Avaliação dos níveis basais de TNFA

Neste ensaio foram avaliadas amostras de 47 mulheres do grupo controle, 39 pacientes com DG, 10 com DM1 e 11 com DM2. Os resultados observados estão apresentados a seguir (Figura 24).

Resultados 47 Controle DG DM1 DM2 0 500 1000 1500

T

N

F

A

(p

g/

m

L)

Figura 24 - Níveis de TFNA em sobrenadantes de cultura de linfócitos (sem estímulo - basal) de pacientes do grupo controle (C), diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2)

Não houve diferença significante nos níveis basais de TNFA entre os grupos (C x DG: 37,57 pg/mL x 39,28 pg/mL, p=0,95; C x DM1: 37,57 pg/mL x 17,04 pg/mL, p=0,17; C x DM2: 37,57 pg/mL x 37,58 pg/mL, p=0,50; DG x DM1: 39,28 pg/mL x 17,04 pg/mL, p=0,27; DG x DM2: 39,28 pg/mL x 37,58 pg/mL, p=0,52; DM1 x DM2: 17,04 pg/mL x 37,58 pg/mL, p=0,20 – teste Mann-Whitney) (Figura 24).

Tabela 10 - Níveis basais de TNFA em sobrenadante de cultura de linfócitos de pacientes controle (C) e com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC pré-gestacional

TNFA (pg/mL) C DG DM1 DM2 IMC<25 N=31 37,57 N=9 60,33 N=7 19,93 N=2 IMC≥β5 N=16 67,3 N=30 32,90 N=3 14,15 N=9 36,57

Resultados 48 0 10 20 30 40 50 60 70 Controle DG DM1 DM2 T N FA ( pg /mL) IMC < 25 IMC ≥ β5

Figura 25 - Níveis basais de TNFA em sobrenadante de cultura de linfócitos de pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC

Agrupamos as pacientes de acordo com IMC pré-gestacional em duas categorias: não obesas (<25 kg/m2) e obesas (≥β5 kg/m2_{). Analisando cada grupo individualmente,} isto é, controles, DG, DM1 e DM2, não foram identificadas diferenças significantes quanto aos níveis basais de IL-6 quando comparadas gestantes eutróficas e obesas (IMC<β5 x IMC≥β5: C – 37,57 pg/mL x 67,30 pg/mL, p=0,25; DG – 60,33 pg/mL x 32,90 pg/mL – p=0,19; DM1 – 19,93 pg/mL x 14,15 pg/mL – p=0,83) (Tabela 10 e Figura 25).

No grupo DM2 não foi possível fazer esta análise devido ao pequeno número de pacientes com IMC<25 (Tabela 10 e Figura 25).

Confrontando os grupos C, DG, DM1 e DM2 entre si não identificamos diferença nos níveis de TNFA entre pacientes dos diferentes grupos com IMC <25 e de pacientes com IMC≥β5 (teste Mann-Whitney) (Figura 26).

p=0,25*

p=0,19*

p=0,83*

Resultados 49 0 10 20 30 40 50 60 70 Controle DG TN FA ( pg /mL) IMC < 25 IMC ≥ β5 0 10 20 30 40 50 60 70 Controle DM1 TN FA ( pg /mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 Controle DM2 TN FA ( pg /mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 DG DM1 TN FA ( pg /mL) IMC < 25 IMC ≥ β5 0 10 20 30 40 50 60 70 DG DM2 TN FA ( pg /mL) IMC < 25 IMC ≥ β5 0 10 20 30 40 DM1 DM2 TN FA ( pg /mL) a) C x DG b) C x DM1 c) DG x DM1 d) C x DM2 e) DG x DM2 f) DM1 x DM2

Figura 26 - Comparação dos grupos C, DG, DM1 e DM2 entre si quanto aos níveis séricos de TNFA basais de acordo com IMC pré-gestacional

p=0,17 p=0,32 p=0,53 p=0,14 p=0,86 p=0,17 p=0,53 p=0,63 p=0,40

Resultados 50 GG GA+AA 0 500 1000 1500 T N F A (p g/ m L)

Para avaliar a relação genótipo/fenótipo distribuímos as pacientes de acordo com o padrão de expressão funcional para o polimorfismo de TNFA -308 G/A em dois subgrupos GG e GA+AA e avaliamos o nível de TNFA nestes grupos.

