Avaliação do silenciamento de AntgCHS2 sobre a morfologia do intestino de A grandis

Foi realizada uma análise morfológica e histológica de intestinos proveniente de insetos adultos submetidos ao tratamento com dsRNA. Os intestinos de fêmeas adultas tratadas com dsRNA AntgCHS2 apresentaram-se mais volumosos e o seu conteúdo apresentava um aspecto mais leitoso comparado com o tratamento controle (Figura II-24). A análise histológica desses intestinos mostrou que naqueles em que a quitina sintase 2 foi silenciada houve uma fragilização do epitélio intestinal, com desorganização tecidual e descamação celular (Figura II-25).

Figura II-24. Análise morfológica de intestinos de insetos adultos tratados com dsRNA AntgCHS2. Os intestinos foram dissecados de fêmeas adultas 5 dias após a microinjeção. A. Tratamento dsRNA GUS e B. tratamento com dsRNA AntgCHS2. A barra = 1 mm

dsRNA GUS

A

dsRNA AntgCHS2

Figura II-25. Análise histológica de intestinos de insetos adultos tratados com dsRNA AntgCHS2. Os intestinos foram dissecados de fêmeas adultas após 5 dias da microinjeção. Imagens em campo claro de secções transversais de instestinos de A. grandis corados com azul de toluidina. A. Tratamento dsRNA GUS e B. tratamento com dsRNA AntgCHS2. A seta mostra regiões de descamação celular. A escala = 100 m

A

5 DISCUSSÃO

A necessidade de controlar os insetos-praga e patógenos na agricultura tem impulsionado o desenvolvimento de uma variedade de pesticidas que diminuem as perdas no agronegócio. Estudos toxicológicos baseados nos efeitos agudos e crônicos da exposição a estas substâncias revelaram que muitos inseticidas sintéticos são altamente tóxicos, não somente à espécie da praga alvo, mas também aos mamíferos incluindo os seres humanos. Consequentemente, é necessária a busca por alternativas mais seguras, com eficientes mecanismos de ação e ambientalmente sustentáveis para o controle de pragas em geral (LOPEZ et al., 2005).

A biossíntese da quitina por ser uma via metabólica ausente em plantas e vertebrados é, atualmente, estudada como um dos principais alvos para o desenvolvimento de estratégias de controle de insetos (KRAMER; MUTHUKRISHNAN, 1997). Com a disponibilidade ao banco de sequências do trancritoma do bicudo-do-algodoeiro foi possível identificar todas as enzimas da via de síntese de quitina em A. grandis. Assim, como em outros insetos, estudos para a identificação de alvos que interfiram nessa via, agora, podem ser estudados.

A síntese de quitina nos invertebrados, em que ela ocorre, é catalisada, na última reação da via, pela enzima quitina sintase. Em insetos, as quitina sintases são agrupadas em duas classes, classe A ou tipo I e classe B ou tipo II, com base em suas similaridades da sequência de aminoácidos e função. As enzimas da classe A são expressas especificamente na epiderme e células relacionadas com a ectoderme como são as células da traquéia, enquanto a expressão das quitina sintases pertencentes à classe B estão mais restritas as células epiteliais do intestino médio, de origem endodérmica, que produzem a membrana peritrófica (MERZENDORFER; ZIMOCH, 2003).

Nesse capitulo, são descritos a clonagem e sequenciamento de um cDNA de um dos genes de quitina sintase de A. grandis. Nomeado de AntgCHS2, este cDNA é predito ter uma ORF de 4212, a qual codifica 1404 aminoácidos. A sequência proteica de AntgCHS2 apresentou maior similaridade de sequência com as quitina sintases de insetos da classe B do que com os da classe A. AntgCHS2 apresentou 50% de identidade e 69% de similaridade de sequência de aminoácidos com a quitina sintase II de Tribolium castaneum.

