pulmonar

Camundongos Black C57BL/6 infectados com K. pneumoniae KPC 1825971 com os peptídeos e tratados com IDR-1018 e IDR-1002, 3 h após a infecção não mostrou qualquer efeito na redução da carga bacteriana (Figura 19). Observamos que a concentração de bactérias nos pulmões de camundongos Black C57BL/6 tratados com dosagens mais altas do peptídeo IDR-1002 não diferiu significativamente do grupo de animais que recebeu uma menor dosagem desse peptídeo.

Figura 19. Efeito do peptídeo IDR-1018 e IDR-1002 em modelo murino de infecção. Camundongos C57/BL6

foram infectados com 30 L da suspensão de K. pneumoniae ATCC 13883 e tratados 3h após a infecção. Animais foram tratados com 30 L da suspensão bacteriana através da rota intransal.

5 DISCUSSÃO

Observamos que os isolados clínicos de K. pneumoniae foram resistentes a múltiplos

antibióticos, apresentaram genes blaKPC (Tabela 2) e formaram biofilmes mais densos em meio

BM2 quando comparado aos meios de cultura ricos em nutrientes (Tabela 3). Estudos prévios mostraram que bactérias que apresentam genes KPC são usualmente resistentes a múltiplos

antibióticos, incluindo os antibióticos β-lactâmicos carbapenêmicos, os quais são considerados

antibióticos de última geração, destinados a tratar infecções sérias causadas por bactérias Gram- negativas (HIRSCH; TAM, 2010). A maior formação de biofilmes em meios pobres em nutrientes quando comparados com meios ricos em nutrientes, poderia estar associado com o

estresse causado pela limitação de nutrientes. Redução na concentração de Fe+_{, por exemplo,}

tem mostrado promover a formação de biofilmes em Legionella pneumophila (HINDRÉ et al.,

2008) e a limitação de Mg2+ _{tem sido associada com o aumento da formação de biofilme em}

Pseudomonas aeruginosa (MULCAHY; LEWENZA, 2011).

Cepas bacterianas que produzem KPC representam um sério problema mundial, devido à resistência a múltiplos antibióticos, a fácil disseminação e a limitada disponibilidade de opções de tratamento (CHEN et al., 2014). Além disso, o potencial dessas cepas para formar biofilmes em equipamentos ou materiais médicos pode contribuir para piorar esse cenário. Muitos estudos têm mostrado que a formação de biofilmes contribui para o aumento de infecções persistentes (BJARNSHOLT, 2013). Entretanto somente poucas investigações tem focado no desenvolvimento de agentes antibiofilmes. Esses estudos são ainda mais limitados quando se trata de combater Enterobacteriáceas produtoras de KPC.

No presente trabalho investigamos se pequenos peptídeos catiônicos exibiam propriedades antibiofilmes contra isolados de K. pneumoniae produtores de KPC. Observamos que os peptídeos 1018, DJK-6 e DJK-5 preveniram a formação de biofilmes de diferentes isolados produtores de KPC (Tabela5). Em todos os casos, a concentração requerida para inibir a formação de biofilmes a 50% foi mais baixa do que a CIM. Peptídeos antibiofilmes, incluindo 1018, tem demonstrado efeito similar contra outras bactérias patogênicas (DE LA FUENTE- NÚÑEZ et al., 2012, 2014).

Em experimentos no qual avaliamos o efeito dos peptídeos sobre biofilmes pré-formados, observamos os peptídeos IDR-1018 e DJK-6, reduziram eficientemente biofilmes a uma monocamada de células ou poucas células fixadas a câmara de fluxo de células (Figura 6). Muitas das células remanescentes, coradas com amarelo ou vermelho, estavam mortas, indicando uma ação bactericida desses peptídeos. Essas descobertas são consistentes com

estudos recentes, os quais mostraram que os peptídeos IDR-1018 (DE LA FUENTE-NÚÑEZ et al., 2014) e DJK-6 (FUENTE-NÚÑEZ, et al., submetido para publicação) reduzem biofilmes de várias bactérias, incluindo K. pneumoniae. Entretanto em nossos estudos, usamos K.

pneumoniae resistente a carbapenens em vez de isolados susceptíveis a carbapenens, usados

naqueles estudos.

