BÁRBARA YASMIN GUEUVOGHLANIAN SILVA
AVALIAÇÃO DE MEDIADORES DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA EM GESTANTES DIABÉTICAS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
BÁRBARA YASMIN GUEUVOGHLANIAN SILVA
AVALIAÇÃO DE MEDIADORES DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA EM GESTANTES DIABÉTICAS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Silvia Daher
Co-orientadora: Profa. Dra. Rosiane Mattar
Silva, Bárbara Yasmin Gueuvoghlanian
Avaliação de mediadores da resposta inflamatória em gestantes diabéticas. /Bárbara Yasmin Gueuvoghlanian Silva. -- São Paulo, 2010.
xv, 150f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em Obstetrícia.
Título em inglês: Evaluation of inflammatory response mediators in diabetics pregnant women.
1. Diabetes. 2. Gestação. 3. Inflamação. 4. Polimorfismo genético. 5. Citocinas. 6. Adiponectina.
Silva, Bárbara Yasmin Gueuvoghlanian
Avaliação de mediadores da resposta inflamatória em gestantes diabéticas. /Bárbara Yasmin Gueuvoghlanian Silva. -- São Paulo, 2010.
xvi, 151f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em Obstetrícia.
Título em inglês: Evaluation of inflammatory response mediators in diabetics pregnant women.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO DEPARTAMENTO DE OBSTETRÍCIA
Chefe do Departamento de Obstetrícia: Profa. Dra. Rosiane Mattar
iv Dedicatória
À minha mãe, Dora Gueuvoghlanian, Toda a dedicação, luta e perseverança nunca serão esquecidos.
Graças a ela eu estou aqui hoje.
Ao meu pai, José Augusto Pereira da Silva, Pela garra de fazer com que nunca nos faltasse nada.
Aos meus irmãos, Diego, Isabela e João Augusto,
Mais velhos ou mais novos, Não se pode explicar a sensação do aconchego de um irmão.
Ao meu companheiro, Kauê Milanez Lopes, Pelos ombros, ouvidos e abraços.
E por nunca me deixar desistir!
“A mente que se abre a uma nova idéia
jamais voltará ao seu tamanho original.”
v
Agradecimentos
Ao Departamento de Obstetrícia da Universidade Federal de São Paulo, pela oportunidade de realizar este trabalho de pós-graduação neste Departamento.
À Profa. Dra. Silvia Daher, por ter me orientado neste trabalho, pelo conhecimento compartilhado, pela confiança, paciência, dedicação, amizade e por ter me mostrado como fazer pesquisa com alegria. Tudo o que aprendi valerá para a vida toda, não só na ciência.
À Profa. Dra. Rosiane Mattar, chefe do departamento de Obstetrícia e co-orientadora deste trabalho, por ter aceitado também me orientar, pelo apoio dado, pela ajuda e amizade essenciais para a minha formação.
Ao Prof. Dr. Nelson Sass, coordenador do programa de pós-graduação, pelas oportunidades e ajuda com o caminhar deste trabalho, sempre abrindo suas portas.
À Profa. Dra. Maria Regina Torloni, por ter feito parte dessa tese desde o início até o fim, me ajudou muito em todos os momentos.
À Profa. Dra. Sandra Maria Alexandre e à Profa. Dra. Mary U. Nakamura, por terem aberto às portas do ambulatório de pré-natal e às enfermeira de lá que muito me auxiliaram.
Aos professores, médicos e enfermeiras do Centro de Diabetes por me ajudarem sempre com as pacientes e dúvidas.
Às enfermeiras do Hospital-Maternidade Vila Nova Cachoeirinha por me receberem tão bem e sempre ajudarem com o que fosse preciso
vi
Ao laboratório do Prof. Dr. Reinaldo Salomão, por abrirem suas portas sempre com um sorriso no rosto, e em especial à Milena Brunialti, por toda ajuda e paciência.
Aos laboratórios de Nefrologia, em especial ao Marquinhos, pela paciência com todas as minhas perguntas e sempre estar disposto a ajuda no que fosse preciso, e à Cida, por me ensinar no início deste trabalho alguns conceitos essenciais para a realização desta pesquisa.
Ao laboratório de Gastroenterologia Pediátrica, por nunca hesitarem de compartilhar o deles conosco.
Ao Amador Gonçalves, que mesmo super atarefado, achava um tempinho para me ensinar ou explicar algo.
Aos queridíssimos amigos da turma 38 de biomedicina, pelas calorosas discussões por e-mail, sobre técnicas, artigos, política, e outras não tão importantes. Agradeço a cada um, que do seu modo contribuiu com essa tese, alguns com teorias, outros com práticas, ou só ouvindo e dando conselhos e outros até doando o seu sangue (literalmente!). O companheirismo que essa turma conquistou mesmo depois de formada é de se orgulhar. Meu muito obrigada!
Às minhas grandes amigas de laboratório, gostaria de agradecer a cada uma: Karen, Lilian, Joyce, Flávia, Camila, Priscilla, Patrícia, Gabriela por fazer o trabalho se tornar sempre mais gostoso, pelo companheirismo e amizade que fomos construindo com o tempo e que a cada dia se torna mais forte e verdadeira. E à todos os demais alunos de iniciação por sempre ajudarem a todos do laboratório. Gostaria de agradecer mais!
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro a este trabalho. Número do processo: 08/55888-8.
vii
À Rosinéa Gonçalves, secretária da pós-graduação, pelas várias ajudas ao longo de todo o mestrado, conselhos e amizade.
À minha família, pelo amor, carinho, compreensão e força ao longo de toda a minha vida.
Ao meu companheiro Kauê, pelo amor incondicional, apoio em todos os momentos e pela paciência incrível.
Agradeço aos demais professores e colegas, que de alguma forma me apoiaram ou ajudaram na realização deste trabalho.
viii Sumário
Dedicatória... iv
Agradecimentos... v
Lista de figuras... ix
Lista de tabelas... xii
Lista de abreviaturas e símbolos... xiii
Resumo... xvi
1INTRODUÇÃO... 1
1.1 Objetivo... 8
2 MÉTODOS... 9
3 RESULTADOS... 24
4 DISCUSSÃO... 51
5 CONCLUSÕES... 61
6 ANEXOS... 63
7 REFERÊNCIAS... 122 Abstract
ix
Lista de figuras
x
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -308 do gene TNFA. A = marcador de peso molecular (100pb), B e C = indivíduos com genótipo GG, D e E = indivíduos com o genótipo GA...20 Figura 11. Níveis séricos de adiponectina em pacientes do grupo controle (C), diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2)...32 Figura 12. Níveis séricos de adiponectina em pacientes do grupo controle (C) e com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2
(DM2) de acordo com IMC
pré-gestacional...33 Figura 13. Comparação dos grupos C, DG, DM1 e DM2 entre si quanto aos níveis
séricos de adiponectina de acordo com IMC
pré-gestacional...35 Figura 14. Avaliação de adiponectina em pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG) e diabetes mellitus tipo 1 (DM1): níveis séricos e distribuição das
frequências genotípicas do polimorfismo +45 de
xi
xii
Lista de tabelas
xiii
Lista de abreviaturas e símbolos
A – adenina
ADIPOR1 – receptor 1 de adiponectina ADIPOR2 – receptor 2 de adiponectina C – citosina
CD – cluster de diferenciação
CMSP – cultura de células mononucleares do sangue periférico CO2 – gás carbônico
CTAB – brometo de cetiltrimetilamônio DG – diabetes gestacional
dL – decilitro
DM – diabetes mellitus
DM1 – diabetes mellitus tipo 1 DM2 – diabetes mellitus tipo 2 DNA – ácido desoxirribonucléico
DTAB – brometo de dodeciltrimetilamônio EDTA – ácido etilenodiaminotetracético EHW – equilíbrio de Hardy-Weinberg
ELISA – enzyme linked immuno sorbent assay FA – frequência alélica
FBS – soro fetal bovino (fetal bovine serum) FG – frequência genotípica
xiv IFN- – interferon-
IL-10 – interleucina-10 IL-12 – interleucina-12 IL-13 – interleucina-13 IL-4 – interleucina-4 IL-5 – interleucina-5 IL-6 – interleucina-6
IMC – índice de massa corpórea Kg – quilograma
LPS – lipopolissacarídeo m2 – metro quadrado mg – miligrama mL – mililitro mmol – milimol N° -- número
NaCl – cloreto de sódio ng - nanograma
nm – nanômetro
OMS – organização mundial da saúde pb – pares de bases
PBS – tampão fosfato-salino (phophate buffered saline)
PCR – reação de polimerização em cadeia (polymerase chain reaction) pg – picograma
RFLP – polimorfismo por fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism)
xv rs – sequência de referência (reference sequence) T – timina
TGF- – fator transformador de crescimento- Th – célula T helper (auxiliadora)
TNFA – fator de necrose tumoral alfa UV – ultraviolet
V – volts
xvi Resumo
1
Introdução 2
O diabetes é um grupo de doenças metabólicas caracterizado por hiperglicemia resultante de alterações na secreção e/ou ação da insulina. A hiperglicemia crônica decorrente do diabetes mellitus (DM) provoca lesões, disfunção e falência de diversos órgãos, especialmente dos olhos, rins, nervos, coração e vasos sanguíneos (American Diabetes Association, 2007).