As quitina sintases são enzimas localizadas na membrana plasmática das células, o que permite que a cadeia de quitina nascente seja translocada para o exterior (ZIMOCH; MERZENDORFER, 2002; BROEHAN et al., 2007). AntgCHS2 é predita ser uma proteína integral de membrana com 15 alças transmembranas. A disposição e o número conservado

dessas alças transmembranas nas quitina sintases permitem que o domínio central, que é o domínio catalítico, esteja voltado para dentro do citoplasma, onde o substrato UDP-N- acetilglucosamina está acessível (TELLAM et al., 2000). Esse domínio apresenta um alto grau de conservação entre as quitina sintases de insetos e possui as sequências conservadas EDR e QRRRW presentes na família das glicosiltransferases 2 (TELLAM et al., 2000; MERZENDORFER, 2006).

Das quinze hélices transmembranas, cinco delas estão localizadas imediatamente após o domínio catalítico central, esta topologia, denominada região 3-5 TMS, está presente tanto em quitina sintases de insetos quanto nas de fungos (MERZENDORFER, 2011), sendo similar àquela encontrada em celuloses sintases, que tem sido atribuída à função de permitir a formação de um poro na membrana, através do qual, os polímeros glicídicos recém- sintetizados podem ser translocados (RICHMOND, 2000; COHEN, 2001; CARPITA, 2011). Estima-se que a massa molecular de AntgCHS2 seja de 160 KDa, semelhante a outras quitina sintases de insetos (MERZENDORFER; ZIMOCH, 2003; ARAKANE et al., 2004). Outras análises in silico detectaram a presença, na sequência protéica de AntgCHS2, de quatro sítios potenciais de O-glicosilação, seis sítios potenciais de N-glicosilação e 53 sítios potenciais de fosforilação. Portanto, essas análises estruturais indicam que AntgCHS2 é uma grande e complexa proteína integral de membrana com um potencial intrínseco para múltiplas modificações pós-traducionais que podem estar envolvidas nos mecanismos de regulação de sua atividade.

Em consonância com outras quitina sintases da classe B, AntgCHS2 não apresentou em sua sequência regiões com potencial de formar estruturas “coiled-coil” logo após a região 3-5TMS. Esta estrutura está presente em quitina sintases da classe A, a qual é relacionada com a interação de proteínas que regulem a sua atividade e/ou o tráfego vesicular dentro da célula (MELIA et al., 2002; ZHU et al., 2002; ARAKANE et al., 2004; BOLOGNESI et al., 2005). Com relação ao controle da atividade das quitina sintases da classe B, alguns relatos cientificos em Manduca sexta apontam um mecanismo de regulação mediado pela interação de enzimas proteolíticas do tipo quimotripsina com o domínio C extracelular de quitina sintase (ZIMOCH et al., 2005; BROEHAN et al., 2007). Como as quimotripsinas são ativadas por tripsinas, que sua secreção é induzida por estímulo alimentar, a atividade das quitina sintases e, portanto, da formação da membrana peritrófica pode ser diretamente controlada pelo estado nutricional do inseto (IBRAHIM et al., 2000).

No presente estudo foi constatado a presença de somente de uma cópia do gene de AntgCHS2 no genoma de A. grandis. Entretanto, duas bandas de hibridização foram

detectadas na digestão do DNA genômico com EcoRI. Existem diferentes explicações para essa observação. Primeiro, a sonda para AntgCHS2 poderia estar também hibridizando com o gene de AntgCHS1. Todavia, essa hipótese pode ser descartada já que nas digestões com

XbaI, SphI e NcoI apenas uma banda foi detectada. Uma alternativa e a possibilidade mais

provável, é que sítios de restrição para EcoRI existam dentro das sequências de introns do gene , assim a sonda hibridiza em mais de um local. A presença de uma única cópia do gene AntgCHS2 é consistente com os resultados obtidos para outras espécies de insetos, indicando a presença de um gene quitina sintase de classe B por genoma (TELLAM et al., 2000; GAGOU et al., 2002; ZHU et al., 2002; ARAKANE et al., 2005; HOGENKAMP et al., 2005; AMPASALA et al., 2011).

