Avaliação do efeito do doador de nitroxila, Sal Angelis, na nocicepção induzida pela formalina na articulação temporomandibular de ratos

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

CARLOS LANE FOGAÇA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO DOADOR DE NITROXILA, SAL

ANGELIS, NA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA FORMALINA

NA ARTICULAÇÃO TEMPOROMANDIBULAR DE RATOS.

PIRACICABA 2017

CARLOS LANE FOGAÇA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO DOADOR DE NITROXILA, SAL

ANGELIS, NA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA FORMALINA

NA ARTICULAÇÃO TEMPOROMANDIBULAR DE RATOS.

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia, na área de Fisiologia Oral.

Orientadora: Profa. Dra. Juliana Trindade Clemente Napimoga

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO CARLOS LANE FOGAÇA E ORIENTADO PELA PROFª. DRª. JULIANA TRINDADE CLEMENTE NAPIMOGA.

PIRACICABA 2017

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica. Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159

Fogaça, Carlos Lane, 1955 -

F687a Fog Avaliação do efeito do doador de nitroxila, Sal Angelis, na nocicepção induzida pela formalina na articulação temporomandibular de ratos / Carlos

Lane Fogaça. – Piracicaba, SP: [s.n.], 2017.

Fog

Orientador: Juliana Trindade Clemente Napimoga.

Fog Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de

Odontologia de Piracicaba.

Fog

1. Articulação temporomandibular. 2. Dor. I. Clemente-Napimoga, Juliana Trindade, 1978-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de

Odontologia de Piracicaba. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Evaluation of nitroxila donor effect, Angelis Salt, on the formalin induced nociception in temporomandibular joint of rats

Palavras-chave em inglês: Temporomandibular joint Pain

Área de concentração: Fisiologia Oral Titulação: Doutor em Odontologia Banca examinadora:

Juliana Trindade Clemente Napimoga [Orientador] Giovana Tófoli Moniz

Marcelo Sperandio

Cínthia Pereira Machado Tabchoury Sidney Figueroba Raimundo

Data de defesa: 20-07-2017

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho,

A Deus,

Por estar sempre presente me abençoando e iluminando meus caminhos, para alcançar grandes vitórias.

Aos meus amados filhos,

Lucas, Filipe e Jessica Pela adorável companhia e amor.

Aos meus pais,

Clementina e Herculano (In memoriam)

Pelo amor e apoio em todos os momentos da minha vida. Vocês sempre serão de importância eterna para mim.

Aos meus queridos irmãos,

Cinara (In memoriam) e Diógenes

AGRADECIMENTO ESPECIAL

A minha orientadora,

Profa. Dra. Juliana Trindade Clemente Napimoga

Agradeço imensamente pela oportunidade de ter possibilitado a realização de um grande sonho, e pela orientação soberba e suprema, ter me orientado com tamanha competência, sabedoria e confiança compreendendo minhas dificuldades e estando sempre disposta a contribuir... ETERNO OBRIGADO!!

Aos meus colegas de doutorado,

Monaliza Lamana, Cristina Gomes de Macedo e Henrique Ballassini Abdalla pelos ensinamentos laboratoriais e experimentos com animais, e por toda ajuda oferecida, estando presentes em todos os momentos, muito obrigado! Desejo muito sucesso a vocês!

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), em nome do seu magnífico Reitor José Tadeu Jorge, e à Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP), em nome de seu Diretor Guilherme Elias Pessanha Henriques, pelo privilégio em ser aluno desta instituição e por oferecer uma excelente qualidade de ensino e infraestrutura para a realização desse trabalho.

À Universidade Comunitária Região de Chapecó – SC, em nome do seu magnífico Reitor Prof. Dr. Cláudio Alcides Jacoski, e em nome do seu Diretor do Centro de Ciências da Saúde Prof. Dr. Altamir Trevisan Dutra e ao Coordenador de Curso Odontologia Prof. Dr. Diogo Alexander Oliveira, pelo privilégio em ser comtemplado com o convênio DINTER entre a UNOCHAPECÓ e a FOP-UNICAMP para a realização deste doutorado.

A Srª. Eliete Riguetto, secretária do Departamento de Ciências Fisiológicas da FOP-UNICAMP e Srª Maria Eliza dos Santos, secretária do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, obrigada pela atenção e carinho.

Ao Carlos Alberto Feliciano, pela amizade e ajuda prestada em todos os momentos.

Aos meus grandes amigos e colegas de consultório Andreia Soletti e Giovani Soletti, pela amizade e por toda ajuda oferecida, estando presentes em todos os momentos, sejam aqueles bons ou ruins, muito obrigado!

Aos professores do Departamento de Ciências Fisiológicas da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, pela oportunidade da realização deste sonho e pelo exemplo de dedicação ao ensino e a pesquisa, e em especial à Profª. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, muito obrigada pelo constante apoio e motivação oferecidos para a conclusão deste trabalho.

Enfim, agradeço imensamente a todos que direta ou indiretamente tiveram grande importância para a conclusão de mais esta etapa. Obrigado pelas palavras de

apoio e incentivo, a contribuição de cada um de vocês foi de essencial importância. Desejo sucesso e felicidade a cada pessoa que hoje faz parte da minha vida e que, de uma forma ou outra, são peças fundamentais para o sucesso e continuação do meu trajeto.

EPÍGRAFE

“Por maior que seja, a dificuldade, jamais desanime. O nosso pior momento na vida é sempre o momento de melhorar”. Chico Xavier

RESUMO

Este estudo avaliou o efeito periférico do doador de nitroxila, Sal Angelis (SA), na dor induzida pela formalina na articulação temporomandibular de ratos (ATM) e o papel dos receptores opioides mu (µ), delta (δ) e capa (κ) neste efeito. Para realização deste estudo foram utilizados ratos machos Wistar (± 250 g, n=4/grupo, perfazendo um total de 11 grupos). A injeção intra-articular de SA (1.5, 15, 50 ou 150 µg/ATM) reduziu significativamente o comportamento nociceptivo induzido pela formalina 1,5% na ATM dos animais (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey). O pré-tratamento dos animais com o antagonista não seletivo dos receptores opioides (naloxona, 10 µg/ATM); ou o antagonista de receptores μ-opioide (CTOP, 120 µg/ATM); ou antagonista do receptor δ-opioide (ICI174,864; 30 µg/TMJ); ou antagonista do receptor κ-opioide (Nor-BNI, 200 µg/ATM) reduziram significativamente o efeito antinociceptivo induzido pelo SA na ATM (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey), no entanto, este efeito é independente da ativação da via intracelular óxido nítrico/ guanosina monofosfofato cíclico (NO/GMPc). O tratamento da ATM com o SA foi capaz de diminuir significativamente a migração de células inflamatórias e liberação da citocina pró-inflamatória TNF-α induzida pela formalina (p<0,05: ANOVA, teste Tukey), apesar de não ter alterado a expressão da molécula de adesão ICAM-1 e do fator de decaimento de aceleração CD55 (p>0,05: ANOVA, teste de Tukey). Os resultados sugerem que o SA quando administrado diretamente na ATM de ratos apresenta um potente efeito analgésico e anti-inflamatório mediado pelos receptores opioides, no entanto, independente da ativação da via intra-celular ON/GMPc.