Quando avaliamos as pacientes controle, não notamos correlação entre as variáveis (genótipo e fenótipo) (GG x GA+AA: 35,55 pg/mL x 132,32 pg/mL, p=0,10) (Figura 27a).

Como nos grupos DG e DM1 não foram identificadas pacientes com genótipo AA, a comparação foi realizada entre os casos GG e GA (GG x GA – DG: 36,23 pg/mL x 80,71 pg/mL, p=0,19; DM1: 12,79 pg/mL x 33,68 pg/mL, p=0,48) (Figura 27b,c).

No grupo DM2 não foi possível fazer esse cálculo devido ao pequeno número de pacientes avaliadas.

a) Grupo C b) Grupo DG

c) Grupo DM1

Figura 27 - Avaliação de TNFA em pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2): níveis basais e distribuição das frequências genotípicas do polimorfismo -308 de TNFA

p=0,10 – teste Mann-Whitney p=0,19 – teste Mann-Whitney

p=0,48 – teste Mann-Whitney GG GA 0 200 400 600 800 1000 T N F A (p g/ m L) GG GA 0 50 100 150 200 T N F A (p g/ m L)

51 4 DISCUSSÃO

Discussão 52

Este estudo incluiu a investigação de mediadores inflamatórios (adiponectina, IL- 10, IL-6 e TNFA) em diferentes formas de diabetes (DG, DM1 e DM2), além da análise genética avaliamos a expressão fenotípica destes fatores.

Apesar dos grandes avanços observados na Medicina, ainda não se conseguiu definir o papel da inflamação no desenvolvimento do diabetes. No caso de DM1, a reação inflamatória é localizada e parece estar relacionada à produção de auto- anticorpos dirigidos às células beta pancreáticas. Este processo torna-se mais intenso a medida que a doença evolui. Em contrapartida, no DM2 a inflamação parece ser sistêmica, e associada à obesidade e à resistência à insulina. Esta reação inflamatória pode ter início na fase caracterizada por diminuição da tolerância à glicose, antes mesmo que ocorra a manifestação da doença (King, 2008; Goldberg, 2009). Como muitas mulheres que apresentam DG posteriormente manifestam DM2, acredita-se que as duas condições envolvam mecanismos fisiopatológicos semelhantes (Bentley-Lewis et al., 2008). Tal como no DM2, no DG há aumento exacerbado da resistência à insulina (American Diabetes Association, 2007).

Além de alterações metabólicas, a gestação induz uma série de modificações da resposta imune tanto local como sistêmica. Estas adaptações fisiológicas podem propiciar ou agravar o desenvolvimento de manifestações hiperglicêmicas.

O objetivo deste estudo foi caracterizar a participação de mediadores inflamatórios nas diferentes formas de diabetes. Para tanto, procuramos determinar se polimorfismos relacionados aos genes codificadores de Adiponectina, IL-10, IL-6 e TNFA estão associados à ocorrência de DG, DM1 e DM2. E ainda, avaliar nestes mesmos grupos de pacientes a expressão destes fatores inflamatórios durante o terceiro trimestre gestacional.

A definição clara dos grupos de estudo é ponto crucial para uma investigação de qualidade. Com frequência pacientes diabéticas apresentam diversas manifestações clínicas, e é particularmente comum casos de associação entre diabetes e hipertensão/pré-eclampsia. Nesta pesquisa tivemos o cuidado de incluir apenas casos de diabetes sem outras alterações sistêmicas ou obstétricas, com isso tivemos dificuldades para compor os grupos de estudo. Conseguimos reunir um número razoável de pacientes com DG, mas não tão expressivo de gestantes com DM1 e DM2.