O padrão de expressão de AntgCHS2 foi estudado durante todas as fases do desenvolvimento do inseto por PCR em tempo real. Os maiores níveis de expressão de AntgCHS2 foram detectados durante o terceiro instar larval, fase na qual o inseto mais se alimenta e passa mais de 60% do tempo do seu desenvolvimento (ver Apêndice A), e durante a fase adulta. Baixos níveis de transcritos foram observados durante as fases de ovo e pupa, períodos no qual o inseto não se alimenta. Resultados semelhantes foram observados em análises de expressão de quitina sintase da classe B nos insetos: S. frugiperda, S. exígua e T.

castaneum (BOLOGNESI et al., 2005; HOGENKAMP et al., 2005; ARAKANE et al., 2008).

Os níveis de expressão tecido especifico de AntgCHS2 também foram investigados. O gene AntgCHS2 é principalmente expresso no intestino médio de A. grandis e sua expressão varia ao longo do trato digestório. Os maiores níveis foram detectados no intestino médio anterior, diminuindo no intestino médio posterior e não sendo mais detectado em tecidos de origem ectodérmica (proctodeu e epiderme) (para observação do trato digestório de A. grandis ver Apêndice B). Portanto, esses dados indicam o papel da enzima AntgCHS2 na síntese de quitina da membrana peritrófica de A. grandis. Durante as fases de alimentação, os insetos estão digerindo o alimento ativamente e precisam desta estrutura para proteger as células epiteliais do intestino e para aumentar a eficiência de digestão (TERRA, 2001). Em Aedes

aegypti, um gene de quitina sintase de classe B é expresso no intestino médio, e o seu nível de

expressão aumenta logo após o repasto sanguíneo das fêmeas (IBRAHIM et al., 2000). Esses resultados reforçam a hipótese que os genes das duas classes de quitina sintase de insetos possuem funções distintas e são responsáveis pela deposição de quitina em diferentes estruturas quitinosas nos insetos, sendo os genes da classe B responsáveis pela síntese da membrana peritrófica (ZIMOCH et al., 2005; CHEN et al., 2007; ARAKANE et al., 2008).

O RNA interferente é um mecanismo de silenciamento gênico desencadeado por dupla fita de RNA (dsRNA) (FIRE et al., 1998). O dsRNA intervém na repressão da tradução por meio da degradação do mRNA ou da repressão transcricional através de modificações no DNA (MEISTER; TUSCHL, 2004; MELLO; CONTE, 2004; SEN; BLAU, 2006). O fenômeno do RNA tem sido descrito e amplamente utilizado como uma robusta ferramenta genética em insetos modelos (TOMOYASU et al., 2008; BELLES, 2010). Por ser uma técnica relativamente nova, é necessário o desenvolvimento de estudos sobre os parâmetros necessários para se atingir o mesmo sucesso de silenciamento gênico em insetos não-modelos, como é o caso do bicudo-do-algodoeiro.

Neste trabalho, experimentos de microinjeção de dsRNA foram desenvolvidos, otimizados e adaptados ao bicudo-do-algodoeiro visando: i) analisar funcionalmente a expressão AntgCHS2 em insetos adultos e larvas; e ii) avaliar o potencial do silenciamento gênico como estratégia de controle desse inseto praga.

Vale salientar que esse trabalho é o primeiro relato da utilização de RNAi para o estudo da função gênica em A. grandis. As microinjeções de dsRNA foram iniciadas em insetos adultos, devido a sua fácil manipulação e baseado nos relatos de sucesso na literatura em microinjeções utilizando insetos adultos do coleóptero modelo T. castaneum (TOMOYASU et al., 2008). Huvenne e Smagghe (2010) listaram múltiplos fatores que influenciam a eficiência do RNAi, incluindo concentração, sequência e tamanho do dsRNA. Experimentos de otimização foram realizados no intuito de verificar alguns desses fatores. Foi constatado que a administração direta de dsRNA na hemolinfa do inseto foi o método mais efetivo em desencadear uma resposta de silenciamento gênico de AntgCHS2. Entretanto, em alguns experimentos, a administração do dsRNA em lipossomos catiônicos é essencial para que possa ser absorvido pelas células (SALEH et al., 2006), aqui a administração do dsRNA em lipossomos também foi testada, mas o silenciamento não foi tão efetivo quanto à administração do dsRNA puro.