ABSTRACT

The aim of this investigation was evaluate the peripheral antinociceptive effect of the nitroxyl donor, Angeli’s Salt (AS) in the temporomandibular joint (TMJ) of rats and the participation of opioid receptors mµ (µ), delta (δ) and kappa (κ) in this effect. For that, Male Wistar rats were used (± 250g, n=4/group, in a total of 11 groups). Intra-TMJ injection of AS (1.5, 15, 50 or 150µg/TMJ) significantly reduced nociceptive behavioral responses induced by formalin (p<0.05: ANOVA, Tukey’s test). Pretreatment with a non-selective antagonist of opioid receptors (naloxone, 10µg/TMJ); or antagonist of µ-opioid receptor (CTOP, 120µg/TMJ); or antagonist of δ-opioid receptor (ICI174,864; 30 µg/TMJ); or antagonist of κ-opioid receptor (Nor-BNI, 200µg/TMJ) significantly reduced the peripheral antinociceptive effect induced by intra-TMJ injection of AS (p<0.05: ANOVA, Tukey’s test). On the other hand, this effect is independent of the activation of the intra-cellular nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate (NO/cGMP) pathway. The intra-TMJ injection of AS (50µg/TMJ) significantly reduced leukocyte migration and the release of pro-inflammatory cytokine TNF-α (p<0.05: ANOVA, Tukey`s test), but not modulated the expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and decay-accelerating factor CD55 (p>0.05). The results suggest that AS induces a potential antinociceptive and anti-inflammatory effect mediated by opioid receptors, but independent of the activation of intracellular NO/cGMP pathway.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT - Serotonina

AINEs - Anti-inflamatórias não-estereoidais AKT - Proteína quinase B

AMP - Adenosina Monofosfato cíclico ATM - Articulação Temporomandibular ATP - Adenosina trifosfato

DTM - Disfunção Temporomandibular GMPc - Guanosina monofosfato cíclico HNO - Doadores de nitroxila

IL-1 - Interleucina 1 IL-6 - Interleucina 6 IL-12 - Interleucina 12 IL-17 - Interleucina 17

K+ATP - Canais de potássio sensíveis ao ATP

ON - Óxido Nítrico

PI3Kγ - Fosfatidilinositol 3-quinase isoforma gama PKA - Proteína quinase A

PKC - Proteína quinase C

PKG - Proteinoquinase dependente do GMPc SNC - Sistema Nervoso Central

TNF-α - Fator de necrose tumoral alpha SA - Sal de Angelis

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 14 2. REVISÃO DA LITERATURA 16 3. PROPOSIÇÃO 21 4. MATERIAL E MÉTODOS 22 5. RESULTADOS 28 6. DISCUSSÃO 35 7. CONCLUSÃO 40 REFERÊNCIAS 41

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1. INTRODUÇÃO

A dor crônica é uma das principais razões para a busca de tratamentos de desordens temporomandibulares (DTM) responsável por causar incapacidades físicas e psicológicas (Su Lobbezoo et al., 2017; Prasad et al., 2016). A etiologia das DTMs é multifatorial envolvendo fatores biomecânicos, neuromusculares, biopsicológicos e neurobiológicos (Prasad et al., 2016). Os fatores neurobiológicos das DTMs ainda não estão bem esclarecidos, especialmente os mecanismos envolvidos na transição da dor aguda para o estado crônico após injúrias de tecidos/ nervos periféricos orofaciais. O controle da dor decorrente de DTMs ainda é um grande desafio para clínicos e pacientes (Cairns et al., 2010).

A dor é um dos sinais clássicos de processo inflamatório apresentando como denominador comum à sensibilização dos receptores nociceptivos aferentes primários. Decorrente de estímulos inflamatórios ou lesões teciduais, a liberação de citocinas e quimiocinas pró e anti-inflamatórias desencadeiam a liberação de prostanóides e aminas simpatomiméticas que por sua vez atuam diretamente nos nociceptores causando a hipernocicepção, a redução do limiar de excitabilidade devido à modulação de canais de sódio voltagem-dependentes (Khasar et al. 1999, Verri et al, 2006, Quinteiro et al., 2012; Quinteiro et al., 2014). Com o melhor entendimento nos mecanismos envolvidos nas condições dolorosas, diversas terapias antiálgicas têm sido propostas.

O óxido nítrico (ON) é um sinalizador intracelular envolvido na transmissão nociceptiva, que tem despertado bastante interesse no meio científico. O ON é um gás altamente difusível que contribui para uma variedade de funções biológicas tais como respostas imunológicas (Langrehr et al., 1993) e sinalizações neurais (Brenman, 1997) através da via intracelular L-Arginina/ON/GMPc/K+ATP(Ferreira et al., 1991; Cunha et al., 2010). Na dor, o ON

tem apresentado um duplo efeito, ou seja, pode induzir ou reduzir a dor dependendo da sua concentração e tecido onde é liberado (Cury et al., 2011). Sobre o efeito antinociceptivo do ON, tem sido demonstrado que no tecido periférico doadores ou substâncias que aumentam a concentração neuronal de ON resultam no bloqueio da hiperalgesia inflamatória (Cury et al., 2011).

O nitroxil (HNO), produzido a partir do ON reduzido em um elétron, recebeu, até recentemente, menor atenção do que as espécies oxidadas, no

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entanto, estudos recentes revelaram aspectos importantes da química do HNO, que lhe conferem importância biológica. A simplicidade estrutural dessa espécie triatômica contrasta com a complexidade de algumas de suas características e propriedades químicas fundamentais (Fukuto et al., 2005).

Para o estudo dos efeitos do HNO são usados compostos doadores desta espécie. Entre estes, o que está melhor caracterizado é o trioxodinitrato de sódio (Na2N2O3) também chamado de Sal de Angelis (SA). Este, além de ser

usado em terapias anti-alcoólicas, também tem propriedades vasodilatadoras. Similarmente ao ON, doadores de nitroxila (HNO) também ativam a guanilil ciclase que atua como um receptor intracelular para NO (Fukuto et al.,2005).

Em particular, em um estudo recente, o doador de nitroxila denominado Sal Angelis, inibiu a hiperalgesia inflamatória induzida na pata de ratos por diferentes agentes inflamatórios, através da inibição da produção e liberação de citocinas pró-inflamatórias e ativação periférica da via intracelular GMPc/PKG/K+ATP (Zaperlon et al., 2013).

O tratamento das condições dolorosas ainda é considerado um desafio para clínicos, pacientes e pesquisadores. Sendo assim, considerando que ativação periférica da via intracelular L-Arginina/ON/GMPc está envolvida no efeito antinociceptivo de diferentes drogas na ATM (Clemente et al., 2004; Clemente-Napimoga et al., 2009; Pena-dos-Santos et al., 2009), este estudo apresenta como proposta investigar o efeito do doador de nitroxila Sal Angelis na hiperalgesia inflamatória induzida pela formalina na ATM de ratos assim como os mecanismos envolvidos neste processo.

