Outro objectivo deste estudo é comparar os fenótipos intermédios bioquímicos antes e depois da terapêutica anti-viral, para melhor avaliar a extensão da resposta e a eficácia da terapêutica. Para isso, consideraram-se apenas os indivíduos com RVS, independentemente do genótipo do TNF-α (N=290).
Como seria desejável, depois de realizada a terapêutica anti-viral, a carga viral diminui drasticamente (p=0,000). Este resultado parece comprovar a eficácia do terapêutica com IFN-α PEG e RBV. No entanto, os estudos de associação (GWAS) de Tanaka et al, demonstraram que os tratamentos não geram RVS em todos os doentes (tratamentos de 48 semanas apenas são eficazes em 42-52% dos doentes com VHC-1, por exemplo) (Tanaka et al, 2009).
Observaram-se diferenças estatisticamente significativas para os enzimas hepáticos (FA, AST, ALT, GT) (p=0,015, p=0,000, p=0,000, p=0,000) (Tabela 20), que diminuem após da terapêutica. A normalização dos níveis séricos das transaminases é um indicativo de uma RVS e da eficácia da terapêutica anti-viral (Kim et al, 2012). No entanto, nem sempre se observa. Os estudos de Su et al, que tiveram como objectivo determinar a incidência de níveis de transaminases anormais persistentes, apesar da eliminação do VHC-RNA durante a terapêutica anti-viral, mostram que em aproximadamente 42% dos doentes estudados, apesar de, eventualmente, ser atingida uma RVS após terapêutica com IFN-α PEG e RBV, a normalização bioquímica foi
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retardada. Essa resposta bioquímica tardia parece estar associada com o estadio de fibrose hepática basal e cirrose hepática (Su et al, 2009).
Relativamente ao perfil lipídico dos doentes, observa-se um aumento do número de indivíduos com colesterol total e razão HDL/LDL elevados e triglicéridos abaixo do valor de referência depois da terapêutica (p=0,001, p=0,012 e p=0,000, respectivamente). Apesar de não ser significativo, observa-se uma tendência para um aumento de indivíduos com níveis normais de HDL depois da terapêutica (p=0,086) (Tabela 18).
Tendo em conta que existe uma relação entre a esteatose hepática e os níveis séricos de triglicéridos hepatocelulares (Poynard et al, 2003), é razoável assumir que o decréscimo dos seus níveis depois da terapêutica se deva à melhoria do grau de esteatose do doente (Fierbinţeanu-Braticevici et al, 2009). No entanto, ao analisar as características fisiopatológicas dos doentes, antes e depois da terapêutica anti-viral, não se observaram diferenças estatisticamente significativas nos graus de esteatose hepática. Idealmente, para esta análise, separar-se-iam os indivíduos consoante o genótipo do vírus, consoante a sua sensibilidade ou resistência à terapêutica (VHC-1 vs. VHC-3) e comparar-se-iam as características fisiopatológicas antes e depois da terapêutica anti- viral. Contudo, não foi possível fazer esta análise devido à insuficiência de dados, não havendo indivíduos suficientes na população em estudo para a realizar.
Relativamente às restantes características fisiopatológicas, passíveis de serem analisadas, observa-se uma diferença estatisticamente significativa (p=0,009) para a fibrose avaliada por FibroScan, observando-se uma clara melhoria em 22 indivíduos, que passam a ter estadios menos graves de fibrose (moderada ou ligeira) (Tabela 19). Este resultado está de acordo com os estudos de Martinez et al, que observaram a diminuição da fibrose durante e depois da terapêutica anti-viral em respondedores e recidivas, o que sugere uma melhoria da lesão hepática (Martinez et al, 2012).
Para a fibrose, avaliada por biópsia hepática, no entanto, não se observam diferenças estatisticamente significativas (p>0,05), antes e depois da terapêutica anti- viral, bem como também não se observaram diferenças significativas para a necrose hepatocelular e inflamação (Tabela 19).
Para averiguar se as diferenças encontradas no grupo de respondedores se devem ao genótipo do TNF-α, e em particular, ao polimorfismo -308, seleccionaram-se somente os indivíduos GG (N=32). As diferenças encontradas na carga viral e nas transaminases antes e depois da terapêutica mantêm-se e observa-se ainda uma
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tendência (p=0,082) para o aumento do ferro depois da terapêutica (Tabela 20). O que é consistente com o esperado uma vez que sabemos que a ribavirina causa alterações no metabolismo do ferro (Jafroodi et al, 2010). O ferro está igualmente associado ao controlo da saída do colesterol da célula, pelas HDL, e tem um papel importante no funcionamento das mitocôndrias.
Ao seleccionar os indivíduos respondedores com alelo mutante (GA+AA), as diferenças na carga viral e enzimas hepáticos AST, ALT e GT também se observam (excepto para a FA, p=0,950) e observam-se diferenças estatisticamente significativas também para os triglicéridos, que aumentam após a terapêutica (p=0,044) (Tabela 21). Desta forma, não é possível estabelecer uma relação entre os parâmetros estudados e o genótipo do TNF-α.
