Avaliação do efeito do SA na liberação de substancia P na ATM de ratos A administração intra-articular de SA (50 µg/ATM) reduziu

significativamente a liberação de substância P induzida pela formalina na ATM (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey) (Figura 8).

Figura 8. Avaliação do efeito do SA na liberação de substancia P induzido pela formalina na ATM. S u b s t P ( p g /m l) 0 . 0 0 0 . 1 0 0 . 2 0 0 . 3 0 0 . 4 0 N a C l 0 , 9 % S A 5 0 g / A T M ) 1 . 5 % F o r m a lin a N L X 1 0g / A T M * _* +

O símbolo (+) indica liberação de substância P significativamente maior quando comparada a do grupo NaCl 0,9% (p<0,05; ANOVA, Tukey test). O símbolo (*) indica liberação de substância P significativamente menor quando comparado ao grupo formalina 1,5%.

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6. DISCUSSÃO

O Óxido Nítrico (ON), um gás difusível natural, é produzido a partir da conversão de L-arginina para L-citrulina através de isoformas de ON sintetases, estando envolvido na regulação de várias funções fisiopatológicas (Cunha et al., 2010; Paolocci et al., 2007). O nitroxil (HNO) é a forma reduzida em um elétron e protonada do ON, recentemente vem se destacando como um novo congênere redox, com distintas ações farmacológicas e vantagens terapêuticas. Evidências tem demonstrado que perifericamente os doadores de HNO bloqueiam diretamente a hiperalgesia inflamatória (Cury et al., 2011) e modulam a neurotransmissão da dor (Cunha et al., 2010), conferindo assim ao HNO importante função biológica.

O Sal de Angeli (SA), ou trioxodinitrato de sódio (Na2N2O3) é o doador

sintético mais comumente utilizado no estudo biológico do HNO (Paolocci et al., 2007). Tem sido demonstrado que o SA apresenta efeito antinociceptivo em modelos de hiperalgesia mecânica induzida por uma variedade de estímulos como carragenina, LPS, citocinas e PGE2 (Zarpelon et al., 2013). Corroborando com estes

estudos, os resultados deste trabalho demonstraram que o pré-tratamento com SA foi capaz de reverter a hiperalgesia inflamatória induzida pela formalina na articulação temporomandibular de ratos.

Em um estudo prévio, foi demonstrado que o SA inibiu a hiperalgesia inflamatória induzida pela carragenina na pata de ratos através da ativação da via intra-celular GMPc/PKG/K+ATP de forma independente da ativação de receptores

opioides periféricos (Zaperlon et al., 2013). No entanto, nossos resultados demonstraram que o efeito antinociceptivo induzido pelo SA na ATM de ratos, pelo menos em parte, é dependente de receptores opioides endógenos, subtipos capa, delta e mμ; localizados na fibras C-nociceptivas aferentes primárias.

Diferenças entre tecidos subcutâneos e profundos, como os que envolvem a ATM já vem sendo descrito pela literatura. Inicialmente, a inervação predominante dos dois tecidos apresentam diferentes subconjuntos de fibras neuronais primárias. Considerando que os tecidos profundos apresentam maior excitabilidade de fibras nervosas centrais quando comparados aos tecidos subcutâneos, pode-se concluir que distúrbios sensoriais podem resultar em mais condições dolorosas em tecidos profundos quando comparados a tecidos superficiais (Imbe et al., 2001). Sendo assim, é válido hipotetizar que os sistemas de

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modulação de dor, como por exemplo, o sistema opioide, pode ser mais efetivo nos tecidos profundos como os tecidos adjacentes da ATM.

O sistema opioide tem sido descrito como mediador do efeito antinociceptivo de diferentes drogas quando administradas diretamente na ATM (Clemente et al., 2004; Pena-dos-Santos et al., 2009; Araújo et al., 2017; Coura et al., 2017). Uma vez ativados, os receptores opioides localizados nas fibras C- nociceptivas primárias resultam na ativação da via intra-celular ON/GMPc/ PKG/K+ATP resultando em hiperpolarização destas células e consequentemente

analgesia (Clemente et al., 2009; Pena-dos-Santos et al., 2009). Sendo assim, seria possível sugerir que o efeito antinociceptivo induzido pelo SA na ATM seria mediado por ativação de receptores opioides (conforme demonstrado por este estudo) e da via intra-celular GMPc/ PKG/K+ATP, como previamente descrito (Zarpelon et al.,

2013).