O diabetes se divide em duas grandes categorias, conforme sua etiopatogenia: o DM tipo 1 (DM1) e o DM tipo 2 (DM2), que representam 5-10% e 90-95% de todos os casos de diabetes, respectivamente. O DM1 se caracteriza por deficiência absoluta de insulina decorrente da destruição das células pancreáticas, enquanto o DM2 apresenta deficiência relativa de insulina acompanhada de resistência à ação periférica da insulina (American Diabetes Association, 2007). A maioria dos pacientes com DM2 é obesa, e acredita-se que a própria obesidade teria um papel importante no desencadeamento da resistência à insulina e no surgimento da doença (American Diabetes Association, 2007).
O diabetes gestacional (DG) é definido como intolerância à glicose de gravidade variável, que surgiu ou foi diagnosticada durante a gestação (World Health Organization, 1999). O DG seria decorrente da incapacidade do pâncreas materno atender à demanda crescente de insulina a partir do 2º trimestre da gestação (Buchanan et al., 2007). É condição que acomete 1 a 14% das gestantes, dependendo da população estudada e do critério diagnóstico utilizado (American Diabetes Association, 2007). Várias complicações maternas e perinatais têm sido associadas ao DG, incluindo maior risco para pré-eclampsia, macrossomia fetal, hipoglicemia neonatal, anomalias congênitas, morte perinatal e futuro surgimento de DM2 nas mulheres que apresentaram DG (Hod et al., 1991; Schmidt et al., 2001; American Diabetes Association, 2007).
A obesidade materna é um importante fator de risco para o surgimento do DG, existindo uma relação linear entre o índice de massa corpórea materna (IMC) e a incidência de DG (Torloni et al., 2009).
Introdução 3
(Boney et al., 2005). Estes achados indicam que a adiposidade materna poderia acarretar alterações moleculares e celulares que afetariam a programação fetal (Richardson, Carpenter, 2007).
Durante a gestação normal o sistema imune materno apresenta uma série de modificações para se adaptar a esta nova condição. A ativação da resposta inespecífica e o envolvimento de mecanismos e mediadores da imunidade celular destacam-se entre as alterações fisiológicas identificadas em gestantes normais. As citocinas desempenham papel fundamental neste cenário.
As citocinas exercem papel determinante na definição do padrão de resposta imune (humoral ou celular) observada. Mosmann e Coffman (1989) identificaram a existência de duas subpopulações de linfócitos T helper (Th) CD4+ que se distinguem pelo perfil de citocinas que produzem. A subpopulação Th1 é caracterizada pela produção de IL-2, interferon- (IFN- ) e fator de necrose tumoral alfa (TNFA), sendo a principal responsável pelo desenvolvimento de resposta inflamatória. Por sua vez, as células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 e estimulam o desencadeamento de resposta imune humoral. Essas duas subpopulações de linfócitos T têm a propriedade de se inibirem mutuamente. Uma terceira subpopulação celular de linfócitos T, a Th3, seria responsável pela produção de fator transformador de crescimento- (TGF- ) que atua na modulação da resposta imune e na polarização para padrão Th1 ou Th2 (Marinic et al., 2006).
O equilíbrio na produção de citocinas é essencial para o sucesso gestacional. Por exemplo, as citocinas Th1 podem ser prejudiciais ao desenvolvimento da gravidez conforme a sua concentração específica em diferentes trimestres da gestação. Por sua vez, o predomínio de citocinas Th2 favorece o desenvolvimento do trofoblasto, e as células de padrão Th3 contribuem no processo de tolerância materno-fetal (Raghupathy et al., 1999; Saito et al., 2010).
Introdução 4
propriedades inflamatórias, tem sido relacionada à resistência insulínica associada à obesidade (Richardson, Carpenter, 2007).
A gestação, a obesidade e o diabetes são condições que apresentam alterações na produção de citocinas e ou adipocinas. Quando essas três condições clínicas co-existem simultaneamente, as alterações podem apresentar padrão peculiar. Nesse contexto, o estudo da adiponectina merece destaque.
A adiponectina é um hormônio polipeptídico bioativo secretado pelo tecido adiposo que tem efeitos antihiperglicêmico, antiaterogênico e antiinflamatório (Diez, Iglesias, 2003). A ação da adiponectina depende de sua interação com os receptores ADIPOR1 e ADIPOR2. Durante a gestação os níveis deste hormônio diminuem, e quando não se normalizam com o parto, aumentam o risco de a mulher desenvolver resistência à insulina no futuro (Zavalza-Gomez et al., 2008). Por outro lado, a baixa concentração de adiponectina no início da gestação parece estar associada a risco aumentado de DG subsequente (Georgiou et al., 2008; Lain et al., 2008).
Entre os fatores produzidos na interface materno-fetal, a interleucina-10 (IL-10) parece ser a molécula imunomoduladora e antiinflamatória mais potente (Choi, Kwak-Kim, 2008). É inibidora de macrófagos ativados e está envolvida no controle das reações da imunidade inata e da imunidade celular (Abbas, 2003). Níveis elevados de IL-10 parecem favorecer o desenvolvimento normal da gestação (Jenkins et al., 2000). Alterações na produção desta citocina têm sido relacionadas a diferentes patologias obstétricas (Jenkins et al., 2000; Borekci et al., 2007), incluindo o DG (Kuzmicki et al., 2008). A síndrome metabólica e a obesidade são condições clínicas em que também se observam desequilíbrios no padrão de secreção desta citocina (Esposito et al., 2003).
Introdução 5
em humanos (Tsigos et al., 1997). Como o tecido adiposo humano é responsável por aproximadamente 25% do total de IL-6 circulante no organismo, os obesos tendem a ter níveis mais elevados desta substância do que indivíduos com peso normal (Mohamed-Ali et al., 1997).
O fator de necrose tumoral alfa (TNFA) é considerado tanto uma citocina como uma adipocina. Esta molécula pode induzir inflamação e inibir a produção de adiponectina. O TNFA é crucial para a implantação embrionária no útero, entretanto, sua secreção aumentada está associada ao aborto (Chung et al., 2000; Daher et al., 2004). Indivíduos obesos geralmente apresentam níveis séricos aumentados de TNFA, e com a perda de peso observa-se que esses valores tendem a diminuir. Esta produção exacerbada de TNFA, além de efeitos diretos sobre a resposta inflamatória, parece contribuir para o aparecimento de resistência à insulina em obesos (Dandona et al., 1998; Kern et al., 2003).