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6. Conclusões
Para o polimorfismo -238 G>A não se observaram quaisquer diferenças na variação dos parâmetros estudados o que indica que não existe qualquer associação entre a variante polimórfica neste codão e a duração e resposta à terapêutica da HCC.
Vários factores demonstraram que o polimorfismo -308 afecta a resposta anti- viral. O aumento significativo de indivíduos com resposta viral sustentada nos portadores do alelo mutante (-308A), a alteração nos níveis basais de ALT e o facto dos indivíduos portadores do alelo mutante (GA+AA) não terem maior incidência de VHC- 3, parecem sugerir que a presença do alelo raro leva a uma melhoria na resposta.
Alguns fenótipos intermédios bioquímicos parecem influenciar a resposta à terapêutica, como a idade, a carga viral, os níveis das transaminases e das HDL. Relativamente às características fisiopatológicas, foram observadas diferenças entre RS e NR/RR nos estadios de fibrose, o que comprova a sua importância ao nível da lesão hepática.
Avaliando as diferenças na variação dos parâmetros antes e depois da terapêutica, podemos concluir que a terapêutica anti-viral leva a um decréscimo da carga viral, dos níveis das transaminases e a alterações no perfil lipídico bem como a melhorias na fibrose e esteatose hepática, claros indicadores de melhoria da lesão hepática e do sucesso da terapêutica com IFN-α PEG e RBV. No entanto, não foi possível estabelecer uma associação entre estes parâmetros e o polimorfismo na posição -308.
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7. Referências Bibliográficas
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63
ANEXOS
ANEXO I
A) Valores e intervalos de referência dos parâmetros estudados
Tabela 22 – Valores e intervalos de referência dos parâmetros estudados.
Estudo Parâmetro Valor/Intervalo de Referência
Parâmetros
demográficos IMC (Kg/m
2
) < 25
Carga Viral VHC-RNA (UI) ≤ 600
Enzimas hepáticos Fosfatase Alcalina (µg/dL) 20 – 140 AST (UI/L) 0 – 34 ALT (UI/L) 10 – 49 Gama GT (UI/L) < 38 Perfil Lipídico HDL (mmol/L) > 1,04 LDL (mmol/L) < 2,6 Triglicéridos (mmol/L) < 1,7 Colestesterol Total (mmol/L) < 54,92 Metabolismo do ferro Ferro (µg/dL) F (37-145) ; M (61-157)ª Transferrina (µg/dL) 200-360 Ferritina (ng/mL) F<50 (15-150); M + F≥50 (30-400)b Saturação (%) ≤ 50 Níveis de insulina e glucose Insulina (μU/mL) 2,6 - 24,4 Glicémia (mg/dL) < 110 HOMA (μU/mL.mg/dL) ≤ 2
ª Ferro: avaliado de forma diferente para mulheres (F) e homens (M). b
Ferritina: avaliada nas mulheres com idade inferior a 50 anos (F<50). As mulheres em idade de menopausa (>50 anos) são avaliadas no mesmo intervalo dos homens (M + F≥50).
B) Cálculo de alguns parâmetros clínicos estudados çã
64 ANEXO II
Protocolo Experimental: Extracção de DNA pelo método de salting-out
1. O sangue periférico é colhido num tubo com anticoagulante EDTA. 2. Transfere-se 2mL para um tubo rolhado e graduado de 10mL.
3. Adiciona-se 1 volume de TKM X-100 tendo o cuidado de adicionar parte deste tubo onde a amostra foi colhida de forma a evitar desperdícios de sangue.
4. Adiciona-se 50mL de IPGEPAL CA 630 por cada mL de sangue, com o objectivo de lisar as células, com consequente libertação de DNA e outros constituintes celulares.
5. O tubo é agitado 4-5 vezes por inversão vigorosa.
6. Segue-se uma centrifugação a 2200rpm, à temperatura de aproximadamente 4ºC, durante 15min, que deve ser repetida caso o pellet formado não adira ao fundo do tubo.
7. O sobrenadante é rejeitado e ao pellet que contém, entre outros constituintes, o DNA, é adicionado 2mL de tampão TKM 1 por cada mL de sangue.
8. Centrifuga-se à mesma temperatura, a 1600rpm e por um período de 10min e são repetidos os passos de rejeição do sobrenadante e adição de tampão TKM 1. 9. O passo anterior é repetido no máximo 2 vezes, de forma a obter um pellet
branco, evitando assim perdas excessivas de DNA.
10. Ressuspende-se o pellet (vórtex) na solução TKM 2 numa proporção de 160mL de tampão por mL de sangue.
11. Adiciona-se 20mL de SDS 10% por mL de sangue e a mistura é ressuspendida com o auxílio de uma micropipeta. Este reagente dissolve as proteínas ainda existentes em solução.
12. Incuba-se a 55ºC durante 10min.
13. Ao fim deste intervalo de tempo o conteúdo do tubo é transferido para um