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2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. As condições dolorosas decorrentes da Articulação Temporomandibular: A Articulação Temporomandibular (ATM) é uma articulação dupla bilateral, que se movimenta interdependente. É através dela que a mandíbula, único osso móvel do crânio, liga-se à base craniana. Constitui a parte terminal do osso da mandíbula e está intimamente relacionada com o crânio através do osso temporal (Douglas, 1998). Sendo assim, pode-se considerar que a ATM é uma das articulações mais utilizadas no corpo humano, anatomicamente complexa, que possibilita a mandíbula executar variados movimentos durante a mastigação, deglutição e fala (Amantéa et al., 2004; Nunes e Maciel, 2005; Ingawalé e Goswami, 2009).

A ATM, assim como outras articulações sinoviais do corpo humano, a ATM pode ser afetada por doenças inflamatórias, traumáticas, infecciosas, congênitas, e neoplásicas. As alterações que acometem a ATM e musculatura adjacente são denominadas de Disfunções Temporomandibulares (DTMs). As DTMs podem ser definidas como um conjunto de desordens musculoesqueléticas e neuromusculares que afetam a ATM e tecidos circundantes, caracterizadas por limitação dos movimentos articulares, dor e ruído articular (Leeuw et al, 2013, Graff-Radford e Bassiur, 2014). Em particular, as condições dolorosas decorrentes da ATM resultam de processos inflamatórios (Kopp, 2001), que progridem para quadros de dor inflamatória persistentes resultando em dor orofacial crônica. Por este motivo, as condições dolorosas decorrentes da ATM são consideradas denominador comum para o desenvolvimento de dor orofacial crônica (Cairns, 2010; Leeuw, 2010; Sessle, 2011).

A dor é um dos sinais clássicos do processo inflamatório, sendo resultado da liberação de várias citocinas pró-inflamatórias, em particular do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e das interleucinas IL-1, IL-6, IL- 12, e IL-17, que contribuem para uma remodelação articular assim como uma degradação da cartilagem (Vernal et al., 2008). A liberação destas citocinas facilita a liberação de prostanóides e aminas simpatomiméticas que promovem a sensibilização de nociceptores periféricos desta região (Raja et al., 1988; Alstergrem e Kopp, 2000; Nordahl et al., 2000; Kopp, 2001; Oliveira et al., 2005) e de neurônios nociceptivos centrais do complexo sensório-nuclear trigeminal do tronco encefálico (Iwata et al, 1999; Sessle,

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2000; Dubner e Ren, 2004).

O sistema de receptores nociceptivos nos tecidos faciais é representado por um arranjo plexiforme e de terminações livres de fibras nervosas amielínicas. Essas fibras, chamadas terminações nervosas livres, estão distribuídas pela pele, tecido subcutâneo, fáscia, tecido adiposo, camada adventícia dos vasos sanguíneos, periósteo, músculos, cápsula articular e ligamentos da ATM. Em circunstâncias normais, este sistema está inativo, mas não totalmente. Muitas dessas terminações nervosas livres atuam como nociceptores, respondendo a estímulos nocivos (Sessle, 1995).

Quando há exposição aos fluidos dos tecidos circunvizinhos ou substâncias irritantes como ácido lático, bradicinina, histamina, íons potássio e outras substâncias liberadas de tecidos inflamados e metabolicamente anormais; as terminações nervosas livres tem sua atividade aferente acentuada quando são excitadas por aplicação de forças mecânicas, térmicas, elétricas ou químicas (Milan, 1999). Quando esses nociceptores são excitados, enviam informações ao Sistema Nervoso Central (SNC) para que identifique a intensidade, qualidade, localização e duração desse estímulo (Sessle, 1995).

Frente a uma lesão, citocinas pro- e anti-inflamatórias e quimiocinas são liberadas no local da lesão tanto por células residentes (como macrófagos, por exemplo), quanto pelas células do próprio infiltrado inflamatório, que irão desencadear a ativação de mediadores inflamatórios responsáveis pela dor inflamatória. Nos tecidos que envolvem a ATM, tem sido demonstrado o importante papel da cascata de hiperalgesia inflamatória, descrita por Verri e colaboradores em 2006, desencadeada pelas citocinas pró-inflamatórias TNF-alpha (TNF-α) e IL-1 beta (IL-1β) (Rodrigues et al., 2006; Pena-dos-Santos et al., 2009; Quinteiro et al., 2012; Silva Quinteiro et al., 2014). Uma vez liberadas, as citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β são responsáveis pela liberação de citocinas (IL-6, IL-12 e IL-18) e quimiocinas (CINC-1 e KC), as quais resultam na liberação de prostanóides (em particular a prostaglandina E2) e aminas simpatomiméticas. Os prostanóides e

aminas simpatomiméticas agem diretamente nos nociceptores, preferencialmente das fibras C aferentes primárias. Uma vez ativados, desencadeiam a ativação das vias de segundos mensageiros, como a proteína quinase A e proteína kinase C (Quinteiro et al, 2012), resultando na fosforilação de canais de sódio voltagem dependente, responsáveis pelo aumento da excitabilidade das membranas

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neuronais (Verri el al., 2006).

É importante evidenciar o fato de que os tecidos adjacentes a ATM são mais sensíveis à liberação das aminas simpatomiméticas e PGE2 quando

comparado a tecidos cutâneos (Rodrigues et al., 2006). O componente simpático das condições dolorosas inflamatórias explica a menor efetividade dos anti-inflamatórios não esteroidais nestas condições. Considerando que a ATM recebe uma rica inervação simpática (Widenfalk and Wiberg, 1990; Yoshino et al., 1998; Kido et al., 2001) e os nociceptores localizados nas fibras C nociceptivas primárias são mais sensíveis a liberação das aminas simpáticas (Rodrigues et al., 2006), em acréscimo as particularidades anatômicas da ATM, é compreensível a taxa de insucessos na terapêutica das condições dolorosas decorrentes da ATM.

2.2. Óxido Nítrico e o Sal Angelis:

O óxido nítrico (ON) é um gás difusível com a capacidade de difundir-se livremente através das membranas celulares e, ao contrário de outros neurotransmissores clássicos, o ON não pode ser regulado pelo processo de armazenamento, liberação e reabsorção. Em vez disso, a biossíntese de ON é controlada dinamicamente com o intuito de fornecer os níveis adequados de acordo com a demanda tecidual (Yun et al., 1997; Kumar et al., 2017 ).

O óxido nítrico está envolvido em diferentes processos fisiológicos do corpo através da modulação de diferentes reações bioquímicas como neurotransmissão, plasticidade sináptica, regulação da expressão gênica, percepção da dor e depressão (Kumar et al., 2017).

