Diferentes níveis de efeito tóxico podem ser obtidos em função das diferentes diluições do agente químico ou condição, empregada nos experimentos de toxicidade. Desta forma, é necessário dispor de métodos estatísticos para determinar um único valor, que represente o conjunto dos dados gerados. Para os testes de toxicidade crônica e crônica de curta duração, determinam-se a Concentração de Efeito Não Observado (CENO), a qual representa a maior concentração onde não se observa efeito e a Concentração de Efeito Observado (CEO), responsável por apresentar a menor concentração onde observou-se efeito. Pode-se determinar também o valor crônico (VC), que é a média geométrica da CENO e da CEO e mais recentemente a ICp, que é a concentração percentual de inibição (CESAR, 1997).
Para cada experimento, deve-se adotar um método estatístico apropriado. Hoje no mercado tecnológico, é possível encontrar disponíveis, gratuitamente, diversos softwares estatísticos. Porém, é necessário verificar a qualidade destes programas no seguimento educacional (DA SILVA et al., 2014).
O software BioEstat foi desenvolvido especialmente para estudantes de graduação e pós-graduação das áreas médicas e biológicas. Possui métodos paramétrico e não-paramétricos disponíveis, que devem ser empregados de acordo com os dados obtidos no experimento. Possui como objetivo propiciar aos acadêmicos de diversas áreas do conhecimento um instrumento de grande praticidade e de fácil manuseio na avaliação de informações originadas através de pesquisa (AYRES et al., 2007, apud DA SILVA et al. 2014).
O software também apresenta grande potencial de uso devido à facilidade de aquisição, por meio gratuito e virtual, além de apresentar fácil instalação e possuir um manual autoexplicativo.
Para o uso de dados paramétricos, é importante utilizar métodos para verificar se a distribuição dos dados utilizados se ajusta a uma distribuição normal. Metodologias como Shapiro-Wilks, Qui-quadrado e a análise visual de alguns gráficos são alguns dos testes existentes para verificação da hipótese de normalidade (TORMAN et al., 2012).
Todavia, Torman et al. (2012) salienta que o desempenho dos testes é, em geral, muito ruim em pequenos tamanhos amostrais. Os autores, recomendam não
proceder ao teste de normalidade e partir diretamente para uma estratégia não- paramétrica de análise para amostras de tamanho menor ou igual a 10.
Neste trabalho, utilizou-se o programa estatístico BioEstat 5.3. Os resultados foram submetidos ao teste Kruskal-Wallis, e posteriormente submetido ao método Student Newman Keuls, responsável por realizar a comparação de médias dos postos duas a duas. Avaliou-se se houve diferença significativa (p<0,05) entre o controle laboratorial e as demais amostras. As amostras que apresentaram diferença estatística significativa, em relação ao controle, foram consideradas tóxicas (ABNT, 2005).
O teste de Kruskal-Wallis ou teste H consiste na versão, não paramétrica, análoga do teste F (análise paramétrica), o qual tem por objetivo comparar somente as variações entre os tratamentos, cujo resultado é traduzido no valor do F-teste. No teste não paramétrico, quando o teste H for significativo, o BioEstat disponibiliza dois métodos de comparações de médias dos postos: Dunn e Student-Newman Keuls. A fertilidade de Daphnia similis em cada um dos diferentes ensaios foi avaliada através da comparação do número médio de neonatas produzida por fêmea viva por réplica em cada um dos ensaios. Os dados foram analisados estatisticamente pelo programa BioEstat 5.3, no qual utilizou-se do teste Kruskal-Wallis, comparando as diferenças médias dos postos pelo método Student-Newman Keuls.
Nos demais testes crônicos foi avaliada a existência de diferença significativa (p<0,05) entre o controle laboratorial e as demais amostras, utilizando-se dos métodos acima citados. Os dados utilizados para D. similis e C. dubia correspondem ao número médio de neonatas produzidas por fêmea viva em cada réplica.
Para o teste crônico em Raphidocelis subcapitata, os dados utilizados correspondem a biomassa algal produzida por réplica. Considerou-se tóxicas as concentrações que apresentaram diferença estatística significativa, correspondendo à Concentração de Efeito Observado (CEO) (ABNT, 2005).
