4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.2. Experimentos de morte celular
4.2.1. Quantificação de glutationa (GSH)
Evidências sugerem que as proteínash CSA e CSB podem atuar em diversos processos que se relacionam com a resposta celular a ação de agentes oxidantes, levantando a hipótese de que os processos redox poderiam contribuir para o desenvolvimento da doença quando essas proteínas não são funcionais.
Mutações em regiões distintas nas proteínas levam ao desenvolvimento de CS com diferentes classificações de severidade, apesar de não ser comprovada até o momento a relação entre esses dois fatores. Para avaliar as consequências dos processos redox no desenvolvimento dessa doença, expusemos células derivadas de pacientes que possuem diferentes mutações nas proteínas CSA e CSB a agente indutor de danos por oxidação e determinamos, por meio da quantificação da viabilidade celular após a exposição, a existência ou não de sensibilidade diferencial entre as linhagens. Os experimentos abaixo foram, em parte, também realizados durante o estágio de pós doutorado da Prof.ᵃ Dr.ᵃ Camila Carrião.
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A indução dos danos foi feita pela redução das concentrações de glutationa (GSH) intracelular com L-butionina sufoxamina (BSO), seguido da exposição ao peróxido de hidrogênio (H2O2). O GSH é uma importante molécula do sistema antioxidante que, por meio da ação da enzima glutationa peroxidase (GPx) é oxidada em GSSG na conversão de H2O2 em água. GSSG por sua vez é reduzido pela glutationa redutase (GR) novamente em GSH. A depleção de GSH por BSO ocorre por meio da inibição da enzima γ-glutamilcisteina sintetase, responsável pela síntese dessa molécula. Essa inibição promove a diminuição da capacidade antioxidante das células e consequentemente aumento dos níveis de ERs intracelular pelo acúmulo de H2O2 e formação do radical hidroxila (OH•) como produto da reação do H2O2 com íons metálicos (Marengo et al. 2008)(Alexandre et al. 2006). Com a adição de H2O2 em um sistema com capacidade já reduzida de neutralização dessa espécie é induzida uma condição pró-oxidante e citotóxica para as células, levando a oxidação de proteínas, DNA, RNA e lipídios.
Iniciamos os experimentos com a padronização da dose mínima de BSO necessária no tratamento para depletar GSH intracelular por até 18 horas. Verificamos que doses de 1 μM já são capazes de reduzir GSH para menos de 50% da concentração inicial em todas as linhagens, e doses acima disso (10 e 50 μM) depletam GSH para abaixo de 10% (Fig.8).
Figura 8: Quantificação de glutationa (GSH) intracelular por quimioluminescência com kit GSH-GloTM
Promega após 18 horas do tratamento das células com 0, 1, 10 e 50 μM de BSO. Os resultados apresentam média e desvio padrão (n=3). Os experimentos foram repetidos por três vezes.
45 4.2.2. Viabilidade celular
Posteriormente foi feito o ensaio XTT de viabilidade celular após tratamento com diferentes doses de BSO por 18 horas, para avaliar se a redução de GSH é tóxica para as células e determinar a concentração máxima a ser utilizada que fosse suficiente para reduzir GSH aos níveis de interesse e que ao mesmo tempo não comprometesse a viabilidade celular (Fig.9).
Os resultados mostram de maneira geral que as doses de BSO testadas (1, 10 e 50uM) não causam alterações importantes na viabilidade celular. Há variações com o aumento da dose em algumas linhagens, como CSA2 e CSB1 em dosagens de 50 μM e acima, além de leve redução em outras, como WT1 e CSA1.
Figura 9: Citotoxicidade de BSO avaliada por ensaio XTT em células NER deficientes e proficientes.
Células tratadas com BSO nas doses indicadas por 18 h. Os resultados apresentam média e desvio padrão (n=3). Os experimentos foram repetidos por três vezes.
Em seguida avaliamos a sensibilidade celular ao agente oxidante H2O2 expondo as células à concentrações crescentes de H2O2 por 2 horas (Fig. 10). Nossos resultados apontaram grandes diferenças na viabilidade entre as linhagens analisadas. Concentrações de 25μM já causam pequena redução da viabilidade celular em algumas linhagens, que se acentua em doses de 50μM em CSB1, CSA2 e wt. As células CSA2 mostraram ser mais sensíveis ao H2O2, com reduções significativas da viabilidade já nas
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duas primeiros doses testadas. CSB2 tem a viabilidade afetada somente em doses superiores a 50μM de H2O2, nas quais XPC, XPA e CSA1 mantiveram praticamente constante as sua taxas de viabilidade. Observação importante a ser considerada é a resposta manifestada pelas células controle ao tratamento, que apresentaram sensibilidade maior que a maioria das demais linhagens.