A síntese de ON utiliza como percussor a L-arginina, um aminoácido que é convertido em outro aminoácido, a L-citrulina, sendo essa reação catalisada por enzimas chamadas de ON sintases [ONS] (Zaperlon et al., 2013). Muitas pesquisas vêm sendo desenvolvidas na intenção de desvendar e/ou estabelecer o mecanismo de ação do óxido nítrico e suas principais respostas. Sabe-se que o ON é capaz de ativar a enzima guanilil ciclase solúvel (GC), possivelmente pela reação com um átomo de ferro em uma estrutura heme, que então catalisa a conversão do trifosfato de guanosina (GTP) em monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) (Staurengo-Ferrari et al., 2014).

Considerando a ação do ON no sistema nervoso, muitas linhas de pesquisa tem demonstrado um efeito “dual” do óxido nítrico no sistema nociceptivo,

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podendo tanto induzir como reduzir a dor dependendo do sítio de ação e da quantidade disponibilizada nos tecidos (Souza et al., 2001; Cunha et al., 2010; Staurengo-Ferrari et al., 2014). Além disso, uma série de compostos analgésicos são dependentes do ON para promover seu efeito antinociceptivo, tais como os opioides, alguns anti-inflamatórios não-esteroides, dipirona e diclofenaco. (Staurengo-Ferrari et al., 2014).

Na ATM, tem sido demonstrado que a administração local de diferentes drogas anti-inflamatórias, tais como o agonista do receptor κ-opioide U50,488 (Clemente et al., 2004; Clemente-Napimoga et al., 2009) e a 15-deoxy-12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) (Pena-dos-Santos et al., 2009; Macedo et al., 2016)

resultam em uma resposta analgésica através da ativação da via intracelular ON/GMPc.

Até recentemente, os efeitos biológicos do ON vinham sendo atribuídos diretamente à molécula de ON exclusivamente. No entanto, ON pode ser tanto oxidado (ON+) como reduzido (ON-), sendo a espécie um-elétron reduzida do ON denominada de nitroxil (Irvine et al., 2008).

O nitroxil (HNO) é a forma reduzida em um elétron e próton do ON, e recentemente tem se destacado pelas suas distintas ações farmacológicas e vantagens terapêuticas. Evidências tem demonstrado que perifericamente os doadores de HNO bloqueiam diretamente a hiperalgesia inflamatória (Cury et al., 2011) e modulam a neurotransmissão da dor (Cunha et al., 2010), conferindo assim ao HNO importante função biológica.

O sal de Angelis (SA), ou trioxodinitrato de sódio (Na2N2O3) é o doador

sintético mais comumente utilizado no estudo biológico do HNO (Paolocci et al., 2007). Tem sido demonstrado que o SA apresenta efeito antinociceptivo em modelos de hiperalgesia mecânica induzida por uma variedade de estímulos como carragenina, LPS, citocinas e PGE2. Este efeito é resultado da inibição da produção

de citocinas pró-inflamatórias induzida por carragenina, provocando uma antinocicepção periférica (Staurengo-Ferrari et al., 2014). Neste sentido, o efeito antinociceptivo de SA em modelos comportamentais de hiperalgesia mecânica, térmica e neuropatia é dependente da ativação da via antinociceptiva do GMPc/PKG/K+ATP (Zaperlon et al., 2013; Staurengo-Ferrari et al., 2014;

Longhi-Balbinot et al., 2016).

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com condições dolorosas na ATM (Anbar and Gratt 1998; Suenaga et al. 2001; Wahl et al. 2003), o papel do ON na dor inflamatória da ATM não está claro. Considerando que a ativação periférica da via intracelular ON/GMPc está envolvida no efeito antinociceptivo de diferentes drogas na ATM (Clemente et al., 2004; Clemente-Napimoga et al., 2009; Pena-dos-Santos et al., 2009), este estudo apresenta como proposta investigar o efeito do doador de nitroxila Sal Angelis na hipernocicepção inflamatória induzida pela formalina na ATM de ratos assim como os mecanismos envolvidos neste processo.

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3. PROPOSIÇÃO

Este estudo apresenta como proposta avaliar o efeito do doador de nitroxila Sal Angelis na hipernocicepção inflamatória induzida pela formalina na ATM de ratos assim como os mecanismos envolvidos neste processo, através:

 da avaliação do efeito do Sal Angelis no comportamento nociceptivos induzido pela formalina na ATM de ratos;

 da avaliação do efeito do Sal Angelis na migração de células inflamatórias e extravasamento plasmáticos induzidos pela formalina na ATM de ratos;

 da avaliação do efeito do Sal Angelis na liberação das citocinas pro-inflamatórias (TNF-α e IL-1β), liberação do neuropeptídeo Substância P, da expressão da molécula de adesão (ICAM-1) e do fator de aceleração de decaimento (CD55);

 da avaliação da participação dos receptores opioides (mu, delta e capa) e da ativação da via intracelular GMPc/PKG/K+ATP no efeito antinociceptivo

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4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Animais

Para a realização deste trabalho foram utilizados ratos machos Wistar (± 250g, n=4 animais por grupo, total de 11 grupos) provenientes do CEMIB (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório) e mantidos no Biotério da FOP – UNICAMP, em gaiolas plásticas (5 por gaiola) contendo maravalha, em ambiente com controle de luminosidade (ciclos claro/escuro de 12h) com alimentação e água, ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Estadual de Campinas (CEUA #3101-1) e estão de acordo com as diretrizes determinadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e pela Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP), em animais conscientes (Zimmermann, 1983). Para minimizar o estresse durante as sessões experimentais, os animais foram previamente manipulados pelo pesquisador por um período de sete dias. Para retirada de tecidos os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia (Isoflurano 5%).

4.2. Drogas

Trioxodinitrato de sódio – Sal Angelis (SA) sintetizado e utilizado como descrito anteriormente (Smith e Hein, 1960). Naloxona, inibidor não seletivo de receptores opioides; nor-binaltorphiminie (Nor-BNI), antagonista do receptor κ-opioide; N,N-diallyl-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu (ICI174,864), antagonista do receptor δ-opioide; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2 (CTOP), antagonista do receptor μ-opioide; ODQ, inibidor da guanilil sintase; KT5823, inibidor da PKG; glibenclamida, bloqueador de canal de K+ATP e uma solução aquosa de 37% de

formaldeído foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Todas as drogas foram diluídas em solução de cloreto de sódio a 0,9%. A solução de formalina foi preparada a partir da solução aquosa de 37% de formaldeído e diluída em NaCl 0,9% até uma concentração final de 1,5% (Roveroni et al., 2001).

4.3. Injeção intra-articular na ATM

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isoflurano (3 %) (Figura 1). Em seguida uma agulha calibre 30G, acoplada e uma seringa Hamilton (50 μl) por meio de uma cânula de polietileno P20 foi introduzida na ATM. O ponto de referência para a injeção intra-articular foi à borda do arco zigomático na região póstero-lateral do côndilo. Os animais retornaram a consciência aproximadamente 30 segundos após o término da inalação do anestésico (Roveroni et al., 2001; Clemente et al., 2004).