5 RESULTADOS E DISCUSSSÃO
Os resultados obtidos nos diferentes ensaios de fertilidade para D. similis estão apresentados na Tabela 3 e Figuras 9 e 10. Para verificar os dados observados, foi utilizado o programa BioEstat, através do qual não foram constatadas diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes ensaios. Entretanto, os resultados apresentados no Ensaio C, foram utilizados apenas como indicativos da natalidade de D. similis, pois, a sua alta mortalidade (Figura 11) no início do teste (superior a 20%) inviabiliza a validação deste resultado.
Para avaliação do número de neonatos produzidos, descartaram-se as réplicas onde houve mortalidade maternal antes do 19º dia de seu ciclo de vida. Medida tomada tendo em vista que os picos reprodutivos ocorreram entre o 7° e o 18° dia do ciclo de vida, assim como previsto em Jaconetti (2005).
Figura 9 – Neonatos produzidos por D. similis em cada troca nos diferentes ensaios.
Fonte: Próprio autor. 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 3 º 5 º 8 º 1 0 º 1 2 º 1 5 º 1 7 º 1 9 º 2 1 º N º N EO N A TOS PO R A D UTOS DIA Ensaio A: 5 neonatos; 4 réplicas; 50 mL sol. teste
Ensaio B: 1 neonatos; 10 réplicas; 40 mL sol. teste
Figura 10 – Média de neonatos produzidos por D.similis em diferentes ensaios.
Fonte: Próprio autor.
Tabela 3 – Média de neonatos produzidos por D. similis em diferentes ensaios.
Réplicas Ensaio A Ensaio B Ensaio C 1 74,8 70,0 76,0 2 92,2 69,0 85,0 3 89,5 78,0 53,0 4 94,7 75,0 78,0 5 - 70,0 65,0 6 - 80,0 * 7 - 98 * 8 - 81 * 9 - 81 * 10 - * * Média 87,8 78,0 71,4 Mediana 90,9 78,0 76,0
* Descartado (morte maternal anterior ao 17º dia) - Não existente
Fonte: Próprio autor. 87,8 78,0 71,4 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Ensaio A: 5 neonatos; 4 réplicas; 50 mL sol. teste
Ensaio B: 1 neonatos; 10 réplicas; 40 mL sol. teste
Ensaio C: 1 neonatos; 10 réplicas; 20 mL sol. teste
N º DE N EO N A TOS PRODUZIDOS
Figura 11 – Mortalidade em diferentes cultivos de D. similis.
Fonte: Próprio autor.
Ademais, todos os ensaios apresentaram valores semelhantes e condizentes a USEPA (2002). O qual estipulou para validação do teste, o mínimo de 40 neonatos produzidos por fêmea no período de 21 dias nos controles dos ensaios de toxicidade crônica com D. magna. Indicando, portanto, a viabilidade do uso de metodologias feitas para Daphnia magna em testes utilizando Daphnia similis (Ensaio A) e o uso de pequenos volumes de solução teste (Ensaio C).
Além dos ensaios de fertilidade em diferentes cultivos, testes de toxidade crônica utilizando D. similis, nas condições do ensaio A (Tabela 4 e 10 e Figura 12), foram realizados cg e comparados aos testes de toxidade crônica realizados utilizando R. subcapitata e C. dubia. Soluções de cloreto de sódio foram utilizadas nos testes crônicos visando proporcionar uma comparação entre a sensibilidade dos testes já normatizados e do teste proposto.