Em experimentos de silenciamento gênico por RNAi, o tamanho do dsRNA administrado varia amplamente dependendo do organismo (geralmente entre 21 a 1000 pb). Em plantas, ambos siRNA e dsRNA longos são efetivos em ativar uma resposta de RNAi, mostrando tanto uma resposta local quanto sistêmica (KLAHRE et al., 2002). Em cultura de células de mamíferos, dsRNAs longos induzem a ativação do sistema interferon, resultando em morte celular (ALEXOPOULOU et al., 2001), mas dsRNAs curtos não são reconhecidos pelo sistema imune, e assim, podem ser utilizados para alcançar o silenciamento gênico (ELBASHIR et al., 2001). Em células S2 de Drosophila, dsRNAs longos são eficientemente

absorvidos (CLEMENS et al., 2000). Entretanto, siRNAs não são absorvidos em células S2, sem o auxílio de um reagente de transfecção (SALEH et al., 2006). Em C. elegans, o animal modelo em que o RNAi foi mais bem estudado, para se obter uma resposta de silenciamento eficaz são utilizados dsRNAs variando de 50 a 100 pb (PARRISH et al., 2000). Em insetos pouco se conhece sobre a faixa de tamanho eficaz do dsRNA. Aqui, são descritos os resultados da utilização de dsRNAs com tamanho variando de 184 a 587 pb e todos foram capazes de silenciar a expressão do gene de AntgCHS2. Ainda com relação ao tamanho do dsRNA, quando esiRNAs, obtidos da digestão do dsRNA pela endonuclease RNAseIII de E.

coli, foram microinjetados em A. grandis, observou-se um menor efeito de RNAi, quando

comparado a administração de dsRNA mais longos. Provavelmente, o resultado observado está relacionado ao mecanismo de entrada de RNAs dupla fitas dentro da célula. O conhecimento atual sobre o processo de internalização celular de dsRNAs em insetos é baseado em experimentos com células de Drosophila. Nesse inseto, o processo de captação é iniciado com a interação de moléculas de dsRNA com receptores scavengers. Esses receptores são um grupo de moléculas que mediam a endocitose de certos ligantes polianiônicos, por exemplo, DNA e dsRNAs. Em células S2 de Drosophila, esses receptores são responsáveis pela internalização de mais de 90% do dsRNAs (ULVILA et al., 2006). SALEH et al, (2006), verificaram que o processo de internalização depende do tamanho do dsRNA e demonstraram que as moléculas de siRNAs não são longas o suficiente para ativar o recrutamento da maquinaria de endocitose, já dsRNAs mais longos que 100pb induzem substancialmente esse processo.

Não houve diferença na indução da resposta de silenciamento por RNAi entre as regiões escolhidas como sequência alvo, quer seja na extremidade 5’, na região central, ou ainda, na extremidade 3’ do cDNA. Uma vez dentro do citoplasma, o dsRNA longo é clivado para gerar uma população de siRNAs. Sabe-se que a eficiência de cada siRNA em promover o silenciamento é variável (HOLEN et al., 2002). Dentre os vários fatores que afetam a potência de um siRNA, destacam-se os parâmetros termodinâmicos que interferem na escolha da sequência guia (fita do siRNA incorporada ao complexo RISC), o grau de complementaridade da sequência guia com a sequência alvo no RNAm e da acessibilidade da sequência alvo na estrutura secundária no RNAm alvo (PARRISH et al., 2000; SHAO et al., 2007; UI-TEI et al., 2012). Portanto, dentro de uma população de esiRNA, há uma grande probabilidade da existência de siRNAs potentes, o que aumenta a eficiência do silenciamento, não importando a posição da sequência alvo do dsRNA dentro do RNAm.

