Avaliação do perfil redox de camundongos nocaute envelhecidos

Neste trabalho foram utilizados extratos proteicos de tecidos de fêmeas camundongos C57BL/6 nocauteados nas proteínas CSA e animais wt com idades de 1,5 , 12e 24 meses. Estes animais são provenientes do Instituo Erasmus na Holanda e foram transferidos para o Brasil para o Instituto de Ciências Biomédicas da USP, onde encontram-se sob-responsabilidade do Prof. Carlos Menck. O acompanhamento e eutanásia dos animais ocorreu durante o período de pós-doutorado da Profa. Dra. Camila Carrião, com o aval do comitê de ética para a experimentação animal (documento em anexo).

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Os animais foram sacrificados por excesso de anestésicos (Ketamina + Xylasina (1:1): 0,5 ml/100 g peso corporal), e os órgãos (cérebro, pulmão, fígado, rins e pele) foram imediatamente congelados em gelo seco e estocados em freezer -80°C. Os animais, durante os 24 meses de experimentos, foram pesados e acompanhados semanalmente. Dentre os dados coletados, como peso, aparência de pelo e gaiola, nenhuma diferença foi observada entre as linhagens.

Ao final do período os animais foram sacrificados, sendo 10-15 por dia. Dos tecidos coletados foram utilizados nos estudos somente o cérebro e fígado com o número amostral de 3 por grupo.

3.3.1. Extração de proteínas

A extração de proteínas do fígado e cérebro foi realizada utilizando tampão de homogeneização (Fosfato de sódio anidro 10mM , fosfato de potássio anidro 10 mM, cloreto de potássio 1 mM, cloreto de sódio 68mM e EDTA 1mM) 0,1g/ml e inibidor de protease (Sigma-Aldrich) 2μ/ml. Após a homogeneização, as amostras foram incubadas por 10 minutos e em seguida centrifugadas na centrífuga resfriada à 4C° por 10 minutos em 13000 rpm. O sobrenadante foi aliquotado para a realização das dosagens de proteínas e experimentos posteriores.

3.3.2. Dosagem de proteínas

As proteínas foram dosadas utilizando o método de Bradford, 1976. A curva padrão de calibração foi construída utilizando Albumina de Soro Bovino (BSA) com 6 pontos com concentrações entre 0,05mg/ml e 5mg/ml. Foi realizada a diluição dos extratos proteicos em 40 vezes para o cérebro e em 80 vezes para o fígado, para que os valores não ultrapassassem a curva de calibração.

O experimento foi realizado em uma microplaca de 96 poços, em que em cada poço foi pipetado 10μl de amostra com 190μl de corante (Bio-Rad, Protein Assay). Após um período de incubação de 30 minutos em temperatura ambiente foi feita a leitura da placa no espectrofotômetro à 595nm.

29 3.3.3. Quantificação de proteínas carboniladas Preparo das amostras

Para o experimento de quantificação de proteínas carboniladas as amostras foram inicialmente preparadas utilizando: 7,5 μl de amostra, SDS 120% e 2,5μ da solução de derivatização (80mM DNPH, 40% ácido trifluoracético e 60% água miliQ). Em seguida foram incubadas no escuro por 30 minutos. Após este período foram adicionados 30 μl de tampão de neutralização (2M Tris, 30% glicerol e 19% β- mercaptoetanol) para cessar a reação. A desnaturação das proteínas foi feita no termobloco à 100°C por 5 minutos, seguido de resfriamento imediato.

Separação e transferência das proteínas

As proteínas foram separadas por SDS-PAGE. Com o gel de separação a 10% (Tampão Tris-HCl 1,5M pH 8,8, Acrilamida/Bis-acrilamida 30:0,8, SDS 10%, persulfato de amônio 10%, TEMED 10% e água destilada 40%) e de concentração a 5% (Tampão Tris-HCl 0,5M pH 6,8, Acrilamida/Bis-acrilamida 30:0,8, SDS 10%, persulfato de amônio 10%, TEMED e água destilada 50%).

Em cada canaleta do gel foram aplicados 30μl de amostra. A corrida foi feita a 100 watts por cerca de duas horas e meia. Após a corrida, o gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose (Amersham) e incubado em solução de bloqueio (5% leite em pó, Tris-HCl 20mM, NaCl 136mM) overnight e o gel réplica fixado em solução fixadora (10% ácido acético, 40% etanol e 50% água) e corado com comassie (QC Coloidal Coomassie Stain). Em seguida a membrana foi lavada em solução de TBS-T (Tris-HCl 20mM, NaCl 136mM, 1% Tween-20) por 3 vezes, e logo após incubada por 5 horas em anticorpo primário anti-DNPH (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e em 3 horas no anticorpo secundário anti-rabbit peroxidase (1:5000) (Sigma-Aldrich,St. Louis, EUA).

As bandas da membrana com proteínas conjugadas com DNPH foram visualizadas por quimioluminescência Illuminata (ECL Amersham,) e reveladas em filme (Kodak). Para a apresentação dos resultados usamos o software ImageJ versão 1.49 na quantificação das bandas de proteínas carboniladas em relação à quantidade total de proteína pela quantificação do gel réplica.

30 3.3.4. Determinação de grupos tióis

A determinação de grupos tióis foi feita de acordo o método colorimétrico de Ellman, 1959. O experimento foi realizado utilizando uma microplaca de 96 poços, em que em cada poço foi pipetado 10 μg de proteína, tampão ( Tris/HCl 0,1M, EDTA 0,5mM pH=8,0), e 4 μl de DTNB (10mM), totalizando um volume de 200 μl. Após o período de incubação de 10 minutos foi feita a leitura da placa no espectofotômetro a 412 nm. A partir dos valores de absorbância foram determinadas as concentrações dos grupamentos tióis pela seguinte fórmula:

C= A/ε ;C=x mM

ε

,

𝑥 𝑚𝑀 − 10 𝜇𝑔

𝑦 𝑚𝑀 − 1000 𝜇𝑔

3.3.5. Atividade da glutationa peroxidase

Para a análise da atividade enzimática da enzima glutationa peroxidase (GPx) adotamos o método Flohe e Gunzler (1984), que se baseia na utilização de Terc-butil hidroperóxido como substrado da reação ao invés do peróxido de hidrogênio, uma vez que este também é consumido pela enzima catalase.

O experimento foi realizado em uma microplaca de 96 poços, onde em cada poço foi adicionado: o volume de amostra (50 uL para o cérebro e 20 uL para o fígado), tampão fosfato de potássio (100 mM, EDTA 1mM), glutationa reduzida (GSH) (25mM), NADPH (25 mM), T-butil hidroperóxido (1,5 mM) e glutationa redutase (GR) (9,6u/ml). Em seguida foram realizadas leituras no espectofotômetro a 340 nm a cada 30 segundos por 5 minutos em uma temperatura de 37°C para a detecção do decaimento de NADPH. A atividade de GPx foi calculada utilizando a seguinte fórmula:

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∆Abs/6,22μmol X Vr/Va

∆Abs representa a absorbância final menos a inicial 6,22 μmol é o coeficiente de extinção de NADPH Vr é o volume de reação

Va é o volume de amostra

Os resultados da atividade de GPx são expressos em unidades por mg de proteína.