Figura 10: Citotoxicidade H2O2 avaliada por ensaio XTT em células NER deficientes e proficientes.
Células expostas a H2O2 por 2 h nas doses indicadas. Os resultados apresentam média e desvio padrão (n=3). Os experimentos foram repetidos por três vezes.
Por fim, verificamos o efeito de processos redox pelo sistema BSO/H2O2 na viabilidade celular com combinações de diferentes dosagens de BSO e H2O2 (Fig.11). Nesse experimento é possível observar que o co-tratamento potencializa a sensibilidade ao H2O2 em comparação aos tratamentos individuais, causando reduções significativas de viabilidade na maioria das linhagens. A diminuição dos níveis de GSH comprometem a detoxificação do H2O2 nas células, levando a sensibilização frente ao efeito tóxico dessa espécie que promove danos nas biomoléculas acarretando na morte celular.
É notável também que as células CSA e CSB respondem de maneira característica aos processos redox, apresentando sensibilidade diferencial ao H2O2/BSO, com variações de porcentagens de viabilidade celular com as concentrações dos tratamentos . Além disso, foi demonstrado nesses experimentos que mutações distintas na mesma proteína podem fazer com que as respostas a situação induzida
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sejam específicas, como as apresentadas por CSA1 e CSA2, e CSB1 e CSB2, quando expostas ao H2O2.
A linhagem CSB2 (CS1AN) possui as mutações K337X e Y834fs em heterozigose, que geram proteínas truncadas e manifestação de CS do tipo I. Já a linhagem CSB1 (GM10905) carrega a mutação R735X em homozigose, uma das quais discutimos acima (seção 4.1), presente em pacientes que apresentam fenótipos distintos: em um a mutação manifesta como CS tipo I, em outro como Síndrome de Sanctis- Cacchione (Colella et al. 2000) (Mallery et al. 1998)
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Ambas as linhagens são derivadas de pacientes com mutações em CSB que conferem a esses o mesmo grau de manifestação moderada da doença. Porém, a nível celular as diferentes alterações na proteína aparentemente influenciam na viabilidade das células após exposição ao H2O2. CSB1 apresentou sensibilidade acentuada em comparação com CSB2 aos tratamentos com H2O2 (Fig. 10) e H2O2/BSO (Fig. 11) em todas as dosagens analisadas, sugerindo que regiões com funções importantes para a resposta a processos redox podem não estar presentes na proteína, como resultado da mutação que carrega.CSA1 (AS466) não expressa a proteína CSA, enquanto CSA2 (AS655) possui as mutações W194C e T24fs em heterozigose. Informações adicionais sobre o fenótipo dos pacientes de que são derivadas essas células não foram encontradas na literatura. Nos experimentos realizados, quando expostas aos tratamentos vimos que CSA2 é altamente sensível em todas as concentrações analisadas (Fig. 11), indicando que as modificações na estrutura da proteína causadas pelas mutações é mais prejudicial para a sobrevivências das células que a sua ausência total.
A relação entre o tipo de mutação e os resultados observados nesses experimentos não é clara, indo ao encontro do que foi relatado no levantameto de mutações em CSA e CSB no presente trabalho, em que verificamos que tipo de mutação e região em que ela se encontra na proteína não determinam o grau de severidade da doença nos pacientes. Essa diferença de fenótipo pode ser atribuída, pelo menos em parte, ao background genético dos pacientes e possivelmente é uma explicação para as variações de sensibilidade observadas entre as linhagens celulares desse experimento. A extrema e inesperada sensibilidade do grupo controle aos tratamentos também pode ser
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justificada por esse fato, o que impossibilitou fazermos inferências sobre os possíveis papeis das proteínas em resposta à situação induzida.
Um outro ponto a ser levado em consideração frente aos resultados é que eles mostram que a sensibilidade e resposta a ação de agentes indutores de processos redox não é uma característica uniforme em pacientes CS. Pelo fato das células apresentarem diferentes graus de sensibilidade entre si ainda mais questionamentos são levantados a respeito da real influência dos processos redox no desenvolvimento dessa doença.
Figura 11: Citotoxicidade de BSO e H2O2 avaliada por ensaio XTT em células NER deficientes e
proficientes. Células tratadas com BSO nas doses indicadas por 18 h, seguida da incubação com H2O2 nas
doses indicadas por 2h. Os resultados apresentam média e desvio padrão (n=3). Os experimentos foram repetidos por três vezes