Avaliação do Tratamento Fúngico – Etapa 03

aproveitamento útil de até 120 mL ou em frascos de 125 mL com aproveitamento de até 75 mL, dependendo da relação entre a quantidade de frascos e o espaço para o cultivo em Shaker e estufa de crescimento no laboratório. As amostras foram formadas pela retirada de alíquotas, pois cada frasco foi aqui considerado como um sistema de tratamento individual.

5.5 Avaliação do Tratamento Fúngico – Etapa 03

Para a avaliação do tratamento dos IE deste estudo foram utilizadas duas ferramentas: (1) Análise Cromatográfica e (2) Teste da Atividade Estrogênica e Anti- Estrogênica: Teste de Proliferação em Células Humanas Mamárias de Câncer - E-screen.

A análise cromatográfica foi a primeira ferramenta a ser realizada logo após a realização do Tratamento dos IE – Etapa 02, como forma de selecionar as melhores amostras para o teste celular, já que esse é considerado complexo e dispendioso.

5.5.1 Análise Cromatográfica

O objetivo das análises cromatográficas foi quantificar e elucidar o processo de degradação dos IE após submetidos ao tratamento com as cepas fúngicas.

As análises cromatográficas foram realizadas na Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas – DQOF/CPQBA - UNICAMP, cujo sistema cromatográfico atende às seguintes especificações: LC-DAD Alliance Waters, composto por bomba Waters 2695, detector de arranjo de diodos (Waters 2996) e coluna C-18 (150 mm x 3,9 mm x 5 m), e detector UV.

O arranjo para as análises em CLAE foram baseadas em dados literários, com algumas modificações: Tanaka et al., (2000) – modificado; Jiang et al. (2006). A fase móvel

para o Bisfenol – A foi composta por solução de água e metanol na proporção de 50% e para os IE 4 – Octilfenol e 4 – Nonilfenol, a proporção de 20, 40 e 40% foi atribuída às substâncias água, metanol e acetonitrila, respectivamente. As demais características são apresentadas no Quadro 5.2.

Quadro 5.2: Características Cromatográficas Adotadas nas Análises

PARÂMETROS BISFENOL A 4 - OCTILFENOL

4 - NONILFENOL

Coluna C-18 (150x3,9 mm) C-18 (150x3,9 mm)

Fase móvel (%) H2O – MeOH (50:50) H2O – MeOH – ACN (20:40:40)

Vazão (ml/min) 0,6 0,6

Temperatura (ºC) 30 30

Detecção UV (nm) 224 225

Tempo de Retenção (min) 6,5 4,3

O Limite de Detecção (LOD) e o Limite de Quantiticação (LOQ) do Bisfenol – A foram calculados a partir da relação sinal/ruído (S/R), sendo os valores: 0,201 g.mL-1 _e 0,670 g.mL-1_{, respectivamente.}

Todas as análises cromatográficas ocorridas nesse trabalho foram realizadas por profissional técnico da área, cujas atividades compreenderam: (1) orientações no preparo das amostras, (2) manuseio do equipamento cromatográfico e (3) auxílio em leitura e interpretação dos resultados.

5.5.2 Teste de Proliferação em Células Humanas Mamárias de Câncer – E‐screen

O ensaio seguiu o método definido por Soto et al. (2006), cujo objetivo é evidenciar a potencial ação anti-estrogênica ou estrogênica de uma amostra através da proliferação da linhagem celular MCF-7 (adenocarcinoma mamário humano, com grande quantidade de receptores para estradiol), na presença e na ausência de 17β-estradiol (E2). O teste se baseia na indução da proliferação celular por esse estrógeno, pretendendo desta forma, confirmar se a ação anti-estrogênica ou estrogênica observada deve-se à mediação dos receptores estrogênicos. O principal intuito do teste é de verificar a relação entre a degradação dos IE e a atividade estrogênica exercida.

As células MCF-7 são o modelo mais utilizado em testes estrogênicos II e representam os efeitos em um grande número de mamíferos e outros vertebrados. A linhagem MCF-7 Bus, uma variação da MCF-7 mais sensível à ação de estrógenos, foi por esse motivo escolhida para utilização nos testes.

O método, conforme mostra o esquema da Figura 5.3, consiste em inocular as células MCF-7 Bus com densidade de 3x104 _cel.mL-1 _{em placa de 12 poços com tampa}

tratada, com meio de cultura RPMI 1640 sem vermelho fenol, acrescido de 5% de SFB (soro fetal bovino) tratado com Dextran e carvão ativo (DCC) e 0,1% de penicilina/estreptomicina. Após 24 horas de incubação a 37ºC, em atmosfera úmida e 5% de CO2, as células foram tratadas com E2 (em concentrações de 10-9 a 10-6 M), na presença e na ausência da amostra na concentração que apresentou inibição da ação de E2, e incubadas por 144 horas (37ºC, atmosfera úmida, 5% de CO2). Ao final desse período, foi avaliado o crescimento celular através do ensaio de SRB, em que as placas foram fixadas com ácido tricloroacético (TCA) a 50%, coradas pelo método de Sulforrodamina B e ressuspendiadas em solução de Trizma base para leitura da absorbância em ELISA - Enzyme-Liked ImmunoSorbent Assay (Skehan et al, 1990). As amostras utilizadas nos ensaios, devidamente liofilizadas, foram compostas por dois grupos: (1) Tratado e (2) Não Tratado, onde o grupo Não Tratado foi representado pelos Controles I e II e a própria substância-teste. As fotos da Figura 5.4 mostram as MCF- 7 Bus na ausência e na presença de E2 (estradiol), após as 144 horas de incubação e fixação com TCA.

Figura 5.3: Esquema do Teste E-screen

Figura 5.4: Linhagem MCF-7 Bus na Ausência (esquerda) e na Presença de Estradiol – E2 (direita)

(Imagem de: Giovanna Fiorito. Objetiva 20X)

Testes preliminares de citoxicidade foram realizados com a substância-teste a fim de determinar a melhor concentração-resposta para as células MCF-7 Bus. Tal teste, conhecidos como Antiproliferativo, segue o protocolo descrito acima, porém expõe as células às concentrações variadas da substância-teste alcançadas por meio de diluição seriada, sendo empregado o intervalo de concentração de 250 a 0,25 g.mL-1_.

Os ensaios do teste E-screen foram realizados nos laboratórios da Divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA – UNICAMP e obedeceram a todos os procedimentos para uso de material biológico, como uso de equipamento de proteção individual e cuidados para manutenção do ambiente estéril. A execução dos ensaios foi realizada por profissional da área devidamente treinado sob supervisão da autora desse trabalho.

5.6 Encapsulação e Imobilização Enzimática – Etapa 04

A Etapa 04 foi destinada às atividades de imobilização da enzima responsável pelos processos de degradação, sendo, portanto selecionada nas etapas anteriores.

Os ensaios foram realizados em duas partes principais, as quais são descritas a seguir:

a) Produção da Enzima: foram realizados ensaios com o fungo selecionado em triplicata, em meio de cultura líquido PDB na condição estática a 30ºC. Usou-se Erlenmeyers de 1000 mL com volume útil de 300 mL. Análises enzimáticas a cada três dias garantiram a identificação do ótimo enzimático;