Discussão 53

Outro aspecto relevante nas avaliações genéticas é a caracterização racial. Esta é uma questão bastante complexa, até mesmo pela própria dificuldade de se classificar corretamente os diferentes grupos étnicos, especialmente em população miscigenada como a brasileira (Pena et al., 2000; Santos, Maio, 2004). Para tentar minimizar ao máximo os efeitos da variável etnia, nesta investigação pareamos os grupos quanto à distribuição racial auto-relatada,

Nossos resultados não apontaram nenhuma associação entre diferentes formas clínicas de diabetes: DG, DM1 e DM2 e qualquer um dos polimorfismos genéticos analisados (Adiponectina +45 e -11377, IL-10 -1082, IL-6 -174 e TNFA -308). Quanto à expressão destes mediadores inflamatórios, observamos importantes diferenças na produção de adiponectina quando comparamos os grupos de diabetes entre si. Entretanto, não pudemos constatar alterações significantes nos níveis de IL-10, IL-6 e TNFA nestes mesmos grupos de estudo.

Realizamos o teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg para todos os polimorfismos avaliados. Em todos os grupos analisados as frequências encontradas estavam em equilíbrio com os valores esperados. Além de sugerir que não houve viés na seleção das pacientes, esta análise representa um controle de qualidade do estudo.

A grande maioria dos estudos que envolvem a avaliação genotípica ou fenotípica de mediadores inflamatórios em gestantes diabéticas é voltada apenas ao diabetes gestacional. Dentro deste cenário, o número de pesquisas que investigam a relação entre polimorfismos genéticos de mediadores inflamatórios e a ocorrência do diabetes ainda é relativamente pequeno. Por um lado este é um ponto positivo do nosso estudo, por outro lado dificulta a discussão de nossos achados, uma vez que em estudos genéticos a revalidação de resultados é fundamental.

Até o momento, existem poucas investigações relativas ao polimorfismo genético de IL-10 em diabetes. Resultados similares aos nossos foram observados tanto em casos de DM1 (Reynier et al., 2006; Kumar et al., 2007; Settin et al., 2009), quanto de DG (Montazeri et al., 2010). Em relação ao DM2 os estudos publicados sugerem associação com a forma clínica, mas não com a ocorrência da doença em si (Tsiavou et al., 2004; Kolla et al., 2009).

Assim como em nosso estudo, outras investigações também não identificaram alterações dos níveis de IL-10 em pacientes com DG (Georgiou et al., 2008; Montazeri

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et al., 2010). Não encontramos publicações referentes às concentrações desta citocina em gestantes com DM2. Entretanto, a avaliação em portadores de DM2 de modo geral sugere que níveis aumentados de IL-10 estão associados a menores riscos de complicações da doença (Lee et al., 2008). Em relação ao DM1, é difícil comparar os resultados observados dado às diferenças metodológicas entre os estudos. Em indivíduos com DM1, enquanto um grupo de investigadores demonstrou aumento de IL- 10 em cultura de linfócitos pós estimulo, e outro não achou diferença nos níveis séricos das pacientes comparados a controles (Alizadeh et al., 2006; Foss et al., 2007). Pertynska-Marczewska et al. (2010) avaliaram a produção de IL-10 ao longo da gestação em pacientes com DM1. Os resultados obtidos revelaram que os níveis de IL- 10 em sobrenadante de cultura pós estímulo diminuem com a evolução da gravidez, enquanto que em gestação saudável, esses níveis aumentam. Entretanto, quando foram comparadas as concentrações de IL-10 pós estimulo no terceiro trimestre da gestação entre DM1 e controle, não foi observada diferença significante. Esse resultado está de acordo com o nosso achado, pois avaliamos pacientes no mesmo período gestacional e também não detectamos diferença nos níveis de IL-10 entre DM1 e controle.

Nesta pesquisa não foi identificada associação entre o polimorfismo -174 do gene IL-6 e qualquer uma das formas de diabetes. É particularmente difícil discutir estes resultados porque não existem relatos quanto à investigação deste polimorfismo no DG. Além disso, as pesquisas realizadas em diabéticos parecem ser mais voltados à avaliação desta variante genética com complicações relacionadas ao diabetes do que com o desenvolvimento da doença em si (Libra et al., 2006; Ng et al., 2008; Raunio et al., 2009; Rudofsky et al., 2009).