Figura 1. Anestesia inalatória durante injeção intra-articular na ATM

4.4. Teste comportamental

Imediatamente após a injeção intra-articular, o animal já consciente, foi recolocado na câmara de observação e as respostas comportamentais caracterizadas pelo ato de coçar a região injetada com a pata dianteira ou traseira e pelo ato de levantar reflexamente a cabeça foram quantificadas durante 45 min., divididos em 9 blocos de 5 min. O tempo em segundos que o animal permaneceu coçando a região orofacial foi quantificado através da utilização de um cronômetro, e o número de vezes que o animal levantou reflexamente a cabeça foi quantificado por um contador de células (Roveroni et al., 2001; Clemente et al., 2004). Considerando que o ato de levantar reflexamente a cabeça segue um padrão uniforme de 1 s de duração, a intensidade da resposta nociceptiva foi quantificada somando-se esse comportamento ao ato de coçar a região injetada como previamente padronizado (Roveroni et al., 2001; Clemente et al., 2004). Imediatamente após as análises comportamentais, os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia (Isoflurano 5%) seguido de deslocamento cervical e amostras do tecido periarticular

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e lavado intra-articular foram removidas para análises posteriores. Os tecidos periarticulares foram removidos por uma dissecção dos músculos temporal e masseter profundo com atenção aos pontos anatômicos (arco zigomático e timpânica) até a exposição do processo condilar. As amostras representam todos os tecidos que cercam o processo condilar: músculos mastigatórios (temporal posterior, masseter, pterigoide externo) cartilagem articular, fibrocartilagem do disco e ligamentos laterais. O tamanho da amostra padrão é de 1 x 1 x 0, 5 cm.

4.5. Delineamento experimental

Para o desenvolvimento deste trabalho foram realizados os seguintes grupos experimentais:

4.5.1. Para avaliar o efeito do Sal Angelis na hipernocicepção inflamatório induzida pela formalina na ATM de ratos:

GRUPO 1: Injeção intra-articular de salina (45 µl/ATM)

GRUPO 2: Injeção intra-articular de formalina 1,5% (15 µl/ATM) + salina (30 µl/ATM).

GRUPO 3 a 6: Pré-tratamento com uma injeção intra-articular de Sal Angelis (SA) (1.5, 15, 50 ou 150 µg/15 µl/ATM) (Zarpelon et al., 2013) 15 minutos antes da injeção intra-articular de Formalina 1,5% (15 µl/ATM) + salina (30 µl/ATM).

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µl/ATM) na ATM contralateral 15 minutos antes da injeção intra-articular de Formalina 1,5% (15 µl/ATM) + salina (30 µl/ATM).

4.5.2. Para avaliar a participação de receptores opioides endógenos e ativação da via GMPc/ PKG/K+ATP no efeito antinociceptivo do Sal Angelis:

GRUPO 8: Pré-tratamento com uma injeção intra-articular do antagonista de receptores opioides não seletivo Naloxona (10 µg/15 µl/ATM) (Pena-dos-Santos et al., 2009) + SA (50 µg/15 µl/ATM) 15 minutos antes da injeção intra-articular de Formalina 1,5% (15 µl/ATM).

GRUPO 9 a 11: Pré-tratamento com uma injeção intra-articular do antagonista do receptor μ-opioide (CTOP 120 µg/15 µl/ATM); ou do antagonista do receptor κ-opioide (Nor-BNI 200 µg/15 µl/ATM); ou do antagonista do receptor δ-opioide (ICI 174,864 30 µg/15 µl/ATM) (Pena-dos-Santos et al., 2009) + SA (50 µg/15 µl/ATM) 15 minutos antes da injeção intra-articular de Formalina 1,5% (15 µl/ATM).

GRUPO 12 a 14: Pré-tratamento com uma injeção intra-articular do inibidor da guanilil sintase (ODQ 8 µg/15 µl/ATM); ou do inibidor da PKG (KT5823 1,5 µg/15 µl/ATM); ou do bloqueador de canal de K+ATP (glibenclamida 160 µg/15 µl/ATM)

(Zarpelon et al., 2013) + SA (50 µg/15 µl/ATM) 15 minutos antes da injeção intra-articular de Formalina

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4.6. Quantificação da migração leucocitária

Para a avaliação da migração de neutrófilos, os animais foram mortos e um lavado intra-articular (2x) com 5 µl de PBS contendo EDTA (1 mM) foi realizado. O lavado (10 µl) foi diluído em 90 µl de PBS/EDTA e a partir deste, realizadas a contagem total dos leucócitos. Para a contagem total de leucócitos, alíquotas de 10 µl do lavado articular foram diluídas em líquido de Turk (20 µl), na proporção de 1:2, sendo a contagem total dos leucócitos realizada em câmara de Neubauer, com o auxílio de microscópio óptico (aumento de 100x) e contador manual e expressa como número de células x 104/cavidade articular (Quinteiro et al., 2014).

4.7. Extração de proteínas do tecido periarticular

Amostras de tecido periarticular foram homogeneizadas em 500 µl de buffer apropriado contendo inibidores de protease (Ripa Lysis Buffer, Santa Cruz, Biotechnology, Dallas, Texas, USA) seguida de centrifugação por 10 min/10,000 rpm/4 °C. A quantidade total de proteínas extraídas foi medida usando o kit BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Os sobrenadantes foram armazenados a -20°C e utilizados posteriormente para as análises através de ELISA e Western Blot.

4.8. Western Blot para avaliação da expressão da molécula de adesão celular (ICAM-1) e do fator de aceleração de decaimento (CD55).

As proteínas do sobrenadante foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10% e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas "overnight" à 4°C com tampão de bloqueio [PBS 5% (p/v) de leite desnatado e 0,1% Tween 20]. As membranas foram lavadas três vezes com PBS 0,1% Tween 20. Em seguida foram incubadas em solução de PBS contendo 5% de leite desnatado e 0,1% Tween 20 contendo anticorpo anti-ICAM,

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anti-CD55 ou anti-α-tubulina (Santa Cruz) e GAPDH (Genetex). Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado HRP e novamente lavadas. As membranas foram então reveladas com kit de quimioluminescência (ECL, Amershan Pharmacia Biotech, Little Chalfont, U.K.) como descrito no manual de instruções. O controle negativo foi obtido pela omissão do anticorpo primário.

4.9. Avaliação da liberação das citocinas pró-inflamatorias TNF-alpha e IL- através ensaio imunoenzimático (ELISA).

As análises utilizando o método imunoenzimático foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante para cada kit. Foram utilizados os kits para TNF-α (R&D Systems, USA), IL-1β (R&D System, USA) e Substância P (Fênix Pharmaceuticals, USA).

4.10. Análise estatística

Os dados foram avaliados utilizando-se análise de variância a um critério de avaliação (One-Way ANOVA). As comparações múltiplas foram feitas pelo teste de Tukey. Para todos os testes o nível de significância foi estabelecido em 5%. O programa GraphPad Prism 6.0 foi utilizado para a realização dos cálculos e confecção dos gráficos.