A investigação dos mecanismos imunológicos e sua participação em diferentes patologias ganharam novo enfoque a partir da clonagem dos genes que codificam a produção de citocinas, mediadores inflamatórios e seus receptores, e da identificação de polimorfismos referentes a esses genes. Baseado nestes conhecimentos tem-se pesquisado a relação entre fatores genéticos e diversas patologias (Daher et al., 2003; Hollegaard, Bidwell, 2006; Mattar et al., 2006; Vimaleswaran et al., 2008).
Um gene é considerado polimórfico quando possui duas ou mais variantes alélicas, sendo que a freqüência de cada uma delas é superior àquela esperada para mutações recorrentes. Enquanto alguns desses locis polimórficos podem ser capazes de alterar a expressão de seus produtos, outros podem não apresentar qualquer repercussão fenotípica. Mesmo não havendo efeitos fenotípicos, a determinação dos genótipos polimórficos pode contribuir para a identificação de marcadores de risco ou proteção de doença (Keen, 2002).
Os polimorfismos do gene codificador de adiponectina tem sido bastante estudados na atualidade. O polimorfismo na posição +45 T/G (rs2241766) parece influenciar os níveis plasmáticos deste mediador e alguns estudos sugerem uma associação entre este polimorfismo, DM2 e resistência à insulina (Hara et al., 2002; Li et al., 2007).
Introdução 6
genética e a concentração de adiponectina (Chung et al., 2009; Melistas et al., 2009), outros investigadores sugerem possível relação entre o alelo G e aumento dos níveis deste mediador (Vasseur et al., 2002).
Outro polimorfismo relacionado ao gene de adiponectina, localizado na posição -11377 G/C (rs266729), foi associado a DM2 (Populaire et al., 2003) e níveis alterados de adiponectina (Vasseur et al., 2002). Adicionalmente, este polimorfismo também estaria associado à ocorrência de DM2 em indivíduos obesos (Wang et al., 2009).
Alguns polimorfismos localizados na região promotora do gene que codifica a IL-10 despertaram a atenção dos investigadores porque são relacionados aos níveis de produção desta citocina. A identificação destes polimorfismos parece caracterizar pacientes com maior risco obstétrico (Choi, Kwak-Kim, 2008).
Diversas investigações têm sido voltadas ao estudo do polimorfismo de IL-10 -1082 G/A (rs1800896). Em particular, acredita-se que o alelo G esteja associado a maior produção desta citocina (Stanilova et al., 2006). Esta variante tem sido correlacionada tanto com doenças sistêmicas (Suarez et al., 2005; Ates et al., 2008) como com complicações obstétricas (Daher et al., 2003; Daher et al., 2006; Capasso et al., 2007).
Não foram identificadas associações entre o polimorfismo de IL-10 (-1082 G/A) e DM1 (Reynier et al., 2006; Kumar et al., 2007; Settin et al., 2009) ou DM2, mas houve associação com a gravidade desta última doença (Tsiavou et al., 2004; Kolla et al., 2009). Resultados similares foram observados em pacientes com DG. Em estudo recentemente publicado, investigadores da Malásia não detectaram associação entre este polimorfismo e o DG (Montazeri et al., 2010). Não encontramos estudos que avaliaram este polimorfismo em obesos.
Entre os diversos polimorfismos do gene que codifica a IL-6, um dos mais estudados é o -174 G/C (rs1800795), que parece influenciar a produção desta citocina. Não foi verificada associação entre este polimorfismo e pré-eclampsia ou prematuridade (Stonek et al., 2008). Porém, diferentes estudos têm apontado associação entre esta variação alélica e doenças sistêmicas, inclusive com DM2 (Pawlik et al., 2005; Huth et al., 2006).
Introdução 7
estudos sugerem o contrário em pacientes DM2. Estes estudos sugerem que o mesmo alelo parece estar associado a um menor risco para o surgimento de DM2 e de hiperglicemia (Vaxillaire et al., 2008; Huth et al., 2009). Já o genótipo CC é encontrado com maior frequência em pacientes com DM1 (Settin et al., 2009).
A avaliação de polimorfismos relacionados ao gene codificador de TNFA tem merecido especial atenção. Além de ser um dos primeiros polimorfismos descritos, o papel do TNFA como mediador crítico de inflamação gera muito interesse. Enquanto alguns estudos sugerem a existência de uma relação entre o polimorfismo de TNFA -308 G/A (rs1800629) com doenças sistêmicas (Guarnizo-Zuccardi et al., 2007) e alterações obstétricas (Daher et al., 2003; Menon et al., 2006; Pazarbasi et al., 2007), outros investigadores não observaram qualquer associação entre este polimorfismo e complicações gestacionais (Mattar et al., 2006; Stonek et al., 2007; Vural et al., 2010).
As investigações realizadas para avaliação do polimorfismo de TNFA -308 G/A em pacientes com resistência à insulina, diabetes e obesidade têm levado a resultados controversos. Chang et al. (2005) observaram relação entre esse polimorfismo, resistência à insulina e DG. Em concordância, uma revisão sistemática identificou associação entre este polimorfismo e o risco de desenvolvimento de obesidade e de produção de altos níveis de insulina, sugerindo que este gene também pode estar envolvido na patogênese da síndrome metabólica (Sookoian et al., 2005), embora, estudo recente não tenha demonstrado associação deste polimorfismo com o DG (Montazeri et al., 2010). A substituição da base G por A neste polimorfismo tem sido associada à maior produção de TNFA, sendo que o genótipo AA estaria associado à maior produção desta citocina (Wilson et al., 1997). Estudos recentes sugeriram associação entre este polimorfismo e a susceptibilidade para DM1 (Das et al., 2006; Shin et al., 2008; Settin et al., 2009). Este polimorfismo parece estar também associado com complicações em pessoas com diabetes tipo 2, mas não em casos de DM1 (Lindholm et al., 2008).
Objetivos 8
1.1. Objetivos
Nosso objetivo principal foi avaliar mediadores de resposta inflamatória (adiponectina, IL-10, IL-6 e TNFA) em gestantes portadoras de diferentes formas de diabetes, comparando-as entre si e à gestante saudáveis, considerando-se o índice de massa corpórea (IMC) pré-gestacional.
Foram nossos objetivos específicos:
Comparar gestantes saudáveis, com DG, DM1 e DM2 quanto aos seguintes parâmetros:
polimorfismos genéticos relacionados aos genes de Adiponectina +45 e -11377, IL-10 -1082, IL-6 -174 e TNFA -308;
níveis séricos de adiponectina;
9
Métodos 10
2.1. Desenho do estudo
Este estudo teve caráter observacional descritivo transversal, com grupos de comparação e foi realizado entre dezembro de 2008 e setembro de 2010.
2.2. Casuística:
As pacientes foram recrutadas para possível inclusão nos seguintes locais: a) Ambulatório de Diabetes e Gravidez (UNIFESP), b) Ambulatório de Pré-natal Fisiológica (UNIFESP), c) Enfermaria do Departamento de Obstetrícia (Hospital São Paulo), c) Centro Obstétrico do Hospital São Paulo e d) Casa da Gestante de Alto Risco do Hospital Municipal e Maternidade Escola Dr. Mário de Moraes Altenfelder Silva. Aquelas que preencheram os critérios de inclusão, e que espontaneamente aceitaram participar do estudo, após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1), foram encaminhadas para preenchimento da ficha de coleta de dados (Anexo 2) e para a coleta de material. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional da Universidade Federal de São Paulo (Anexo 3) e do Hospital Municipal e Maternidade Escola Dr. Mário de Moraes Altenfelder Silva (VN Cachoeirinha) (Anexo 4).