Os resultados quanto à associação desse polimorfismo e o DM2 são controversos. Alguns investigadores sugerem que o alelo G está relacionado ao maior risco da doença, outros indicam que o alelo C que apresenta este efeito. Outros, tal como em nosso estudo, não encontraram associação entre este polimorfismo de IL-6 e o DM2 (Vaxillaire et al., 2008; Huth et al., 2006; Vozarova et al., 2003; Herbert et al., 2005; Chang et al., 2004). Da mesma forma, os dados obtidos na avaliação deste polimorfismo de IL-6 e DM1 são contraditórios. Assim como neste estudo, Kumar et al. (2007) não observaram associação entre esta variante genética e a doença. Por outro lado, Jahromi et al. (2000) identificaram maior frequência do genótipo GG em DM1,

Discussão 55

enquanto o grupo de Settin et al. (2009) observou o oposto, isto é, maior frequência de CC neste tipo de paciente.

De modo geral, não existem muitas investigações a respeito da relação IL-6 e diabetes, principalmente durante a gravidez. Nosso estudo não demonstrou qualquer alteração na produção desta citocina em gestantes, independente do tipo de diabetes analisado. Não encontramos estudos dessa molécula em grávidas com DM2, apenas em casos de DG e DM1. Em relação a DG, apesar de alguns estudos terem encontrado resultados similares aos nossos (Georgiou et al., 2008; Abdel Gader et al., 2010), outros investigadores demonstram maior produção desta citocina nestas gestantes (Kuzmicki et al., 2008).

Algumas investigações realizadas em portadores de DM sugerem que o aumento da expressão de IL-6 está relacionado tanto ao DM1 quanto ao DM2 (Devaraj et al., 2006; Tsiotra et al., 2007; Lee et al., 2008). Entretanto, assim como nesta pesquisa, Loukovaara et al. (2005) não identificaram diferenças quanto ao nível plasmático desta citocina em gestantes DM1 quando comparadas a controles. Ainda neste contexto, o estudo de Pertynska-Marczewska et al. (2010) foi diferente. Estes investigadores avaliaram a expressão de IL-6 em cultura de neutrófilos estimulada por LPS no decorrer da gestação. Observaram que em pacientes saudáveis os níveis de IL-6 tendiam a diminuir, e que o contrário ocorria nas gestantes DM1, estas diferenças alcançavam significância no terceiro trimestre da gestação. Nossos resultados são opostos, pois no mesmo período gestacional, ainda que não tenha sido significante, as pacientes controles apresentaram maiores níveis de IL-6 do que as DM1. Essa divergência de resultado pode ser devida às diferenças metodológicas ou ao tamanho amostral

Dentre o painel de polimorfismos analisados o de TNFA na posição -308 é um dos mais estudados em casos de DM1. Em contraposição aos nossos achados, a maioria das investigações sugere associação entre o alelo A e a ocorrência de DM1 (Das et al., 2006; Deja et al., 2006; Kumar et al., 2007; Boraska et al., 2008; Shin et al., 2008; Feng et al., 2009; Settin et al., 2009). O número de pacientes com DM1 foi bastante reduzido, particularmente para análise de polimorfismos genéticos. É bastante provável que as discordâncias encontradas entre nossos resultados e os demais sejam decorrentes das diferenças de tamanho amostral, pois em nosso estudo, apesar de não

Discussão 56

significante notamos a mesma tendência. Isto é, as pacientes com DM1 também apresentaram maior frequência do alelo A quando comparadas com as controles.

Existem poucos estudos que avaliam a relação do polimorfismo -308 do gene codificador de TNFA e DM2, mas como o nosso, sugerem que não há associação entre o polimorfismo e a doença (Shiau et al., 2003; Kim et al., 2006). Em relação ao DG, existem controvérsias. Assim como nesta pesquisa, Montazeri et al. (2010) também não acharam associação entre esse polimorfismo e DG, enquanto outros investigadores encontraram (Chang et al., 2005).