Surpreendentemente, o peptídeo DJK-6 foi capaz de aumentar a atividade

antimicrobiana de antibióticos β-lactâmicos tanto para inibir que células planctônicas

formassem biofilmes (Tabela 6), quanto para erradicar biofilmes pré-formados de isolados de

KP-KPC (Figura 7 e 8). Além disso, baixas concentrações de meropenem (0,0625 μg. mL-1_{) e}

de DJK-6 (0,125 μg. mL-1_{) foram requeridas para erradicar completamente biofilmes pré-}

formados de isolados de KPC (Figura 7 e 8). Esses resultados confirmam que pequenos peptídeos catiônicos podem ser considerados uma promessa para aumentar a potência de antibióticos convencionais contra células bacterianas em fases distintas (REFFUVEILLE et al., 2014). A capacidade de DJK-6 fazer isolados de KPC suscetíveis a carbapenens poderia ser uma abordagem potencial para tratar infeções sérias causadas por cepas resistentes a carbapenens. Estudos recentes mostraram que peptídeos derivados de LL-37 foram capazes de erradicar biofilmes existentes de S. aureus resistentes a meticilina em equivalentes de pele humana ferida termicamente (HAISMA et al., 2014). Tomados em conjunto, os resultados descritos aqui, indicam que a combinação de DJK-6 e meropenem poderia ser uma estratégia promissora para terapia tópica de infecções, uma vez que os mesmos erradicaram biofilmes em superfícies da câmara de fluxo celular.

Embora a combinação entre DJK-6 e meropenem (0,125 e 0,0625 μg.mL-1₎

respectivamente) foi capaz de eliminar biofilmes da câmara de fluxo celular (Figura 7), observamos que a o número de células viáveis dispersas dos mesmos foram similares ao controle não tratado e aos tratamentos não combinados (quando as mesmas concentrações de cada um dos compostos foram utilizadas), como observado na figura 9. Possivelmente,

biofilmes que não foram tratados ou tratados individualmente com 0,125 μg.mL-1 _{de DJK-6 ou}

0,0625 μg.mL-1 _{de meropenem, continuaram crescendo e naturalmente se dispersando, mas}

mantendo sua biomassa de biofilme na câmara de fluxo de células. Enquanto biofilmes que foram tratados, se dispersaram e sua biomassa foi completamente eliminada da câmara de fluxo. Estudos prévios mostraram que o peptídeo IDR-1018, à baixa concentração levou a dispersão de biofilmes de P. aeruginosa, enquanto altas doses desencadearam a morte celular (DE LA FUENTE-NÚÑEZ et al., 2014). Mais estudos são necessários para testar se concentrações mais altas da combinação entre DJK-6 e meropenem, poderia reduzir substancialmente a contagem

de células bacterianas, como observado entre a combinação entre o peptídeo IDR-1018 (8

μg.mL-1_{) e ciprofloxacina (0,04 μg. mL}-1_{) usada contra P. aeruginosa (REFFUVEILLE et al.,}

2014).

Apesar do efeito potente de DJK-6 e meropenem juntos, observados in vitro (Tabela 5, Figuras 7 e 8), essa combinação foi ineficiente em reduzir a carga de KP-KPC em pulmões de camundongos, os quais receberam uma única dose dos tratamentos (Figura 11). Compostos como β-lactâmicos, apresentam um padrão de ação antimicrobiana independente da concentração dependente do tempo, significando que, a taxa da extensão da morte do microrganismo mantém inalterada independente da concentração (REED, 2000). Assim, é

possível que mais doses de meropenem (que é um β-lactâmico) combinado com DJK-6, fossem

requeridas para melhor efetividade terapia antimicrobiana. Regimes otimizados de tratamento (considerando o intervalo do tempo de tratamento ou mesmo ajustes na concentração dos antimicrobianos) são necessários para explorar melhor os efeitos combinados de DJK-6 e meropenem in vivo. Esses estudos poderiam trazer importantes informações para estratégias antimicrobianas in vivo, que incluem o uso de peptídeos catiônicos.