Os critérios de inclusão foram: gestação única com feto vivo; idade gestacional entre 28-36 semanas para análise fenotípica (dosagem das moléculas); e idade materna entre 10-49 anos. Os critérios de exclusão foram: gestantes com outras intercorrências obstétricas além do DM ou DG (tais como rotura prematura de membranas, trabalho de parto prematuro ou pré-eclâmpsia), portadoras de doenças sistêmicas; com infecções vigentes; e com transplante de órgãos sólidos.
Os grupos de estudo foram assim definidos:
a) Grupo Controle (C): Este grupo foi composto por gestantes sem quaisquer intercorrências obstétricas e sem DM ou DG até a data da coleta do material.
Métodos 11
jejum de oito a doze horas; e/ou glicemia maior que ou igual a 140 mg/dL 2 horas após sobrecarga de 75 g de glicose.
c) Grupo Diabetes Mellitus Tipo 1 (DM1): Este grupo foi composto por gestantes com diabetes mellitus tipo 1, ou seja, diabetes diagnosticado antes da gestação e dependente de insulina. Conforme os critérios propostos pela “American Diabetes Association“ (2007), o diagnóstico de diabetes mellitus é feito sempre que um paciente preencher um dos seguintes critérios: a) sintomas de diabetes acompanhado de glicemia plasmática ao acaso maior ou igual 200 mg/dL (11,1 mmol/L) (ao acaso sendo definido como a qualquer hora do dia, independente da hora da última refeição; os sintomas clássicos do diabetes incluem poliúria, polidipsia, e perda de peso inexplicável) ou b) glicemia de jejum maior ou igual a 126 mg/dL (7,0 mmol/L), após jejum de mínimo oito a doze horas, confirmada em uma segunda avaliação; ou c) glicemia maior ou igual a 200 mg/dL (11,1 mmol/L) duas horas pós carga de 75g de glicose.
d) Grupo Diabetes Mellitus Tipo 2 (DM2): Este grupo foi composto por gestantes com diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2 estabelecido antes da gestação, de acordo com os mesmos critérios propostos pela “American Diabetes Association“ (2007) acima descritos, e que não dependem de insulina para sobreviver.
Em todos os casos, a idade gestacional foi determinada preferencialmente: a) pela data confiável da última menstruação, se compatível (+ ou – 7 dias) com ultrassonografia precoce (até 20 semanas). A idade gestacional dos casos sem data da última menstruação confiável ou com discrepância > 7 dias foi calculada exclusivamente pela 1ª ultra-sonografia.
As raças das pacientes foram auto-referidas. O IMC pré-gestacional foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: kg/m2, e o peso e altura utilizados para o cálculo foram auto-referidos.
2.3. Método
2.3.1. Coleta de sangue
Métodos 12
Diagnostics, USA) e 8 mL em tubo com EDTA (BD Diagnostics, USA). Sangue heparinizado foi utilizado para cultura de células polimorfonucleares. Por sua vez, sangue coletado em tubo com EDTA foi utilizado para a extração de DNA.
A amostra destinada a extração de DNA foi centrifugada à 3000 rpm por 10 minutos à 4°C, e a camada intermediária (buffy coat) contendo as células polimorfonucleares foi coletada e armazenada a -20º C para futuro processamento.
A amostra coletada em tubo seco foi centrifugada após retração do coágulo à 3500 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente e o soro obtido foi armazenado em microtubo estéril e seco à -80ºC.
2.3.2. Extração de DNA
A extração do DNA genômico foi realizada pela técnica de DTAB/CTAB, descrita por (Gustincich et al., 1991).
Foram adicionados 450 µL de solução de DTAB (brometo de dodeciltrimetilamônio) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) a 12% ao buffy coat. Após incubação a 67ºC por 5 minutos, foram adicionados 900 µL de clorofórmio (Synth, Brasil).
A amostra foram centrifugada por 2 minutos a 10000 rpm, separando o material em 3 fases. A fase superior com aproximadamente 500 µL foi transferida para um tubo, com 900 µL de água destilada e 100 µL de CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) a 5%. A amostra foi agitada por inversão, até formar o precipitado de DNA-CTAB. Após nova centrifugação (2 minutos a 10000 rpm) o sobrenadante foi descartado.
O “pellet“ foi dissolvido em 300 µL de solução de NaCl (Synth, Brasil) 1,2M e foram adicionados 750 µL de etanol (Synth, Brasil) 90%. Com agitação por inversão, o DNA foi precipitado. Após nova centrifugação (2 minutos a 13000 rpm), o sobrenadante foi descartado e o DNA lavado com etanol (Synth, Brasil) 70%, seguido de outra centrifugação. O sobrenadante foi descartado e o DNA dissolvido em 120 µL de água destilada.
Métodos 13
Pharmacia Biothech, Uppsala, Suécia). A pureza do DNA foi confirmada pela razão A260nm/A280nm, considerando-se valores aceitáveis entre 1,5-1,8.
2.3.3. PCR (Reação de Polimerização em Cadeia)
As amplificações foram obtidas em condições padrões para PCR (Master Mix, Promega Corp., Madison, WI, EUA), seguindo as instruções do fabricante, utilizando termociclador (MJ96G, Biocycler) com as condições previamente padronizadas para cada primer de interesse, de acordo com a literatura específica.
Os produtos amplificados por PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2% (Gibco BRL, Paisley, UK), por 30 minutos a aproximadamente 100V. Posteriormente foram submetidos à técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), que detecta uma variação genética com a utilização de enzima de restrição. Os produtos obtidos pela digestão com enzimas de restrição foram analisados por eletroforese em gel de agarose 3% (Gibco BRL, Paisley, UK), por 30 minutos a aproximadamente 100V. Para análise dos resultados utilizamos o sistema de captura UV (E-BOX 300; Vilber Lourmat, França).
2.3.4. Genotipagens dos polimorfismos: 2.3.4.1. Adiponectina +45T/G (rs2241766):
O polimorfismo selecionado está localizado no éxon 2 do gene adiponectina. A amplificação de um segmento de 372 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 95ºC por 2 minutos, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 60ºC por 30 segundos, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi a 72ºC por 10 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ GCAGCTCCTAGAAGTAGACTCTGCTG 3´ e
Métodos 14
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição SmaI (New England BioLabs®
Inc, USA), podendo ser observado 3 genótipos: TT – 372 pb
TG – 372 pb + 209 pb + 163 pb
GG – 209 pb + 163 pb (Li et al., 2007). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 1) e os três possíveis genótipos (Figura 2).
Figura 1 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene Adiponectina.
Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo +45 do gene Adiponectina. A = indivíduo com genótipo TG, B = indivíduo com o genótipo TT, C = indivíduo com o genótipo GG, D = controle negativo (H2O) e E = marcador de peso molecular (100pb).
Métodos 15
2.3.4.2. Adiponectina -11377C/G (rs266729):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene adiponectina. A amplificação de um segmento de 433 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 95ºC por 2 minutos, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 50ºC por 30 segundos, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi a 72ºC por 10 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ CTTACATAAAATGTGATATTGGA 3´ e
5´ CTCTGTCTGAGAAAATTCTG 3´, respectivamente.
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição HhaI (New England BioLabs®Inc, USA), podendo ser observado 3 genótipos:
CC – 433 pb
GC – 433 pb + 309 pb + 124 pb
GG – 309 pb + 124 pb (Kyriakou et al., 2008 com modificações). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 3) e os três possíveis genótipos (Figura 4).
Métodos 16
Figura 4 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -11377 do gene Adiponectina. A = indivíduo com genótipo CG, B = indivíduo com o genótipo CC, C = indivíduo com o genótipo GG e D = marcador de peso molecular (100pb).
2.3.4.3. IL-10 -1082 G/A (rs1800896):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene IL-10. A amplificação de um segmento de 136 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 94ºC por 5 minutos, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 58ºC por 45 segundos, e polimerização a 72ºC por 55 segundos. A extensão final foi a 72ºC por 10 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ TCTTACCTATCCCTACTTCC 3´ e
5´ CTCGCCGCAACCCAACTGGC 3´, respectivamente.