Nos experimentos de silenciamento de AntgCHS2, outro parâmetro importante avaliado foi o efeito da concentração de dsRNA sobre a ativação da resposta de silenciamento gênico. Insetos adultos microinjetados com dsRNA para AntgCHS2 foram bem mais sensíveis ao RNAi do que as larvas. Em insetos adultos a administração de 50 ng de dsRNA por inseto obteve o mesmo grau de silenciamento do que quando foi administrado doses mais altas. Porém para ambas as fases, doses de 200 ng por inseto foram suficientes para desencadear o silenciamento. Em trabalhos com T. castaneum as doses variam entre 200 e 500 ng por inseto (TOMOYASU; DENELL, 2004; ARAKANE et al., 2005). A dose está intimamente relacionada à capacidade do inseto exibir uma resposta sistêmica de RNAi. Experimentos de silenciamento gênico por RNAi em insetos da ordem Lepidoptera mostraram que esses insetos são mais tolerantes e necessitam de uma alta dose de dsRNA quando comparados com experimentos em insetos coleópteros. Uma revisão sobre as dificuldades encontradas nos experimentos de RNAi em lepidópteros é descrito por Terenius, et al. (2011). Além disso, em trabalhos de validação funcional a administração de altas doses de dsRNA ou siRNA pode causar a saturação da maquinaria do RNAi (PARRISH et al., 2000; YI et al., 2005; BARIK, 2006; GRIMM et al., 2006). Essa saturação causa muitos problemas. Primeiro, as vias do miRNA e RNAi compartilham vários componentes, a supersaturação desses componentes durante a resposta RNAi pode resultar na inibição da via miRNA resultando em fenótipos relacionados com a perda de função de miRNA. Uma vez que miRNAs são essenciais para o crescimento, desenvolvimento e homeostasia dos tecidos, sua disfunção pode resultar em letalidade (GRIMM et al., 2006). Em segundo lugar, uma elevada concentração da mistura de siRNAs pode resultar em competição pelos componentes da maquinaria de RNAi, resultando em inibição competitiva. Outra variação na eficiência do RNAi, está relacionada a localização do tecido onde o alvo é expresso. Em D. melanogaster, sabe-se que o RNAi é menos eficaz no disco imaginal da asa (KENNERDELL; CARTHEW, 2000) e em C. elegans, alguns tecidos nervosos são refratários ao RNAi devido à expressão da nuclease Eri-1, que degrada o dsRNA (KENNEDY et al., 2004).

Assim como observado em T. castaneum, em A. grandis também foi possível produzir o efeito do RNAi larval (laRNAi), o qual permite estudar as implicações do silenciamento em insetos adultos a partir da aplicação do dsRNA ainda na fase larval (TOMOYASU; DENELL, 2004). Houve a persistência do silenciamento de AntgCHS2 durante a transição larva-adulto, ainda que, durante na fase intermediária, a fase de pupa, os níveis de transcritos de AntgCHS2 estão reduzidos. A duração do efeito do RNAi varia em organismos que exibem uma resposta sistêmica de RNAi. Em alguns organismos, se o dsRNA não é continuamente expresso no

interior da célula, se não é mantido pela célula, ou não é continuamente fornecido ao organismo, através da alimentação contínua, imersão, ou múltiplas injeções, o efeito do silenciamento pode desaparecer (PARRISH et al., 2000; PRICE; GATEHOUSE, 2008). No entanto, em plantas e em C. elegans, sabe-se que o dsRNA fornecido à célula pode ser amplificado através da ação da enzima RNA polimerase dependente de RNA (RdRP) (DALMAY et al., 2000; MOURRAIN et al., 2000; SIJEN et al., 2001). Este mecanismo de amplificação utiliza o RNAm alvo como molde para a síntese de mais moléculas de dsRNA, aumentando, assim, a quantidade de dsRNA disponível para a via de RNAi. Por isso, assumiu-se que um mecanismo de amplificação é necessário em todos os organismos que exibem um efeito de RNAi prolongado (PRICE; GATEHOUSE, 2008). No entanto, homólogos de RdRP não foram identificados na maioria dos metazoários, incluindo insetos (TOMOYASU et al., 2008). Em Tribolium tem sido demonstrado o silenciamento especifico por RNAi de isoformas provenientes de splicing alternativo (ARAKANE et al., 2005), sugerindo que a amplificação, utilizando o RNAm endógeno como molde não ocorre. Portanto, se um sistema de amplificação existe em insetos presume-se ser por meio de um mecanismo diferente do encontrado em C. elegans (TERENIUS et al., 2011). É possível que os insetos que apresentam um efeito sistêmico de RNAi simplesmente tem a capacidade de captar eficientemente e/ou armazenar o dsRNA por longos períodos.