Em nossos estudos também avaliamos a atividade antimicrobiana dos peptídeos HHC-10, IDR-1018 contra K. pneumoniae suscetível ou resistente a carbapenens. Interessantemente, os isolados resistentes a carbapenens (Tabela 1 e 7), também foram resistentes aos peptídeos HHC- 10 e IDR-1018 (Tabela 7), enquanto K. pneumoniae suscetível a carbapenem, foi também suscetível a HHC-10 e IDR-1018 (Tabela 7). Como os isolados de KP-KPC foi resistente a múltiplos antibióticos, é possível que os mesmos apresentem outros mecanismos de resistência a antibióticos, além daquele conferido pela enzima KPC. A resistência primária a peptídeos catiônicos poderia ser devido a alterações na membrana, que é um local frequentemente descrito como alvo desses compostos. Velkon et al. (2013) mostrou que a resistência de K. pneumoniae a colistina (um peptídeo antimicrobianos catiônico usado na prática clínica) é mediada por modificações que causam a diminuição da carga negativa na membrana dessa bactéria, reduzindo assim as interações entre membrana e polimixinas. Outros estudos são requeridos para compreender como isolados KP-KPC resistiram à ação de HHC-10 e IDR-1018 em relação a K. pneumoniae suscetível a carbapenens.

Quando combinados em um largo espectro de concentrações (0,78-100 μg.mL-1_{), HHC-10}

e IDR-1018, apresentaram um efeito indiferente. Possivelmente a propriedade catiônica inerente a esses dois peptídeos (ARNUSCH; PIETERS; BREUKINK, 2012; HURDLE et al., 2011), não adicionou qualquer efeito na redução do crescimento bacteriano. Muitos estudos têm mostrado sinergia entre agentes antimicrobianos que apresentam distintos alvos, como por

exemplo aminoglicosideos (inibição da síntese proteica) e β-lactâmicos (inibição da síntese da parede celular). Sinergia entres esses dois antibióticos tem sido atribuída a danos na membrana, mediados por β-lactâmicos e consequente interiorização de aminoglicosideos (KOHANSKI et al., 2008). Estudos prévios mostraram que o peptídeo IDR-1018 aumentou a ação antimicrobiana dos antibióticos ceftazidima (inibição da síntese da parede celular), imipinem (inibição da síntese da parede celular), tobramicina (inibição da síntese proteica) e ciprofloxacina (inibição do DNA girasse ou topoisomerase) contra diferentes bactérias, incluindo K. pneumoniae ATCC 13883 (REFFUVEILLE, F. et al, 2014). Esse peptídeo levou a reduzida expressão de genes envolvidos no mecanismo de ação desses antibióticos (REFFUVEILLE, F. et al, 2014). Considerando os resultados da combinação entre meropenem e DJK-6 e da combinação entre HHC-10 e IDR-1018, nossos resultados confirmam as observações de outros estudos, as quais indicam que o efeito de agentes antimicrobianos é aumentado quando compostos com mecanismos de ação distintos são combinados.

Em nossos estudos, observamos que a atividade hemolítica de HHC-10 e IDR-1018, a concentrações que inibiram o crescimento de K. pneumoniae ATCC 13883, se manteve baixa (< 5%). Pouco aumento da atividade hemolítica foi observado com o aumento das concentrações desses peptídeos quando comparados com indolicidina, um peptídeo reconhecido por sua alta atividade hemolítica (SUBBALAKSHMI et al., 1996). Isso poderia conferir uma margem de segurança maior em terapias antimicrobianas (HELMERHORST et al., 1999; STEINSTRAESSER et al., 2012). Assim, HHC-10 e IDR-1018 poderiam ser potenciais candidatos antibióticos para uso humano ou animal.