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição MnlI (New England BioLabs®
Inc, USA), que deu origem a 3 possíveis genótipos: AA – 136 pb
AG – 136 pb + 104 pb + 32 pb
Métodos 17
Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 5) e os três possíveis genótipos (Figura 6).
Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene IL-10.
Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -1082 do gene IL-10. A = indivíduo com genótipo GG, B e E = indivíduos com o genótipo AA, C e F = indivíduos com o genótipo AG, D = indivíduo não genotipado, G = controle negativo (H2O) e H = marcador de peso molecular (100pb).
2.3.4.4. IL-6 -174 G/C (rs1800795):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene IL-6. A amplificação de um segmento de 243 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 95ºC por 5 minutos, seguida de 30 ciclos compostos por desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento a 55ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi a 72ºC por 5 minutos.
Métodos 18
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ TTGTCAAGACATGCCAAAGTGCT 3´ e
5´ GGGAAAATCCCACATTTGATAA 3´, respectivamente.
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição NlaIII (New England BioLabs®
Inc, USA), que deu origem a 3 possíveis genótipos: GG – 230 pb + 13 pb
GC – 230 pb + 122 pb + 108 pb + 13 pb
CC – 122 pb + 108 pb + 13 pb (Jahromi et al., 2000). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 7) e os três possíveis genótipos (Figura 8).
Métodos 19
Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -174 do gene IL-6. A = indivíduo com genótipo GC, B = indivíduo com o genótipo CC, C e D = indivíduos com o genótipo GG e D = marcador de peso molecular (100pb).
2.3.4.5. TNFA -308 G/A (rs1800629):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene TNFA. A amplificação de um segmento de 107 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada com 1 ciclo composto por desnaturação a 94ºC por 3 minutos, anelamento a 60ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 1 minuto, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 60ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. O ciclo de extensão final foi composto por 94ºC por 1 minuto, anelamento a 60ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 5 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT 3´ e
Métodos 20
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição NcoI (New England BioLabs®Inc, USA), que deu origem a 3 possíveis genótipos:
AA – 107 pb
GA – 107 pb + 87 pb + 20 pb
GG – 87 pb + 20 pb (Gonzalez-Sanchez et al., 2006). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 9) e os três possíveis genótipos (Figura 10).
Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene TNFA.
Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -308 do gene TNFA. A = marcador de peso molecular (100pb), B e C = indivíduos com genótipo GG, D e E = indivíduos com o genótipo GA.
Métodos 21
2.3.5. Cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP)
Sangue heparinizado (10 mL) diluído em partes iguais em PBS (Dulbecco s/Ca s/MG – Cutilab, Brasil) foi cuidadosamente dispensado sob solução gradiente de Ficoll-Paque plus (GE Bio-Science, Uppsala, Suécia) e centrifugado a 1800 rpm por 30 minutos, à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o anel de leucócitos que se forma na interface do sangue com a solução de Ficoll foi recuperado e submetido a lavagens em PBS. O botão de células mononucleares foi suspendido em meio de cultura RPMI suplementado com L-glutamina, soro fetal bovino (FBS) e gentamicina. A viabilidade celular foi avaliada com corante azul trypan (Sigma, Saint Louis, MO, EUA) e a concentração celular ajustada para 2x106 células/mL. A suspensão celular diluída em meio RPMI suplementado foi distribuída em placa de cultura de 24 orifícios e o estímulo mitogênico foi adicionado. As células foram estimuladas com lipopolissacarídeos (LPS na concentração de 10 μg/mL). A placa de cultura permaneceu em estufa de CO2 a 37°C por 24-48 horas. Após incubação, a suspensão celular foi transferida para microtubos e centrifugada. O sobrenadante coletado foi alicotado e armazenado a -80ºC para posterior dosagem de citocinas.
2.3.6. Avaliação dos níveis de adiponectina
Os níveis séricos de adiponectina foram avaliados por método de ELISA de captura utilizando kit comercial Quantikine® - Human Adiponectin/Acrp30 Immunoassay (R&D Systems®, USA), realizado conforme as instruções do fabricante.
2.3.7. Avaliação dos níveis de IL-10
Métodos 22
2.3.8. Avaliação dos níveis de IL-6
Níveis de IL-6 foram avaliados em sobrenadantes de culturas de linfócitos de 24 horas de incubação, por método de ELISA de captura utilizando o kit comercial Quantikine® – Human IL-6 Immunoassay (R&D Systems®, USA), realizado conforme as instruções do fabricante.
2.3.9. Avaliação dos níveis de TNFA
Níveis de TNFA foram avaliados em sobrenadantes de culturas de linfócitos de 24 horas de incubação, por método de ELISA de captura utilizando o kit comercial Quantikine® – Human TNFA Immunoassay (R&D Systems®, USA), realizado conforme as instruções do fabricante.
2.4. Análise Estatística
Foi avaliado se os polimorfismos genéticos analisados estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para tanto, foram comparadas as frequências esperadas com os valores observados de cada genótipo.
Para comparação de variáveis quantitativas contínuas entre os 4 grupos (controle, DG, DM1 e DM2) foi utilizado o teste de Mann-Whitney. Os testes de Qui-Quadrado ou Teste Exato de Fisher foram usados para comparar variáveis qualitativas entre os 4 grupos.
O valor de significância estatística estabelecido foi de 5%, ou p<0,05. Para análise dos resultados foi utilizado o pacote estatístico SPSS – Statistical Package for Social Sciences 13.1 (Ilinóis, EUA) para Windows.
2.5. Tamanho amostral
O cálculo do tamanho amostral foi baseado na frequência do polimorfismo de IL-6, considerando o poder de teste de 80% e nível de significância de 5%. De acordo
com os dados do projeto Hap Map
Métodos 23
sendo, foi determinado que cada grupo de caso incluísse 69 pacientes e o grupo controle incluísse 138 pacientes.
24
Resultados 25
3.1. Características da amostra
Para avaliação da comparabilidade das amostras várias características foram analisadas e comparadas entre os grupos e estão expostas na tabela 1.
As pacientes controle vindas do pré-natal de gestantes normais apresentavam idade média (29,07 anos) menor que as diabéticas gestacionais (31,25 anos) e as com diabetes tipo 2 (34,16 anos), entretanto eram mais idosas que as pacientes com diabetes tipo1 (24,42 anos). Essa diferença de idade foi significante quando se comparou as gestantes controle com as do grupo DG (p=0,01) e DM2 (p=0,001), e também a idade mostrou-se significantemente mais elevada quando comparada às do grupo DM1 (p=0,0008).
Não houve diferença significante entre os grupos quanto à distribuição racial, sendo que a grande maioria das gestantes era branca ou parda (C x DG – p=0,91; C x DM1 – p=0,79; C x DM2 – p=0,83; DG x DM1 – p=0,76; DG x DM2 – p=0,82; DM1 x DM2 – p=0,63).
As grávidas do grupo controle apresentaram índice de massa corpórea pré-gestacional médio significantemente menor do que as dos os grupos DG (p<0,0001) e DM2 (p<0,0001), e índices semelhantes às do grupo DM1 (p=0,75).
Quando comparamos o IMC pré-gestacional entre as mulheres com diabetes, observamos que as do grupo DG apresentaram IMC significantemente maior do que o grupo DM1 (p<0,0001) e não apresentaram diferença em relação ao grupo DM2 (p=0,68). As pacientes do grupo DM1 apresentaram IMC pré-gestacional significantemente menor do que as do grupo DM2 (p=0,0001).
Em relação ao número médio de gestações, não foram observadas diferenças significantes quando as mulheres do grupo controle foram comparadas às dos grupos DG (p=0,12) e DM1 (p=0,18), porém tiveram menor número de gestações do que as mulheres com DM2 (p=0,004).