Na população de diabéticos, de modo geral, os níveis de TNFA parecem estar relacionados tanto com DM1 quanto com DM2 (Bertin et al., 2000; Vitali et al., 2000; Tsiotra et al., 2007). Não foram encontrados estudos dessa citocina em gestantes DM2 e apenas um em DM1. Contrariamente aos nossos resultados, Pertynska-Marczewska et al. (2010) observaram aumento significante das concentrações de TNFA no terceiro trimestre da gestação em pacientes com DM1 em relação as controles. No nosso estudo, apesar de não significante, as pacientes DM1 parecem ter menos TNFA do que as controle. Vale ressaltar que além das diferenças metodológicas, o número de pacientes analisadas foi relativamente pequeno.

Não observamos diferenças na produção de TNFA em pacientes com DG. Apesar de alguns investigadores também não encontrarem diferenças nas concentrações desta citocina em DG quando comparadas com controle, outros observaram aumento da expressão dessa molécula em gestantes com DG (Gao et al., 2008; Georgiou et al., 2008; Montazeri et al., 2010).

A identificação do tecido adiposo como órgão endócrino, e o reconhecimento de sua participação nas interações imunológicas tem aumentado de forma significante o interesse na investigação das adipocinas em doenças metabólicas. Neste sentido destaca-se a relação obesidade-DM2/DG.

Existem diversos estudos voltados à avaliação de polimorfismos +45 e -11377 do gene codificador de adiponectina em casos de DM2, entretanto os resultados são bastante controversos. Em concordância com nossos achados, alguns investigadores não encontraram associação entre o polimorfismo +45 do gene da adiponectina e DM2 (Populaire et al., 2003; Lee et al., 2005). Por outro lado, resultados positivos foram relatados: alguns sugerindo associação entre esses polimorfismos dois polimorfismos e

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DM2 (Populaire et al., 2003; Gu et al., 2004; Zacharova et al., 2005; Yang et al., 2008; Mohammadzadeh, Zarghami, 2009), enquanto outros só identificaram relação com a resposta ao tratamento da doença (Sun et al., 2008).

O número de estudos genéticos em DG ainda é muito reduzido. Dentre os polimorfismos que analisamos, encontramos apenas uma pesquisa que como esta avaliou o polimorfismo +45 do gene da adiponectina. Entretanto, em oposição aos nossos achados, Low et al. (Low et al., 2010) identificaram associação entre este polimorfismo e DG. Estes dados precisam ser reavaliados, considerando-se que além da diferença étnica, o nosso grupo de estudo foi praticamente três vezes maior.

Precisamos também comprovar nossos resultados em relação à avaliação de polimorfismos genéticos do gene codificador de adiponectina em DM1. Até o momento, este parece ser o primeiro trabalho que aborda esta questão.

A relação entre adiponectina, obesidade e DM2 já está bem estabelecida. Nas duas condições tem sido observado baixo nível sérico de adiponectina (Kouidhi et al., 2010; Nayak et al., 2010). Entretanto, a grande maioria dos estudos inclui apenas a avaliação de pacientes com DG, e não avaliam gestantes com outra forma de diabetes. A relação entre DG e hipoadiponectinemia já está bem estudada (Soheilykhah et al., 2009; Retnakaran et al., 2010). Nossos achados foram semelhantes aos da literatura. Pacientes com DM2 e DG apresentaram níveis séricos de adiponectina menores do que as gestantes controle.

Quanto às gestantes com DM1, nossos resultados não mostraram diferenças na produção de adiponectina quando comparadas aos controles. Randeva et al., (2006) observou aumento dos níveis deste mediador em gestantes com DM1 quando comparadas com grávidas saudáveis. Apesar de nosso resultado não ter sido significante, observamos a mesma tendência: as gestantes com DM1 apresentaram maiores concentrações de adiponectina do que as controles. Por sua vez, identificamos aumento significante dos níveis de adiponectina em gestantes DM1 tanto quando comparadas com DG como com DM2. Não encontramos estudos confrontando DM1 com DG, mas nossos resultados são similares aos relatados por outros investigadores quanto à comparação entre DM1 e DM2 (Ljubic et al., 2009).