A escolha deste ensaio como referência para comparação com os demais testes citados, foi feita com base em seu melhor rendimento, mesmo que não significativamente estatístico, frente aos ensaios de fertilidade B e C e sua menor necessidade de réplicas. Implicando assim em menores volumes de solução-teste necessários para a realização do teste e facilitando sua realização.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 1 º 3 º 5 º 8 º 1 0 º 1 2 º 1 5 º 1 7 º 1 9 º 2 1 º % M ORTAL ID A D E DIA Ensaio A: 5 neonatos; 4 réplicas; 50 mL sol. teste Ensaio B: 1 neonatos; 10 réplicas; 40 mL sol. teste Ensaio C: 1 neonatos; 10 réplicas; 20 mL sol. teste
Tabela 4 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto de sódio. Réplicas Controle 0,5 g/L 1,0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 2,5 g/L 1 74,8 70,4 86,1 88,0 16,5 - 2 92,2 74,2 70,2 41,3 0,0 - 3 89,5 73,4 87,6 29,8 2,0 - 4 94,7 77,1 65,4 39,7 0,0 - Média 87,8 73,8 77,3 49,7 9,3 - Mediana 90,9 73,8 78,1 40,5 9,3 -
- Não avaliado (mortalidade maternal)
Fonte: Próprio autor.
No ensaio crônico utilizando Daphnia similis, podemos observar o decaimento do desempenho reprodutivo (Figura 12) em concentrações de cloreto de sódio superiores a 1,5 g/L. Tal diferença pode ser afirmada ao avaliarmos a existência de diferença estatisticamente significativa entre as médias dos tratamentos (Tabela 5). Confirmando a existência de toxidade a 1,5 g/L de NaCl.
Figura 12 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto de
sódio.
Fonte: Próprio autor. 87,8 73,8 77,3 49,7 9,3 0,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 N º DE N EO N A TOS PRODUZIDOS Concentração de NaCl (g/L)
Tabela 5 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos
por D.similis.
Tratamento Posto
Médio
Dif.
Postos p-valor Dif. Sig. Efeito
Controle 15,5 0,5 g/L 9,75 5,75 0,1277 1,0 g/L 10 5,5 0,1451 CENO 1,5 g/L 6,75 8,75 0,0205 * CEO 2,0 g/L 1,5 14 0,0025 * 2,5 g/L - - - - - Não avaliado
* Diferença estatisticamente significativa (p<0,05) CENO Concentração de Efeito Não Observado CEO Concentração de Efeito Observado
Fonte: Próprio autor.
Quanto aos ensaios utilizando Ceriodaphnia dubia (Tabelas 6 e 7 e Figuras 13), foi observada uma maior sensibilidade ao cloreto de sódio. Apresentando CEO em 1,0 g/L de NaCl.
Tabela 6 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de
cloreto de sódio. Réplicas Controle 0,5 g/L 1,0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 2,5 g/L 1 9 17 9 1 - - 2 19 15 13 3 - - 3 15 11 10 7 - - 4 15 13 4 5 - - 5 16 10 15 5 - - 6 17 17 7 3 - - 7 13 15 14 - - - 8 19 9 14 - - - 9 - 11 13 - - - 10 - - 6 - - - Média 15,4 13,1 10,5 4 Mediana 15,5 13 11,5 4
- Descartado (morte maternal)
Figura 13 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de
cloreto de sódio.
Fonte: Próprio autor.
Tabela 7 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos
por Ceriodaphnia dubia.
Tratamento Posto Médio Dif. Postos p-valor Dif. Sig. Efeito Controle 25,3125 0,5 g/L 20,4444 4,8681 0,3002 CENO 1,0 g/L 14,9 10,4125 0,0232 * CEO 1,5 g/L 4,25 21,0625 < 0,0001 * 2,0 g/L - - - - 2,5 g/L - - - - - Não avaliado
* Diferença estatisticamente significativa (p<0,05) CENO Concentração de Efeito Observado CEO Concentração de Efeito Não Observado
Fonte: Próprio autor.
Nos ensaios utilizando Raphidocelis subcapitata (Tabela 8 e Figuras 14 e 15), as concentrações onde ocorreram diferenças estatisticamente significativas foram maiores que as anteriormente apresentadas nos testes crônicos utilizando D. similis e C. dubia. 15,4 13,1 10,5 4,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 N º DE N EO N A TOS PRODUZIDOS Concentração de NaCl (g/L)
Tabela 8 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes
concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.