Resultados 26
Tabela 1 - Características sócio-demográficas e clínicas das participantes
*Teste t de student; † Teste qui-quadrado
Variável Controle
N= 169 Diabetes Gestacional N= 79 Diabetes Tipo 1 N = 26
Diabetes Tipo 2 N = 19 Idade, anos *
Mínima-máxima Média Desvio-padrão 16-48 29,07 6,49 17-44 31,25 5,99 16-39 24,42 6,51 23-48 34,16 4,86
Raça †
Brancas Pardas Negras 69 (40,8%) 77 (45,6%) 23 (13,6%) 30 (38,0%) 36 (45,6%) 12 (15,2%) 12 (46,2%) 10 (38,5%) 4 (15,4%) 7 (36,8%) 10 (52,6%) 2 (10,5%)
IMC (Kg/m2)* Mínima-máxima Média Desvio-padrão < 18,5 18,5-24,9 25-29,9 >=30 17,36-35,9 23,24 3,42 6 (3,9%) 103 (67,8%) 38 (25,0%) 5 (3,3%) 19,98-44,74 28,86 5,87 0 (0,0%) 21 (26,6%) 32 (40,5%) 26 (32,9%) 17,33-31,46 23,01 3,82 4 (15,4%) 14 (53,8%) 7 (26,9%) 1 (3,8) 18,83-44,12 29,49 6,36 0 (0,0%) 5 (26,3%) 5 (26,3%) 9 (47,4%)
Resultados 27
3.2. Avaliações genéticas
a) Polimorfismo de adiponectina +45 T/G (rs2241766)
Foram avaliadas 169 mulheres do grupo controle, 79 pacientes com DG, 26 com DM1 e 19 com DM2. Os resultados das frequências genotípicas e alélicas estão apresentados a seguir (Tabela 2).
Tabela 2 - Frequências genotípicas (FG) e alélicas (FA) do polimorfismo +45 do gene adiponectina em pacientes dos grupos controle, DG, DM1 e DM2
A distribuição das frequências genotípicas estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg tanto nos grupos de diabéticas (DG, DM1 e DM2) como no grupo controle.
Não foram identificadas diferenças significantes quanto às frequências genotípicas ou alélicas entre os grupos.
b) Polimorfismo de adiponectina -11377 G/C (rs266729)
Foram avaliadas 168 mulheres do grupo controle, 79 pacientes com DG, 26 com DM1 e 19 com DM2. Os resultados das frequências genotípicas e alélicas estão apresentados a seguir (Tabela 3).
Controle DG DM1 DM2
FG
TT 134 (79,3%) 61 (77,2%) 16 (61,5%) 15 (78,9%)
TG 32 (18,9%) 15 (19,0%) 10 (38,5%) 4 (21,1%)
GG 3 (1,8%) 3 (3,8%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
TG+GG 35 (20,7%) 18 (22,8%) - -
Total 169 (100%) 79 (100%) 26 (100%) 19 (100%)
EHW 0,44 2,45 1,47 0,26
Resultados 28
Tabela 3 - Frequências genotípicas (FG) e alélicas (FA) do polimorfismo -11377 do gene adiponectina em pacientes dos grupos controle, DG, DM1 e DM2
Controle DG DM1 DM2
FG
CC 105 (62,5%) 54 (68,4%) 18 (69,2%) 13 (68,4%)
CG 50 (29,8%) 20 (25,3%) 7 (26,9%) 6 (31,6%)
GG 13 (7,7%) 5 (6,3%) 1 (3,9%) 0 (0,0%)
GC+CC 63 (37,5%) 25 (31,6%) 8 (30,8%) -
Total 168 (100%) 79 (100%) 26 (100%) 19 (100%)
EHW 3,77 2,48 0,09 0,14
FA C 260 (77,4%) 128 (81,0%) 43 (82,7%) 32 (84,2%) G 76 (22,6%) 30 (19,0%) 9 (17,3%) 6 (15,8%)
A distribuição das frequências genotípicas estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg tanto nos grupos de diabéticas (DG, DM1 e DM2) como no grupo controle.
Não foram identificadas diferenças significantes quanto às frequências genotípicas ou alélicas entre os grupos.
c) Polimorfismo de IL-10 -1082 G/A (rs1800896)
Resultados 29
Tabela 4 - Frequências genotípicas (FG) e alélicas (FA) do polimorfismo -1082 do gene IL-10 em pacientes dos grupos controle, DG, DM1 e DM2
Controle DG DM1 DM2
FG
AA 84 (50,9%) 43 (54,4%) 12 (46,2%) 9 (47,4%)
AG 66 (40,0%) 29 (36,7%) 11 (42,3%) 9 (47,4%)
GG 15 (9,1%) 7 (8,9%) 3 (11,5%) 1 (5,2%)
AG+GG 81 (49,1%) 36 (45,6%) 14 (53,8%) 10 (52,6%)
Total 165 (100%) 79 (100%) 26 (100%) 19 (100%)
EHW 0,15 0,45 0,04 0,15
FA A 234 (70,9%) 115 (72,8%) 35 (67,3%) 27 (71,1%) G 96 (29,1%) 43 (27,2%) 17 (32,7%) 11 (28,9%)
A distribuição das frequências genotípicas estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg em todos os grupos de estudo.
Não foram identificadas diferenças significantes quanto às frequências genotípicas ou alélicas quando entre os grupos.
d) Polimorfismo de IL-6 -174 G/C (rs1800795)
Resultados 30
Tabela 5 - Frequências genotípicas (FG) e alélicas (FA) do polimorfismo -174 do gene IL-6 em pacientes grupos controle, DG, DM1 e DM2
Controle DG DM1 DM2
FG
GG 104 (63,0%) 47 (59,5%) 16 (61,5%) 13 (68,4%)
GC 52 (31,5%) 24 (30,4%) 8 (30,8%) 6 (31,6%)
CC 9 (5,5%) 8 (10,1%) 2 (7,7%) 0 (0,0%)
GG+GC 156 (94,5%) 71 (89.9%) 24 (92,3%) 19 (100%)
Total 165 (100%) 79 (100%) 26 (100%) 19 (100%)
EHW 0,54 3,05 0,46 0,67
FA G 260 (78,8%) 118 (74,7%) 40 (76,9%) 32 (84,2%) C 70 (21,2%) 40 (25,3%) 12 (23,1%) 6 (15,8%)
A distribuição das frequências genotípicas estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg em todos os grupos analisados.
Não foram identificadas diferenças significantes quanto às frequências genotípicas ou alélicas entre os grupos.
e) Polimorfismo de TNFA -308 G/A (rs1800629)
Resultados 31
Tabela 6 - Frequências genotípicas (FG) e alélicas (FA) do polimorfismo -308 do gene TNFA em pacientes grupos controle, DG, DM1 e DM2
Controle DG DM1 DM2
FG
GG 133 (79,2%) 59 (74,7%) 19 (73,1%) 14 (77,8%)
GA 31 (18,5%) 18 (22,8%) 7 (26,9%) 4 (22,2%)
AA 4 (2,4%) 2 (2,5%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
GA+AA 35 (20,9%) 20 (25,3%) - -
Total 168 (100%) 79 (100%) 26 (100%) 18 (100%)
EHW 1,7 0,19 0,63 0,28
FA G 297 (88,4%) 136 (86,1%) 45 (86,5%) 32 (88,9%) A 39 (11,6%) 22 (13,9%) 7 (13,5%) 4 (11,1%)
A distribuição das frequências genotípicas estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg em todos os grupos de estudo avaliados.
Não foram identificadas diferenças significantes quanto às frequências genotípicas ou alélicas quando entre os grupos.