Quando comparamos os níveis de adiponectina entre si, dentro de cada grupo de gestantes obesas e não obesas, foi observada diferença significante nos grupos

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controle e DG. Estes resultados são concordantes com os dados de literatura, e confirmam o papel importante da adiponectina na obesidade. Infelizmente, não foi possível avaliar esta questão nas gestantes DM2, porque a maioria das pacientes era obesa.

Um dos achados mais importantes do nosso estudo foi a identificação de que os níveis de adiponectina são menores em gestantes com DG e DM2 do que em controles, mesmo quando comparadas as pacientes eutróficas entre si. Estes resultados são sugestivos de que a adiponectina tenha uma participação crítica na fisiopatologia do diabetes, independente do grau de adiposidade da paciente. Um único estudo recentemente publicado trás o mesmo tipo de resultado (Mazaki-Tovi et al., 2009). De todo modo, é um ponto intrigante que merece maiores investigações.

Os mediadores inflamatórios avaliados foram escolhidos por sua plausibilidade biológica. A partir desta escolha procuramos selecionar polimorfismos genéticos relacionados a estas moléculas que apresentassem expressão funcional. Avaliamos a correlação entre genótipos e fenótipos para todos os mediadores e em todos os grupos de estudo e não identificamos resultados significantes. Exceção foi o polimorfismo - 11377 do gene da adiponectina, neste caso notamos relação entre genótipo e fenótipo, especialmente no grupo controle. A correlação dessa variante com a expressão fenotípica da adiponectina ainda permanece controversa na literatura (Vasseur et al., 2002; Shin et al., 2006; Jang et al., 2008).

Acredita-se que o alelo G do polimorfismo -1082 do gene de IL-10 esteja associado há aumento na produção desta citocina (Stanilova et al., 2006), mas não conseguimos confirmar esse hipótese em nenhum dos grupos.

Vale destacar que no caso do polimorfismo de TNFA a correlação entre genótipo e fenótipo ficou no limite da significância. A substituição da base G por A no polimorfismo -308 do gene codificador de TNFA tem sido associada a maior produção de TNFA (Wilson et al., 1997). Interessante notar que com exceção de DM2, em todos os outros grupos a presença da base A esteve relacionada a aumento dos níveis de TNFA. É possível, portanto que aumentando o tamanho amostral essa associação se torne significante.

Trabalhos experimentais sugerem que o alelo C do polimorfismo -174 do gene de IL-6 está associado a menores níveis dessa molécula. Entretanto, nosso estudo assim

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com outros recentemente publicados não confirmam esta relação (Kiszel et al., 2007; Cacev et al., 2010). É importante ressaltar que em nossa investigação esta avaliação foi limitada ao grupo de DG, e ainda que não tenha alcançado significância, o genótipo CC parece estar relacionado a menores níveis de IL-6.

A comprovação da expressão funcional de polimorfismos genéticos é uma questão complexa que gera discussões. A dificuldade em se confirmar associações entre variantes genéticas e nível de produção de mediadores está relacionada às variáveis envolvidas nos protocolos técnicos. Assim, alterações em tempo de cultura, tipo de estímulo ou tempo de manuseio das amostras podem afetar os resultados. Com frequência as correlações entre genótipos e fenótipos só conseguem ser reproduzidas em modelos experimentais específicos.

Um ponto forte do nosso estudo foi que além da doença em si, procuramos avaliar diferenças entre as três formas mais comuns de DM: DG, DM1 e DM2. Existem poucos estudos na literatura que abordam esta questão (Giulietti et al., 2004; Tsiavou et al., 2004). Não encontramos nenhuma associação entre os polimorfismos estudados quando as três formas de DM foram comparadas entre si (resultados não mostrados). Em relação à expressão das citocinas, também não encontramos diferenças quando as três formas de diabetes foram comparadas. Guilietti et al. (2004) observaram maior expressão de TNFA em DM2 quando comparado com DM1, mas também não mostraram diferenças em IL-10 e IL-6.

Observamos diferença em relação aos níveis de adiponectina entre as três formas de diabetes, sugerindo a participação deste mediador na fisiopatologia destas doenças,