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5. RESULTADOS

5.1. Efeito periférico antinociceptivo do doador de nitroxila Sal Angelis (SA) na ATM de ratos.

Os resultados demonstraram que as quatro doses do SA (1,5; 15; 50 ou 150 μg/ATM) reduziram significativamente (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey) a resposta nociceptiva induzida pela injeção intra-articular de formalina na ATM de ratos (Figura 2). A aplicação intra-articular do SA (150 μg/ATM) na ATM contralateral (ct) diminuiu significativamente a resposta comportamental induzida pela formalina na ATM ipsilateral (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey), demonstrando um efeito sistêmico. A aplicação intra-articular do SA (50 μg/ATM) na ATM contralateral não apresentou efeito na nocicepção induzida pela formalina na ATM ipsilateral (p>0,05), demonstrando o efeito periférico desta dose, sendo assim, a dose de 50 μg / ATM do SA foi selecionada para os experimentos posteriores (Figura 2)

Figura 2. Avaliação do efeito antinociceptivo do SA na região da ATM.

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 + * * * * * # # R e s p o s ta n o c ic e p ti v a ( s ) 1 . 5 1 5 5 0 1 5 0 1 5 0 c t 5 0 c t S A (g / A T M ) 1 , 5 % F o r m a lin a N a C l 0 , 9 %

O símbolo (+) indica diferença estatística quando comparado ao grupo que recebeu NaCl 0,9% (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey) . O símbolo (*) indica reposta nociceptiva significamente menor quando comparado a do grupo formalina 1,5%. O símbolo (#) indica resposta nociceptiva significamente menor que a dos grupos de SA (1,5 e 15 μg/ATM). Os dados estão expressos como média ± DP. Fonte: Autoria própria

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5.2. Avaliação da participação de receptores opioides no efeito antinociceptivo do SA.

O pré-tratamento com a injeção intra-articular do antagonista não seletivo dos receptores opioides (Naloxona, 10 μg/ATM), reduziu significativamente o efeito do SA (50 µg/ATM) na nocicepção induzida pela formalina 1,5% (Figura 3). Este resultado sugere a participação dos receptores opioides no efeito antinociceptivo do SA, sendo assim, para avaliar qual receptor opioide estaria envolvido neste efeito os animais foram tratados com o antagonista do receptor δ-opioide ICI 174,864 (30 µg/ATM), ou antagonista do receptor μ-opioide CTOP (120 µg/ATM), ou do antagonista do receptor κ-opioide Nor-BNI (200 µg/ATM). Os resultados demonstraram que os antagonistas dos receptores δ-, κ- e μ-opioide reduziram o efeito antinociceptivo induzido pelo SA (50 µg/ATM) (Figura 3).

Figura 3. Avaliação da participação dos receptores opioides no efeito antinociceptivo do SA na ATM de ratos. 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 C o m p o rt a m e n to n o c ic e p ti v o ( s ) S A 5 0 g /T M J F o r m a lin a 1 . 5 % N L X v e íc u lo IC I C T O P N o r - B N I + * * _* * * # # _# #

O símbolo (+) indica diferença estatística significativa maior quando comparado ao grupo NaCl 0,9% (p<0.05: ANOVA, teste de Tukey). O símbolo (*) indica resposta significativamente menor quando comparado a do grupo formalina 1,5%. O símbolo (#) indica diferença estatística significativamente maior quando comparado ao grupo SA (50 μg/ATM). Os dados são expressos como média ± DP. Fonte: Autoria própria

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5.3. Avaliação da participação da via GMPc/PKG/K+ATP no efeito antinociceptivo

do SA.

A coadministração do inibidor do GMPc ODQ (8 µg/15 µl), ou o inibidor da proteína quinase G (PKG) KT5823 (1,5 µg/ATM), ou o inibidor do canal de potássio sensível ao ATP (K+ATP) Glibenclamida (160 µg/ATM) com o SA, não modificou o

efeito antinociceptivo induzido pelo SA na resposta nociceptiva induzida pela injeção intra-articular de Formalina 1,5% (Figura 4).

Figura 4. Avaliação da participação da via GMPc/ PKG/K+ATP no efeito antinociceptivo

do SA na ATM de ratos. 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 R e s p o s ta n o c ic e p ti v a ( s ) S A 5 0 g / A T M 1 , 5 % F o r m a lin a O D Q K T 5 8 2 3 G li b * * * *

O símbolo (*) indica resposta significativamente menor quando comparado a do grupo formalina 1,5%. (p<0.05: ANOVA, teste de Tukey). Os dados são expressos como média ± DP.

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5.4. Avaliação do efeito do SA na migração leucocitária induzida pela formalina na ATM de ratos.

O pré-tratamento com uma injeção intra-articular com o SA (1,5, 15, 50 e 150 µg/ATM) reduziu significativamente a migração de leucócitos induzida pela injeção intra-articular de formalina 1,5% na ATM de ratos (Figura 5).

Figura 5. Avaliação do efeito do SA na migração leucocitária induzida pela formalina na ATM de ratos. 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 L e u c ó c it o s x 1 0 4 c e l/ c a v id a d e 1 , 5 1 5 5 0 1 5 0 S A (g / A T M ) 1 , 5 % F o r m a lin a N a C l 0 , 9 % + * * * * # # #

O símbolo (+) indica diferença estatística quando comparado ao grupo que recebeu NaCl 0,9% (p<0,05: ANOVA, Tukey test). O símbolo (*) indica migração leucocitária significativamente menor quando comparado a do grupo formalina 1,5% (p<0,05: ANOVA, Tukey test). O símbolo (#) indica migração leucocitária significativamente menor que a do grupo SA 1,5 µg/ATM. Os dados são expressos como média ± DP. Fonte: autoria própria.

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5.5. Efeito do SA na expressão da molécula de adesão ICAM-1 e do fator de aceleração de decaimento CD 55.

O efeito do SA na migração leucocitária induzida pela injeção intra-articular de formalina na ATM, não está associado a uma alteração da expressão da ICAM-1 ou CD55 (Figura 6A e B).

Figura 6. Efeito do SA na expressão da molécula de adesão ICAM-1 e do fator de aceleração de decaimento CD 55. 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 E x p re s s ã o d e I C A M ( D O ) S A 5 0g / A T M 1 , 5 % F o r m a lin a N L X 1 0g / A T M A E x p re s s ã o C D 5 5 (D O ) 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 S A 5 0g / A T M ) 1 . 5 % F o r m a lin a N L X 1 0g / A T M B

A análise por Western Blot demonstrou que o tratamento com uma injeção intra-articular de SA (50 μg/ATM) não alterou o nível proteico das moléculas ICAM-1 e CD55 (p>0,05: ANOVA, Tukey test). Fonte: autoria própria.

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5.6. Efeito do SA na liberação de TNF-α e IL-1β induzido pela formalina na ATM de ratos.

Os resultados demonstraram que a injeção intra-articular de SA (50 µg/ATM) reduziu significativamente a liberação da citocina pró-inflamatórias TNF-α (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey), mas não de IL-1β (p>0,05), induzido pela formalina 1,5% na ATM (Fig. 7A e B).