3.3. Avaliações fenotípicas
A avaliação fenotípica incluiu apenas uma parcela dos casos selecionados porque foi previamente definido que só seriam analisadas amostras coletadas no 3o trimestre da gestação, de pacientes sem infecções vigentes e sem uso de medicamentos que possam interferir na resposta inflamatória. Devido a isso, a avaliação genótipo/fenótipo também só pode ser realizada apenas em alguns casos.
3.3.1. Níveis séricos de adiponectina
Resultados 32
* teste Mann-Whitney
Controle DG DM1 DM2
0 5000 10000 15000 20000 25000
Ad
ipo
ne
ct
in
a
(n
g
/m
L)
Figura 11 – Níveis séricos de adiponectina em pacientes do grupo controle (C), diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2)
Os níveis de adiponectina foram significantemente mais elevados no grupo controle quando comparados ao grupo DG (C x DG: 8160 ng/mL x 5575 ng/mL, p=0,0004) e ao grupo DM2 (C x DM2: 8160 ng/mL x 2490 ng/mL, p=0,005). Entretanto, não houve diferença significante entre os níveis séricos de adiponectina entre os grupos controle e DM1 (C x DM1: 8160 ng/mL x 11130 ng/mL, p=0,07) (Figura 11).
Não identificamos diferenças significantes quanto aos níveis de adiponectina entre os grupos DG e DM2 (DG x DM2: 5575 ng/mL x 2490 ng/mL, p=0,07). Por outro lado, observamos que as mulheres do grupo DM1 apresentaram níveis de adiponectina significantemente maiores do que aquelas com DG (DM1 x DG: 11130 ng/mL x 5575ng/mL, p=0,0009), e com DM2 (DM1 x DM2: 11130 ng/mL x 2490 ng/mL, p=0,01) (Figura 11).
p=0,0004*
p=0,0009* p=0,005*
Resultados 33
Tabela 7 - Níveis séricos de adiponectina em pacientes do grupo controle (C) e com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC pré-gestacional
Adiponectina (ng/mL)
C DG DM1 DM2
IMC<25 N=39 9210
N=13 5988
N=10
11919 N=1
IMC≥β5 N=17 7580 N=31 4633 N=4 10189 N=9 2240
Figura 12 – Níveis séricos de adiponectina em pacientes do grupo controle (C) e com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC pré-gestacional
Agrupamos as pacientes de acordo com IMC pré-gestacional em duas categorias: não-obesas (< 25 kg/m2) e obesas (≥ β5 kg/m2). Nos casos de controle e DG observamos que os níveis de adiponectina em não obesas foram significativamente maiores do que o das obesas (controles: 9210 ng/mL x 7580 ng/mL, p=0,01, DG: 5988 ng/mL x 4633 ng/mL, p=0,03). Entretanto, não foram identificadas diferenças quanto a estes níveis quando comparadas entre si as pacientes DM1 (11919 ng/mL x 10189 ng/mL, p=0,37) (Tabela 7 e Figura 12).
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
Controle DG DM1 DM2
A dipon ec ti na ( ng /mL)
IMC < 25
IMC ≥ β5
* teste Mann-Whitney p=0,03*
p=0,01*
Resultados 34
Não foi possível realizar esta comparação em relação à DM2 devido ao pequeno número de pacientes com IMC<25 incluído neste grupo (Tabela 7 e Figura 12).
Procuramos também comparar os níveis de adiponectina entre controles e diabéticas agrupadas de acordo com o IMC pré-gestacional. O nível sérico de adiponectina das controles obesas foi significativamente maior do que as não-obesas com DG (C x DG: 9210 ng/mL x 5988 ng/mL, p=0,03 – teste Mann-Whitney) e o mesmo ocorreu quando se comparou os níveis séricos médios de adiponectina entre as mulheres obesas desses dois grupos (C x DG: 7580 ng/mL x 4633 ng/mL, p=0,01 – teste Mann-Whitney) (Figura 13a). Em relação ao grupo DM1 não notamos estas diferenças. Quando comparadas ao grupo controle, as pacientes com DM1 obesas ou eutróficas não apresentaram níveis de adiponectina significantemente diferentes (Figura 13b).
Quando avaliamos eutróficas não foram identificadas diferenças entre pacientes DG e DM1 quanto aos níveis de adiponectina sérica (DG x DM1: 5988 ng/mL x 11919 ng/mL, p=0,05 – teste Mann-Whitney). Entretanto, quando comparamos obesas observamos que as mulheres com DG tiveram níveis significativamente menores do que as com DM1 (DG x DM1: 4633 ng/mL x 10189 ng/mL, p=0,01 – teste Mann-Whitney) (Figura 13c).
Resultados 35
a) C x DG b) C x DM1
c) DG x DM1 d) C x DM2
e) DG x DM2 f) DM1 x DM2
Figura 13 - Comparação dos grupos C, DG, DM1 e DM2 entre si quanto aos níveis séricos de adiponectina de acordo com IMC pré-gestacional
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 DG DM1 A dipon ecti na ( ng /mL)
IMC < 25 IMC ≥ β5 0 2000 4000 6000 8000 10000 Controle DG A dipon ecti na ( ng /mL)
IMC < 25 IMC ≥ β5 p=0,03 p=0,01 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Controle DM1 A dipon ecti nc a (ng /mL) p=0,10 p=0,32 0 2000 4000 6000 8000 10000 Controle DM2 A d ipo n ec ti n a (n g /m L ) p=0,02 p=0,01 p=0,04 0 2000 4000 6000 DG DM2 A dipon ecti na ( ng /mL)
Resultados 36
Avaliação da relação genótipo e fenótipo:
a) Polimorfismo +45 do gene da adiponectina X níveis séricos de adiponectina
Agrupamos as pacientes dos grupos controle e DG de acordo com o padrão de expressão funcional do polimorfismo em dois subgrupos TT e TG+GG e avaliamos o nível de adiponectina nestes grupos.
Não notamos correlação entre as variáveis (genótipo e fenótipo) em nenhum dos grupos (TT x TG+GG – C: 8401 ng/mL x 8106 ng/mL – p=0,92; DG: 5605 ng/mL x 4638 ng/mL, p=0,62) (Figura 14a,b).
Como no grupo DM1 não foram identificadas pacientes com genótipo GG, a comparação foi realizada entre os casos TT e TG. Neste grupo também não observamos correlação entre o padrão genotípico e os níveis de adiponectina (TT x TG: 11370 ng/mL x 10190 ng/mL, p=0,49) (Figura 14c).
Resultados 37
a) Grupo C b) Grupo DG
c) Grupo DM1
Figura 14 - Avaliação de adiponectina em pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG) e diabetes mellitus tipo 1 (DM1): níveis séricos e distribuição das frequências genotípicas do polimorfismo +45 de adiponectina
b) Polimorfismo -11377 do gene da adiponectina X níveis de adiponectina
Agrupamos as pacientes dos grupos controle, DG e DM1 de acordo com o padrão de expressão funcional do polimorfismo em dois subgrupos GG e GC+CC e avaliamos o nível de adiponectina nestes grupos.
Houve diferença significante entre as variáveis (genótipo e fenótipo) no grupo controle (GG x GC+CC: 8990 ng/mL x 5835 ng/mL – p=0,005) (Figura 15a). Porém, não notamos correlação entre as variáveis (genótipo e fenótipo) em nos grupos DG e
TT TG+GG 0 5000 10000 15000 20000 25000 Ad ipo ne ct in a (n g /m L) TT TG+GG 0 5000 10000 15000 20000 Ad ipo ne ct in a (n g /m L) TT TG 0 5000 10000 15000 20000 Ad ipo ne ct in a (n g /m L)
p=0,92 – teste Mann-Whitney p=0,62 – teste Mann-Whitney
Resultados 38
DM1 (GG x GC+CC – DG: 5854 ng/mL x 4824 ng/mL – p=0,15; DM1: 8310 ng/mL x 11920 ng/mL, p=0,18) (Figura 15b,c).