Os resultados do nosso estudo demonstraram que a administração de inibidores seletivos para GMPc, PKG e canais K+ATP, não foram capazes de alterar a

resposta analgésica do SA (Figura 3), ou seja, o efeito antinociceptivo do SA na ATM é dependente da ativação de receptores opioides mas não da ativação da via intra- celular GMPc/ PKG/K+ATP. Frente a estes resultados pode-se sugerir que o SA possa

estar atuando diretamente em células residentes, como macrófagos, por exemplo, liberando peptídeos opioides endógenos, e estes por sua vez, ativando os receptores opioides periféricos das fibras C-nociceptivas primárias (Macedo et al., 2016). Recentemente foi demonstrado que o SA é capaz de promover alteração fenotípica em macrófagos, do tipo M1 (classicamente ativados), com características pró-inflamatórias, para M2 (alternativamente ativados), de caráter resolutivo do processo inflamatório através da liberação de peptídeos opioides endógenos (Andrews et al., 2016).

A ativação de receptores opioides por peptídeos opioides endógenos está associada com a ativação de outras vias intracelulares. Sabe-se que a ativação dos receptores kappa-opóides (KOR) induz uma ativação de canais de potássio simultaneamente com uma ação inibitória dos canais de cálcio, de forma a hiperpolarizar a membrana neural (Bruchas et al., 2010). Além dessa ação direta sobre os canais iônicos, a ativação dos receptores KOR leva a uma inativação da síntese de AMPcíclico, inibindo a ativação da cascata de sinalização neuronal, como por exemplo, ativação das proteinoquinases PKA e PKC, que são vinculadas a

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processos pró-nociceptivos (Minneman & Iverson 1976; Bruchas et al., 2010).

O processo inflamatório na articulação temporomandibular é resultado da liberação de citocinas pró-inflamatórias (Kopp, 2001), as quais contribuem para a remodelação da articulação e degradação da cartilagem (Vernal et al., 2008). No endotélio, o TNF-α e outras citocinas podem induzir uma regulação aumentada de moléculas de adesão em leucócitos e células endoteliais, levando ao aumento da migração do lúmen vascular para o tecido conjuntivo, potencializando a quimiotaxia inflamatória (Moen et al., 2005).

Dentro desse contexto foi levantada a hipótese de que o efeito antinociceptivo do SA poderia estar associado a um efeito anti-inflamatório. Inicialmente os resultados demonstram que o SA reduziu significativamente a migração de leucócitos induzida pela injeção intra-articular de formalina (Figura 4). Sabe-se que a migração de leucócitos pode ser essencial para o aumento da permeabilidade de parede do vaso, formação de exsudato e indução de dor induzida por certos estímulos inflamatórios (Cunha et al., 2008). A adesão e transmigração do leucócito dos vasos sanguíneos para dentro dos tecidos são reguladas pela ligação de moléculas de adesão complementar encontradas na superfície do endotélio e mediadores químicos.

A ICAM é uma molécula de adesão intercelular continuamente presente em baixas concentrações nas membranas dos leucócitos e células endoteliais, podendo ser induzida por interleucina-1 (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF), e é expressa pelo endotélio vascular, macrófagos e linfócitos. Quando ativados, os leucócitos se ligam às células endoteliais através de ICAM-1 e, em seguida migram para os tecidos. (Zarbock et al., 2011). Considerando que o mecanismo do processo inflamatório envolve adesão de células inflamatórias e sua transmigração mediada pelos leucócitos do tipo β2 integrinas, os quais se interagem com imunoglobulinas como a ICAM, levantamos a hipótese de que o efeito anti-inflamatório SA se deve, pelo menos em parte, pela diminuição da expressão da ICAM. No entanto, nossos resultados demonstraram que o SA não interfere na expressão da ICAM durante o processo inflamatório induzido pela formalina na ATM de ratos (Figura 5A).