Réplicas Controle 0,5 g/L 1,0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 2,5 g/L
1 7,33E+06 5,81E+06 4,66E+06 4,73E+06 3,76E+06 3,26E+06 2 7,11E+06 4,13E+06 4,26E+06 4,51E+06 3,96E+06 3,76E+06 3 6,16E+06 5,08E+06 5,63E+06 5,73E+06 4,38E+06 2,91E+06
Média 6,87E+06 5,01E+06 4,85E+06 4,99E+06 4,03E+06 3,31E+06
Mediana 7,11E+06 5,08E+06 4,66E+06 4,73E+06 3,96E+06 3,26E+06 Fonte: Próprio autor.
Figura 14 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes
concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.
Fonte: Próprio autor. 6,87E+06
5,01E+06 4,85E+06 4,99E+06
4,03E+06 3,31E+06 0,00E+00 1,00E+06 2,00E+06 3,00E+06 4,00E+06 5,00E+06 6,00E+06 7,00E+06 8,00E+06 Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 BIOM A SS A PRODUZIDA ( C ÉL /mL ) Concentração de NaCl (g/L)
Figura 15 – Inibição do crescimento algal em diferentes concentrações da solução de NaCl
comparadas ao controle – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.
Fonte: Próprio autor.
A tabela 9 apresenta os resultados do teste Kruskall-Wallis nos dados de biomassa algal produzida (figura 14).
Tabela 9 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de biomassa
algal por Raphidocelis subcapitata.
Tratamento Posto
Médio
Dif.
Postos p-valor Dif. Sig. Efeito
Controle 17 0,5 g/L 11 6 0,1687 1,0 g/L 10 7 0,1083 1,5 g/L 11,3333 5,6667 0,1936 CENO 2,0 g/L 5,5 11,5 0,0083 * CEO 2,5 g/L 2,1667 14,8333 0,0007 *
* Diferença estatisticamente significativa (p<0,05) CENO Concentração de Efeito Observado CEO Concentração de Efeito Não Observado
Fonte: Próprio autor.
Desta maneira, pode-se observar uma maior sensibilidade do organismo Ceriodaphnia dubia à solução de cloreto de sódio (Tabela 10). Enquanto Raphidocelis subcapitata apresentou toxidade apenas em concentração maiores, mostrando-se menos sensível ao teste em questão. Toda via, apesar da necessidade de maior
27% 29% 27% 41% 52% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 IN IBIÇÃ O DO C R ES C IM EN TO Concentração de NaCl (g/L)
aprofundamento sobre o tema, D. similis mostrou-se adequada para a avaliação de toxidade crônica, apresentando sensibilidade à solução-teste utilizada, condizente com a encontrada em ensaios crônicos normatizados e vastamente empregados no pais.
Tabela 10 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio em diferentes testes de
toxidade crônica. Tratamento D. similis C. dubia R. subcapitata Controle 0,5 g/L 1,0 g/L * 1,5 g/L * * 2,0 g/L * - * 2,5 g/L - - * - Não avaliado * Efeito observado (p<0,05)
CENO Concentração de Efeito Observado CEO Concentração de Efeito Não Observado
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que os diferentes volumes de solução teste utilizados e o número de organismos por réplica, aparentemente, não influiu na reprodução de D. similis. Assim, a viabilidade da aplicação de metodologias existentes para ensaio com Daphnia magna em ensaio com Daphnia similis e o uso de pequenos volumes de solução-teste (20 mL), não possui quaisquer empecilhos para seu uso como metodologias para ensaios crônicos. Entretanto, o ensaio A utiliza de metodologia mais simplificada, facilitando sua montagem e replicação.
Quanto a sensibilidade do organismo Daphnia similis no ensaio crônico, o mesmo apresentou sensibilidade na faixa intermediaria às encontradas nos organismos Ceriodaphnia dubia e Raphidocelis subcapitata. Indicando assim, mais uma vez, sua aplicabilidade na avaliação de toxicidade, com grande potencial para ensaios crônicos.
Entretanto, ainda é necessário estudos futuros com diferentes organismos pertencentes a diversos níveis tróficos, os quais podem apresentar diferentes respostas aos poluentes.
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