No grupo DM2 não foi possível fazer esse cálculo devido ao pequeno número de pacientes avaliadas.
a) Grupo C b) Grupo DG
c) Grupo DM1
Figura 15 - Avaliação de adiponectina em pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2): níveis séricos e distribuição das frequências genotípicas do polimorfismo -11377 de adiponectina
3.3.2. Avaliação dos níveis de IL-10, IL-6 e TNFA:
Foram determinados os níveis das citocinas em sobrenadantes de cultura de linfócitos de sangue periférico sem (nível basal) e com estimulação por LPS após 24 horas (IL-6 e TNFA) e 48 horas (IL-10) de incubação. Como não foram identificadas
GG GC+CC 0 5000 10000 15000 20000 25000 Ad ipo ne ct in a (n g /m L) GG GC+CC 0 5000 10000 15000 20000 Ad ipo ne ct in a (n g /m L) GG GC+CC 0 5000 10000 15000 20000 Ad ipo ne ct in a (n g /m L)
p=0,005 – teste Mann-Whitney p=0,15 – teste Mann-Whitney
Resultados 39
diferenças significantes entre as amostras, basais e estimuladas, apresentamos apenas os níveis basais.
3.3.2.1. Níveis basais de IL-10
Neste ensaio foram avaliadas amostras de 42 mulheres do grupo controle, 34 pacientes com DG, 9 com DM1 e 10 com DM2. Os resultados observados estão apresentados a seguir (Figura 16).
Controle DG DM1 DM2
0 200 400 600
IL
-1
0
(p
g
/m
L
)
Figura 16 - Níveis de IL-10 em sobrenadantes de cultura de linfócitos (sem estímulo - basal) de pacientes do grupo controle (C), diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2)
Resultados 40
Tabela 8 - Níveis basais de IL-10 em sobrenadante de cultura de linfócitos de pacientes controle (C) e com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC pré-gestacional
IL-10 (pg/mL)
C DG DM1 DM2
IMC<25 N=28 83,32
N=10 113,03
N=6
53,59 N=1
IMC≥β5 N=14 102,72 N=24 81,58 N=3 69,84 N=9 140,68
Figura 17 - Níveis basais de IL-10 em sobrenadante de cultura de linfócitos de pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC pré-gestacional
Agrupamos as pacientes de acordo com IMC pré-gestacional em duas categorias: não-obesas (<25 kg/m2) e obesas (≥β5 kg/m2). Analisando cada grupo individualmente, isto é, controles, DG, DM1 e DM2, não foram identificadas diferenças significantes quanto aos níveis basais de IL-10 quando comparadas gestantes eutróficas e obesas (IMC<β5 x IMC≥β5: C – 83,32 pg/mL x 102,72 pg/mL, p=0,86; DG – 113,03 pg/mL x 81,58 pg/mL – p=0,14; DM1 – 53,59 pg/mL x 69,84 pg/mL – p=0,71) (Tabela 8 e Figura 17). 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Controle DG DM1 DM2
IL
-10
(
pg
/mL)
IMC < 25 IMC ≥ β5 p=0,71*
p=0,14* p=0,86*
Resultados 41 0 20 40 60 80 100 120 Controle DM1 IL -10 (pg/ m L) 0 20 40 60 80 100 120
DG DM1
IL
-10
(pg
/mL)
IMC < 25 IMC ≥ β5
0 50 100 150
DG DM2
IL
-10
(pg
/mL)
IMC < 25 IMC ≥ β5
0 50 100 150 DM1 DM2 IL -10 (pg /mL)
No grupo DM2 não foi possível fazer esta análise devido ao pequeno número de pacientes com IMC<25 (Tabela 8 e Figura 17).
Confrontando os grupos C, DG DM1, DM2 entre si não identificamos diferença nos níveis de IL-10 entre pacientes dos diferentes grupos com IMC <25 e de pacientes com IMC≥β5 (teste Mann-Whitney) (Figura 18).
a) C x DG b) C x DM1
c) DG x DM1 d) C x DM2
e) DG x DM2 f) DM1 x DM2
Figura 18 - Comparação dos grupos C, DG, DM1 e DM2 entre si quanto aos níveis séricos de IL-10 basais de acordo com IMC pré-gestacional
0 20 40 60 80 100 120 Controle DG IL -10 (pg /mL)
IMC < 25 IMC ≥ β5
Resultados 42
Para avaliar a relação genótipo/fenótipo distribuímos as pacientes de acordo com o padrão de expressão funcional para o polimorfismo de IL-10 -1082 A/G em dois subgrupos AA e AG+GG e avaliamos o nível de IL-10 nestes grupos.
Quando avaliamos as pacientes controles, DG e DM2 não notamos correlação entre as variáveis (genótipo e fenótipo) em nenhum dos grupos (AA x AG+GG – C: 83,92 pg/mL x 95,83 ng/mL – p=0,71; DG: 91,47 pg/mL x 84,90 pg/mL, p=0,75; DM2 – 110,1 pg/mL x 173,6 pg/mL, p=0,76) (Figura 19a,b,d).
Como no grupo DM1 não foram identificadas pacientes com genótipo GG, a comparação foi realizada entre os casos AA e AG (AA x AG: 69,84 pg/mL x 115,3 pg/mL, p=0,73) (Figura 19c).
a) Grupo C b) Grupo DG
c) Grupo DM1 d) Grupo DM2
Figura 19 - Avaliação de IL-10 em pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2): níveis basais e distribuição das frequências genotípicas do polimorfismo -1082 de IL-10
AA AG+GG 0 200 400 600 IL -1 0 (p g /m L ) AA AG+GG 0 200 400 600 IL -1 0 (p g /m L ) AA AG 0 100 200 300 400 IL -1 0 (p g /m L ) AA AG+GG 0 100 200 300 400 IL -1 0 (p g /m L )
p=0,71 – teste Mann-Whitney p=0,75 – teste Mann-Whitney
Resultados 43
3.3.2.2. Níveis basais de IL-6
Neste ensaio foram avaliadas amostras de 42 mulheres do grupo controle, 34 pacientes com DG, 9 com DM1 e 10 com DM2. Os resultados observados estão apresentados a seguir (Figura 20).
Controle DG DM1 DM2
0 5000 10000 15000
IL
-6
(p
g
/m
L
)
Figura 20 - Níveis de IL-6 em sobrenadantes de cultura de linfócitos (sem estímulo - basal) de pacientes do grupo controle (C), diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2)
Resultados 44 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Controle DG DM1 DM2
IL
-6
(
pg
/mL)
IMC < 25 IMC ≥ β5
Tabela 9 - Níveis basais de IL-6 em sobrenadante de cultura de linfócitos de pacientes controle (C) e com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC pré-gestacional
IL-6 (pg/mL)
C DG DM1 DM2
IMC<25 N=27 2125,2
N=11 2878,2
N=6
2087,7 N=1
IMC≥β5 N=15 3099 N=23 1015,9 N=3 151,36 N=9 2265,1
Figura 21 - Níveis basais de IL-6 em sobrenadante de cultura de linfócitos de pacientes controles (C), com diabetes gestacional (DG), diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) de acordo com IMC
Agrupamos as pacientes de acordo com IMC pré-gestacional em duas categorias: não obesas (<25 kg/m2) e obesas (≥β5 kg/m2). Analisando cada grupo individualmente, isto é, controles, DG, DM1 e DM2, não foram identificadas diferenças significantes quanto aos níveis basais de IL-6 quando comparadas gestantes eutróficas e obesas (IMC<β5 x IMC≥β5: C – 2125,2 pg/mL x 3099 pg/mL, p=0,37; DG – 2878,2 pg/mL x 1015,9 pg/mL – p=0,10; DM1 – 2087,7 pg/mL x 151,36 pg/mL – p=0,38). (Tabela 9 e Figura 21).
p=0,10* p=0,37*
p=0,38*