Apesar da ICAM-1 estar presente na maioria das células endoteliais e estar diretamente envolvida na adesão e transmigração de células durante o processo inflamatório, outros mediadores como o Fator de Aceleração de Decaimento (também conhecido como CD55) também interferem neste processo. Ao

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contrário da ICAM-1, o CD55 é uma molécula anti-adesiva que promove a depuração da ligação dos leucócitos com as células endoteliais. Tem sido demonstrado que existe uma interação entre o CD55 e a ICAM-1 (Shafren et al., 2000), e esta interação limita a ligação de leucócitos com a ICAM-1. Sendo assim, foi avaliado se a redução da migração de células inflamatórias pelo SA poderia estar associada ao aumento da expressão da molécula CD55. Contrariando a hipótese, os nossos resultados demonstraram que não há diferença na expressão do CD 55 entre os grupos testados (Figura 5B).

Os trabalhos de Cunha et al. (1992) e Zarpelon et al. (2013) mostraram que a inibição da migração de células polimorfonucleares leva a inibição da sequência de liberação de mediadores da hipernocicepção inflamatória iniciados pelo TNF-α, responsáveis.pela liberação de IL-1β e quimiocinas (Zarpelon et al, 2013).

Tem sido demonstrado que após a indução de um processo inflamatório, o TNF- α é a primeira citocina a ser liberada, de modo que é considerada a citocina- chave do processo inflamatório (Cunha et al., 1992). Nossos resultados demonstraram que pré- tratamento com SA reduziu significativamente a liberação de TNF- α, mas por outro lado não foi capaz de diminuir a liberação de IL-1β induzida pela injeção intra-articular de formalina 1,5%.

O processo inflamatório envolve uma série de mediadores químicos liberados no local da lesão que tem por finalidade sensibilizar os nociceptores. Alguns dos principais mediadores inflamatórios que compõem a “sopa inflamatória” são peptídeos (bradicinina), lipídios (prostaglandinas), neurotransmissores (serotonina [5-HT] e ATP) e neurotrofinas (NGF). Estes mediadores são capazes de sensibilizar/excitar os nociceptores aferentes primários, tendo como principal função a transmissão aferente para o corno dorsal da medula espinhal. Além disso, essa sensibilização permite através de uma função eferente dos nociceptores denominada transporte antidrômico, iniciar o processo de inflamação neurogênica. Neste processo, dois neurotransmissores têm grande destaque, Substância P (SP) e do Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), pois desempenham funções cruciais para a manutenção do processo inflamatório como aumentar o fluxo sanguíneo local e a permeabilidade vascular, promovendo a ativação de células leucocitárias (mastócitos e neutrófilos), que contribuem para a manutenção deste processo inflamatório (Snijdelaar et al., 2000; Julius D, Basbaum AI. 2001). Neste

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contexto, nosso estudo demonstrou que o tratamento com SA foi capaz de inibir a liberação de substância P no tecido periarticular da região temporomandibular de ratos.

Frente a estes dados é possível sugerir que o efeito antinociceptivo do SA na ATM está associado a ativação de células residentes, como macrófagos residentes, resultando em dois efeitos: (1) aumentando a liberação de peptídeos opioides endógenos, os quais teriam uma ação direta nos receptores opiodes localizados nas fibras C-nociceptivas, hiperpolarizando estas células e reduzindo uma ação antidrômica do neurônio, demonstrado através da redução de liberação de SP, resultando em uma menor sinalização para a quimiotaxia inflamatória. (2) diminuindo a liberação de TNF-α, o qual apresenta papel chave na sinalização da migração leucocitária durante o processo inflamatório, além de reduzir vias de segundos mensageiros relacionados com a hiperalgesia inflamatória (Verri et al., 2006).

Este estudo demonstrou que a administração direta na ATM do doador de nitroxila, Sal Angelis, foi capaz de induzir uma diminuição na hiperalgesia inflamatória induzida pelo agente inflamatório formalina. Este efeito foi mediado pela ativação de receptores opioides localizados nas fibras C-nociceptivas, diminuição da migração de células inflamatórias e diminuição da liberação da citocina pró- inflamatória TNF-α. Assim sendo o uso do Sal Angelis, surge como uma promessa terapêutica como um potente efeito analgésico e anti-inflamatório mediado pelos receptores opioides, mas independente da ativação da via intra-celular ON/GMPc.

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7. CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou que a administração direta na ATM do doador de nitroxila, Sal Angelis, foi capaz de induzir uma diminuição na hiperalgesia inflamatória e quimiotaxia inflamatória induzida pelo agente inflamatório formalina. Este efeito foi mediado pela ativação de receptores opioides localizados nas fibras C-nociceptivas, no entanto, independente da ativação da via intra-celular ON/GMPc.

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