Figura 7. Efeito do SA na liberação de TNF-α e IL-1β induzido pela formalina na ATM.

0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 N a C l 0 , 9 % + * * T N F - ( p g /m l) S A ( 5 0g / A T M ) 1 , 5 % F o r m a lin a N L X 1 0g / A T M A 0 2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 1 2 5 0 1 5 0 0 IL -1 ( p g /m g ) * _* * N a C l 0 , 9 % S A ( 5 0g / A T M ) 1 , 5 % F o r m a lin a N L X 1 0g / A T M

(A) O símbolo (+) indica liberação de TNF-α significativamente maior quando comparada a do grupo NaCl 0,9% (p>0,05; ANOVA, Tukey test). O símbolo (*) indica liberação de TNF-α significativamente menor quando comparado ao grupo formalina 1,5%. (B) O símbolo (*) indica liberação de IL-1β significativamente maior quando comparada a do grupo NaCl 0,9% (p>0,05; ANOVA, Tukey test). Os dados são expressos como média ± DP. Fonte: autoria própria.

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5.7. Avaliação do efeito do SA na liberação de substancia P na ATM de ratos. A administração intra-articular de SA (50 µg/ATM) reduziu significativamente a liberação de substância P induzida pela formalina na ATM (p<0,05: ANOVA, teste de Tukey) (Figura 8).

Figura 8. Avaliação do efeito do SA na liberação de substancia P induzido pela formalina na ATM. S u b s t P ( p g /m l) 0 . 0 0 0 . 1 0 0 . 2 0 0 . 3 0 0 . 4 0 N a C l 0 , 9 % S A 5 0 g / A T M ) 1 . 5 % F o r m a lin a N L X 1 0g / A T M * _* +

O símbolo (+) indica liberação de substância P significativamente maior quando comparada a do grupo NaCl 0,9% (p<0,05; ANOVA, Tukey test). O símbolo (*) indica liberação de substância P significativamente menor quando comparado ao grupo formalina 1,5%.

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6. DISCUSSÃO

O Óxido Nítrico (ON), um gás difusível natural, é produzido a partir da conversão de L-arginina para L-citrulina através de isoformas de ON sintetases, estando envolvido na regulação de várias funções fisiopatológicas (Cunha et al., 2010; Paolocci et al., 2007). O nitroxil (HNO) é a forma reduzida em um elétron e protonada do ON, recentemente vem se destacando como um novo congênere redox, com distintas ações farmacológicas e vantagens terapêuticas. Evidências tem demonstrado que perifericamente os doadores de HNO bloqueiam diretamente a hiperalgesia inflamatória (Cury et al., 2011) e modulam a neurotransmissão da dor (Cunha et al., 2010), conferindo assim ao HNO importante função biológica.

O Sal de Angeli (SA), ou trioxodinitrato de sódio (Na2N2O3) é o doador

sintético mais comumente utilizado no estudo biológico do HNO (Paolocci et al., 2007). Tem sido demonstrado que o SA apresenta efeito antinociceptivo em modelos de hiperalgesia mecânica induzida por uma variedade de estímulos como carragenina, LPS, citocinas e PGE2 (Zarpelon et al., 2013). Corroborando com estes

estudos, os resultados deste trabalho demonstraram que o pré-tratamento com SA foi capaz de reverter a hiperalgesia inflamatória induzida pela formalina na articulação temporomandibular de ratos.

Em um estudo prévio, foi demonstrado que o SA inibiu a hiperalgesia inflamatória induzida pela carragenina na pata de ratos através da ativação da via intra-celular GMPc/PKG/K+ATP de forma independente da ativação de receptores

opioides periféricos (Zaperlon et al., 2013). No entanto, nossos resultados demonstraram que o efeito antinociceptivo induzido pelo SA na ATM de ratos, pelo menos em parte, é dependente de receptores opioides endógenos, subtipos capa, delta e mμ; localizados na fibras C-nociceptivas aferentes primárias.

Diferenças entre tecidos subcutâneos e profundos, como os que envolvem a ATM já vem sendo descrito pela literatura. Inicialmente, a inervação predominante dos dois tecidos apresentam diferentes subconjuntos de fibras neuronais primárias. Considerando que os tecidos profundos apresentam maior excitabilidade de fibras nervosas centrais quando comparados aos tecidos subcutâneos, pode-se concluir que distúrbios sensoriais podem resultar em mais condições dolorosas em tecidos profundos quando comparados a tecidos superficiais (Imbe et al., 2001). Sendo assim, é válido hipotetizar que os sistemas de

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modulação de dor, como por exemplo, o sistema opioide, pode ser mais efetivo nos tecidos profundos como os tecidos adjacentes da ATM.

O sistema opioide tem sido descrito como mediador do efeito antinociceptivo de diferentes drogas quando administradas diretamente na ATM (Clemente et al., 2004; Pena-dos-Santos et al., 2009; Araújo et al., 2017; Coura et al., 2017). Uma vez ativados, os receptores opioides localizados nas fibras C-nociceptivas primárias resultam na ativação da via intra-celular ON/GMPc/ PKG/K+ATP resultando em hiperpolarização destas células e consequentemente

analgesia (Clemente et al., 2009; Pena-dos-Santos et al., 2009). Sendo assim, seria possível sugerir que o efeito antinociceptivo induzido pelo SA na ATM seria mediado por ativação de receptores opioides (conforme demonstrado por este estudo) e da via intra-celular GMPc/ PKG/K+ATP, como previamente descrito (Zarpelon et al.,

2013).

Os resultados do nosso estudo demonstraram que a administração de inibidores seletivos para GMPc, PKG e canais K+ATP, não foram capazes de alterar a

resposta analgésica do SA (Figura 3), ou seja, o efeito antinociceptivo do SA na ATM é dependente da ativação de receptores opioides mas não da ativação da via intra-celular GMPc/ PKG/K+ATP. Frente a estes resultados pode-se sugerir que o SA possa

estar atuando diretamente em células residentes, como macrófagos, por exemplo, liberando peptídeos opioides endógenos, e estes por sua vez, ativando os receptores opioides periféricos das fibras C-nociceptivas primárias (Macedo et al., 2016). Recentemente foi demonstrado que o SA é capaz de promover alteração fenotípica em macrófagos, do tipo M1 (classicamente ativados), com características pró-inflamatórias, para M2 (alternativamente ativados), de caráter resolutivo do processo inflamatório através da liberação de peptídeos opioides endógenos (Andrews et al., 2016).

A ativação de receptores opioides por peptídeos opioides endógenos está associada com a ativação de outras vias intracelulares. Sabe-se que a ativação dos receptores kappa-opóides (KOR) induz uma ativação de canais de potássio simultaneamente com uma ação inibitória dos canais de cálcio, de forma a hiperpolarizar a membrana neural (Bruchas et al., 2010). Além dessa ação direta sobre os canais iônicos, a ativação dos receptores KOR leva a uma inativação da síntese de AMPcíclico, inibindo a ativação da cascata de sinalização neuronal, como por exemplo, ativação das proteinoquinases PKA e PKC, que são vinculadas a

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processos pró-nociceptivos (Minneman & Iverson 1976; Bruchas et al., 2010).