Avaliamos também a habilidade dos peptídeos catiônicos HHC-10, IDR-1018 ou IDR- 1002 em reduzir a carga bacteriana em pulmões de camundongos infectados com K.

pneumoniae susceptível ou resistente a carbapenens. Esses três peptídeos têm se mostrado

efetivos em diferentes modelos de infecções, incluindo infecção pulmonar (LLAMAS- GONZÁLEZ et al., 2013; NIJNIK et al., 2010; RIVAS-SANTIAGO et al., 2013). Nossos estudos foram conduzidos através de dois modelos de infecção pulmonar (modelo I e modelo II). Observamos que no modelo I de infecção pulmonar, os peptídeos HHC-10, IDR-1018 bem como tobramicina (um antibiótico convencional) foram efetivos em reduzir a carga bacteriana de camundongos BALB/c infectados com K. pneumoniae ATCC 13883 (Figura 13). Os

tratamentos com 9,5 mg.Kg-1 _{de HHC-10 e de 4,75 de IDR-1018, também foram capazes de}

manter os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α no sangue e nos pulmões, similares ao controle não infectado. Essas citocinas têm um papel fundamental no recrutamento de células de defesa, como neutrófilos (os quais podem eliminar as bactérias) para o local da

infecção (REEVES et al., 2002; PRINCE et al., 2013). Entretanto quando desreguladas, essas citocinas podem contribuir para danos no tecido infectado (BARTLETT; MCCRAY; THORNE, 2003). Outro estudo mostrou que IDR-1018, protegeu camundongos em modelos de infecção pulmonar com P. aeruginosa e manteve os níveis das citocinas TNF- α IL-6 baixos, comparados aos animais tratados com solução salina (HILCHIE, 2013).

Em contraste ao que foi observado no modelo I, HHC-10 e IDR-1018 foram inefetivos no modelo de infecção pulmonar II, em reduzir a carga dessa mesma bactéria em BALB/c (Figura 17). É pouco claro porque obtivemos diferenças contrastantes ente os resultados dos dois modelos de infecção pulmonar. Mesmo havendo diferenças experimentais, esperávamos que o grupo controle pudesse eliminar as variáveis existentes entre esses dois experimentos. Embora o objetivo primário de nossos experimentos tenha sido avaliar a atividade de peptídeos em modelos de infecção pulmonar, os resultados obtidos nos dois modelos experimentais levaram a questionamentos sobre os impactos do volume (50 μL, modelo I; 30 μL, modelo II) ou tipo de anestesia (quetamina/ xilazina, injetável, no modelo I; isofluorano, inalatória, no modelo II) utilizada em nossos modelos de infecção pulmonar. Estudos têm revelado que diferenças no volume de administração do inóculo, bem como o tipo de anestesia aplicada, pode impactar significativamente o modelo de pneumonia. Em relação ao volume aplicado por via intranasal, uma investigação recente, mostrou que a eficiência de entrega do inóculo foi maior em animais que receberam 50 μL ou mais do inóculo de Francisella tularensis (MILLER et al., 2012). Esse mesmo estudo mostrou que a anestesia inalatória (isofluorano) foi mais eficiente para entrega do inóculo bacteriano, do a que anestesia injetável (quetamina/ xilazina). Mais estudos são necessários para clarificar esses resultados.

Em nossos estudos avaliamos também o efeito protetor do peptídeo IDR-1018 em camundongos BALB/c infectados K. pneumoniae ATCC 13883 em modelo de infecção pulmonar. Estudos têm mostrado que peptídeos imunomodulatórios, tais como, IDR-1018 IDR- 1002 são capazes de proteger camundongos de infecções bacterianas quando aplicados profilaticamente (HILCHIE et al., 2013; RIVAS-SANTIAGO et al., 2013). Hilche et. al (2013), observou que camundongos tratados com IDR-1018, 4 h antes da infecção intranasal com P. areruginosa apresentaram uma menor concentração de UFC no fluído bronco-alveolar do que camundongos tratados com solução salina. Entretanto em nossos experimentos, tratamentos intranasal ou intravenosos com o peptídeo IDR-1018 foram inefetivos em reduzir a carga bacteriana de K. pneumoniae. Também foi avaliada a efetividade de IDR-1018 e IDR- 1002 contra K. pneumoniae KPC 1825971 em modelo de infecção pulmonar. Embora IDR- 1018 e IDR-1002 tenham sido efetivos in vitro contra K. pneumoniae (Tabela 7), esses

peptídeos foram inefetivos em reduzir a contagem dessa bactéria em pulmões de camundongos (Figura 19).