Um dos principais objetivos deste trabalho foi avaliar o potencial do silenciamento de AngCHS2 como estratégia de controle genético de A. grandis, visando interferir na síntese de quitina da membrana peritrófica. Essa estrutura é uma das principais estruturas no corpo do inseto em que ocorre a deposição de quitina (TELLAM et al., 1999; TELLAM; EISEMANN, 2000), e está intimamente envolvida no processo digestivo, além de, participar na primeira linha de defesa contra patógenos ingeridos (WANG; GRANADOS, 1998; WANG; GRANADOS, 2000; TERRA, 2001). Por isso, se apresenta como um potencial alvo para o desenvolvimento de novos métodos de controle de insetos-praga. Estratégias que visem afetar a sua estrutura, por alteração de alguma de suas características físico-químicas, estruturais e biológicas geram efeitos que culminam na deficiência de assimilação de nutrientes ou descompartimentalização do processo digestivo e facilita a invasão de patógenos nos tecidos do inseto (WANG; GRANADOS, 2001).

Para avaliar os efeitos do silenciamento de AntgCHS2 na síntese da membrana peritrófica foram realizados bioensaios de microinjeção de dsRNA utilizando fêmeas adultas, afim de avaliar vários parâmetros fenotípicos. Esses ensaios culminaram em resultados promissores para o controle dessa praga. O silenciamento de AntgCHS2 não apresentou efeito

sobre a transição larva-pupa-adulto, quando a microinjeção foi realizada no último instar larval. Entretanto, quando a microinjeção foi realizada em fêmeas adultas causou efeitos severos sobre a mortalidade e reprodução. Após dez dias de experimento foi observado mortalidade de 100% no grupo tratado com dsRNA para AntgCHS2. A duração do efeito de RNAi por até 10 dias reforça a hipótese da presença de um mecanismo de manutenção do efeito do RNAi. Foi também constatado que as fêmeas silenciadas, a partir de 96 horas, tiveram diminuição considerável do número de posturas e nenhuma oviposição foi mais observada a partir de 192 horas. Em uma análise geral, o silenciamento de AntgCHS2 reduziu em 93% a oviposição. Resultados similares foram relatados em experimentos de silenciamento da quitina sintase 2 de T. castaneum por Arakane, et al. (2008). Assim, há forte evidência que estes resultados são reflexos de um efeito indireto de fome, devido à falta de uma membrana peritrófica funcional, que acarreta uma perturbação no processo de assimilação de nutrientes, e como consequência, o investimento energético é desviado de funções não essenciais ou vitais, tais como a reprodução (ARAKANE et al., 2008). Com a finalidade de ampliar a observação sobre os efeitos produzidos pela ausência de uma membrana peritrófica funcional revestindo o epitélio intestinal de A. grandis, foram avaliados alguns parâmetros bioquímicos que podem ser alterados e correlacionados por uma má nutrição. Foi constatado que a concentração de proteína na hemolinfa das fêmeas silenciadas para AngtCHS2 foi drasticamente reduzida. O que pode explicar a queda na produção de ovos. Os níveis das duas atividades enzimáticas majoritárias presentes no intestino médio de

A. grandis foram avaliados (OLIVEIRA-NETO et al., 2003; OLIVEIRA-NETO et al., 2004).

No presente estudo houve grande redução da atividade amilásica em intestinos de fêmeas