O processo inflamatório na articulação temporomandibular é resultado da liberação de citocinas pró-inflamatórias (Kopp, 2001), as quais contribuem para a remodelação da articulação e degradação da cartilagem (Vernal et al., 2008). No endotélio, o TNF-α e outras citocinas podem induzir uma regulação aumentada de moléculas de adesão em leucócitos e células endoteliais, levando ao aumento da migração do lúmen vascular para o tecido conjuntivo, potencializando a quimiotaxia inflamatória (Moen et al., 2005).

Dentro desse contexto foi levantada a hipótese de que o efeito antinociceptivo do SA poderia estar associado a um efeito anti-inflamatório. Inicialmente os resultados demonstram que o SA reduziu significativamente a migração de leucócitos induzida pela injeção intra-articular de formalina (Figura 4). Sabe-se que a migração de leucócitos pode ser essencial para o aumento da permeabilidade de parede do vaso, formação de exsudato e indução de dor induzida por certos estímulos inflamatórios (Cunha et al., 2008). A adesão e transmigração do leucócito dos vasos sanguíneos para dentro dos tecidos são reguladas pela ligação de moléculas de adesão complementar encontradas na superfície do endotélio e mediadores químicos.

A ICAM é uma molécula de adesão intercelular continuamente presente em baixas concentrações nas membranas dos leucócitos e células endoteliais, podendo ser induzida por interleucina-1 (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF), e é expressa pelo endotélio vascular, macrófagos e linfócitos. Quando ativados, os leucócitos se ligam às células endoteliais através de ICAM-1 e, em seguida migram para os tecidos. (Zarbock et al., 2011). Considerando que o mecanismo do processo inflamatório envolve adesão de células inflamatórias e sua transmigração mediada pelos leucócitos do tipo β2 integrinas, os quais se interagem com imunoglobulinas como a ICAM, levantamos a hipótese de que o efeito anti-inflamatório SA se deve, pelo menos em parte, pela diminuição da expressão da ICAM. No entanto, nossos resultados demonstraram que o SA não interfere na expressão da ICAM durante o processo inflamatório induzido pela formalina na ATM de ratos (Figura 5A).

Apesar da ICAM-1 estar presente na maioria das células endoteliais e estar diretamente envolvida na adesão e transmigração de células durante o processo inflamatório, outros mediadores como o Fator de Aceleração de Decaimento (também conhecido como CD55) também interferem neste processo. Ao

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contrário da ICAM-1, o CD55 é uma molécula anti-adesiva que promove a depuração da ligação dos leucócitos com as células endoteliais. Tem sido demonstrado que existe uma interação entre o CD55 e a ICAM-1 (Shafren et al., 2000), e esta interação limita a ligação de leucócitos com a ICAM-1. Sendo assim, foi avaliado se a redução da migração de células inflamatórias pelo SA poderia estar associada ao aumento da expressão da molécula CD55. Contrariando a hipótese, os nossos resultados demonstraram que não há diferença na expressão do CD 55 entre os grupos testados (Figura 5B).

Os trabalhos de Cunha et al. (1992) e Zarpelon et al. (2013) mostraram que a inibição da migração de células polimorfonucleares leva a inibição da sequência de liberação de mediadores da hipernocicepção inflamatória iniciados pelo TNF-α, responsáveis.pela liberação de IL-1β e quimiocinas (Zarpelon et al, 2013).

Tem sido demonstrado que após a indução de um processo inflamatório, o TNF- α é a primeira citocina a ser liberada, de modo que é considerada a citocina-chave do processo inflamatório (Cunha et al., 1992). Nossos resultados demonstraram que pré- tratamento com SA reduziu significativamente a liberação de TNF- α, mas por outro lado não foi capaz de diminuir a liberação de IL-1β induzida pela injeção intra-articular de formalina 1,5%.

O processo inflamatório envolve uma série de mediadores químicos liberados no local da lesão que tem por finalidade sensibilizar os nociceptores. Alguns dos principais mediadores inflamatórios que compõem a “sopa inflamatória” são peptídeos (bradicinina), lipídios (prostaglandinas), neurotransmissores (serotonina [5-HT] e ATP) e neurotrofinas (NGF). Estes mediadores são capazes de sensibilizar/excitar os nociceptores aferentes primários, tendo como principal função a transmissão aferente para o corno dorsal da medula espinhal. Além disso, essa sensibilização permite através de uma função eferente dos nociceptores denominada transporte antidrômico, iniciar o processo de inflamação neurogênica. Neste processo, dois neurotransmissores têm grande destaque, Substância P (SP) e do Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), pois desempenham funções cruciais para a manutenção do processo inflamatório como aumentar o fluxo sanguíneo local e a permeabilidade vascular, promovendo a ativação de células leucocitárias (mastócitos e neutrófilos), que contribuem para a manutenção deste processo inflamatório (Snijdelaar et al., 2000; Julius D, Basbaum AI. 2001). Neste

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contexto, nosso estudo demonstrou que o tratamento com SA foi capaz de inibir a liberação de substância P no tecido periarticular da região temporomandibular de ratos.

Frente a estes dados é possível sugerir que o efeito antinociceptivo do SA na ATM está associado a ativação de células residentes, como macrófagos residentes, resultando em dois efeitos: (1) aumentando a liberação de peptídeos opioides endógenos, os quais teriam uma ação direta nos receptores opiodes localizados nas fibras C-nociceptivas, hiperpolarizando estas células e reduzindo uma ação antidrômica do neurônio, demonstrado através da redução de liberação de SP, resultando em uma menor sinalização para a quimiotaxia inflamatória. (2) diminuindo a liberação de TNF-α, o qual apresenta papel chave na sinalização da migração leucocitária durante o processo inflamatório, além de reduzir vias de segundos mensageiros relacionados com a hiperalgesia inflamatória (Verri et al., 2006).

Este estudo demonstrou que a administração direta na ATM do doador de nitroxila, Sal Angelis, foi capaz de induzir uma diminuição na hiperalgesia inflamatória induzida pelo agente inflamatório formalina. Este efeito foi mediado pela ativação de receptores opioides localizados nas fibras C-nociceptivas, diminuição da migração de células inflamatórias e diminuição da liberação da citocina pró-inflamatória TNF-α. Assim sendo o uso do Sal Angelis, surge como uma promessa terapêutica como um potente efeito analgésico e anti-inflamatório mediado pelos receptores opioides, mas independente da ativação da via intra-celular ON/GMPc.

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7. CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou que a administração direta na ATM do doador de nitroxila, Sal Angelis, foi capaz de induzir uma diminuição na hiperalgesia inflamatória e quimiotaxia inflamatória induzida pelo agente inflamatório formalina. Este efeito foi mediado pela ativação de receptores opioides localizados nas fibras C-nociceptivas, no entanto, independente da ativação da via intra-celular ON/GMPc.

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