LÍDIA INÁCIA DA SILVA RIBEIRO
COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS UTILIZANDO Daphnia sp. COMO BIOINDICADOR DE TOXIDADE CRÔNICA E SUA APLICABILIDADE EM Daphnia
similis
Lorena 2017
COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS UTILIZANDO Daphnia sp. COMO BIOINDICADOR DE TOXIDADE CRÔNICA E SUA APLICANILIDADE EM Daphnia
similis
Trabalho de conclusão de curso apresentado à Escola de Engenharia de Lorena – Universidade de São Paulo como requisito parcial para conclusão da Graduação do curso de Engenharia Ambiental.
Orientadora: Profª. Dra. Teresa Cristina Brazil de Paiva
Lorena 2017
importância a minha educação, me ensinando a importância do saber, me motivando a estudar e proporcionando todo o suporte necessário durante minha vida acadêmica. Aos amigos Jaime Dias e Ana Lúcia Dias, que me acolheram nos primeiros anos de formação. Obrigada por todo carinho e apoio em todos esses anos.
À minha mãe Maria Ceila da Silva Ribeiro, por sempre apoiar, incentivar e acreditar em minha capacidade.
A meu irmão Eduardo Vinícius da Silva Ribeiro, pelos anos de convivência em Lorena, pela paciência e apoio sempre oferecidos e pela nossa amizade.
À minha avó Maria das Graças Correia da Silva e ao meu avô Jairo Vicente da Silva, pelos muitos anos de amor dedicados à mim e o apoio aos estudos.
Às minhas tias e amigas Elenice Ribeiro, Maria das Graças Goulart Pereira, Maria Tereza Ribeiro Buschine, Maria Aparecida da Silva e ao meu tio e amigo José Gilson da Silva, por todo apoio e amizade.
À Profa. Dra. Teresa Cristina Brazil de Paiva pela paciência e orientação durante a elaboração deste trabalho, além da oportunidade da realização do estágio e toda aprendizagem obtida.
À técnica responsável, Lucia Bernardes de Almeida e ao doutorando Lucas Queiroz pela disposição em me auxiliar na execução do trabalho e pelo apoio durante todos os momentos.
Aos professores Morun Bernardino Neto e Ana Paula Nola Deski, pela participação na banca avaliadora e suas sugestões, contribuindo para a melhoria desse trabalho.
A todos os professores que amam aquilo que fazem, servindo como exemplo e ensinando o amor pelo saber. Especialmente ás professoras Regiane Florencio e Renata Marques Luiz dos Santos, ás quais me acompanharam durante o ensino médio e sem as quais eu não teria alcançado essa realização.
A todos os meus amigos de Lagoinha e Lorena, que me acompanharam e me ajudaram a enfrentar muitas coisas ao longo desse caminho e estão sempre ao meu lado.
“A felicidade só é real quando compartilhada.”
COMO BIOINDICADOR DE TOXIDADE CRÔNICA E SUA APLICABILIDADE EM Daphnia similis. 2017. 47 p. Monografia (TCC) – Escola de Engenharia de Lorena,
Universidade de São Paulo, Lorena, 2017.
O gênero Daphnia, grupo mais antigo utilizado em ensaios de toxidade, tem sua biologia amplamente estudada e grande participação na comunidade zooplanctônica em todo o mundo. Dentre as mais utilizadas em ensaios ecotoxicológicos podemos destacar D. pulex, D. pulicaria, D. magna e D. similis (BEATRICI, 2004). Diversos motivos são responsáveis por tal posição. Dentre eles, a importante posição ecológica que ocupa nas teias tróficas aquáticas e as importantes consequências, em todos os níveis do sistema aquático, em caso de alterações que ocorram nas populações. Constituem uma fonte de alimento relevante para a comunidade de peixes e são organismos relativamente fáceis de cultivar em ambiente não natural e de manusear ao longo de procedimentos experimentais (Castro et al. 2009). Embora não seja uma espécie nativa, D. similis é uma das espécies mais estudadas e utilizadas no país, assim como D. magna (ZAGATTO, 1988). Seu uso como bioindicador para avaliação da toxicidade aguda é usualmente o primeiro teste a ser aplicado, pois se trata de um teste rápido e a espécie altamente sensível a uma grande diversidade de poluentes (CETESB 1990). Toda via, poucos estudos utilizam Daphnia similis em ensaios crônicos. Considerando sua relevância nos atuais modelos em estudos ecotoxicológicos aquáticos e sua fácil manutenção em laboratório, este trabalho visa comparar as diferentes metodologias de avaliação de toxidade crônica em Daphnia sp. existentes, aplicando-as a Daphnia similis e comparando-a a métodos já normatizados para testes crônicos. Averiguando as melhores condições para viabilidade do teste e sua padronização.
A CHRONIC TOXICITY BIOINDICATOR AND ITS APPLICABILITY IN Daphnia similis. 2017. 47 p. Monografia (TCC) – Escola de Engenharia de Lorena,
Universidade de São Paulo, Lorena, 2017.
The genus Daphnia, the oldest group used in toxicity trials, has its biology widely studied and large participation in the zooplankton community worldwide. Among the most used in ecotoxicological trials we can highlight D. pulex, D. pulicaria, D. magna and D. similis (BEATRICI, 2004). Several reasons are responsible for such a position. These include the important ecological position it occupies in the aquatic webs and the important consequences at all levels of the aquatic system in case of changes that occur in their populations. They are a relevant food source for the fish community and are relatively easy to grow in an unnatural environment and to be handled through experimental procedures (Castro et al., 2009). Although not a native species, D. similis is one of the most studied and used species in the country, as well as D. magna (ZAGATTO, 1988). Its use as a bioindicator for the evaluation of acute toxicity is usually the first test to be applied, since it is a rapid test and the species highly sensitive to a great diversity of pollutants (CETESB 1990). However, few studies have used D. similis in chronic trials. Considering its relevance in the current models in aquatic ecotoxicological studies and its easy maintenance in the laboratory, this work aims to compare the different methodologies of evaluation of chronic toxicity in Daphnia sp. applied to Daphnia similis and comparing it to already standardized methods for chronic tests. Finding the best conditions for the feasibility of the test and its standardization.
Figura 1 – Morfologia Daphnia similis...17
Figura 2 - Representação esquemática da reprodução partenogenética de D. magna...18
Figura 3 – Ovos de resistência (efípio)...18
Figura 4 – Ceriodaphnia dubia...20
Figura 5 - Raphidocelis subcapitata...21
Figura 6 – Cristalizadores utilizados no cultivo de D. similis...24
Figura 7 – Cubas utilizadas no cultivo de Ceriodaphnia dubia...27
Figura 8 - Visualização Microscópica da Câmara de Neubauer...32
Figura 9 – Neonatos produzidos por D. similis em cada troca nos diferentes ensaios...35
Figura 10 – Média de neonatos produzidos por D. similis em diferentes ensaios...36
Figura 11 – Mortalidade em diferentes cultivos de D. similis...37
Figura 12 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto de sódio...38
Figura 13 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de cloreto de sódio...40
Figura 14 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata...41
Figura 15 – Inibição do crescimento algal em diferentes concentrações da solução de NaCl comparadas ao controle – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata...42
Quadro 1 - Testes de toxidade padronizados pela ABNT e CETESB...14
Quadro 2 - Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição – Meio MS...25
Quadro 3 - Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição...27
Tabela 1 – Normas referentes aos organismos utilizados...16 Tabela 2 – Testes crônicos utilizando Daphnia sp...19 Tabela 3 – Média de neonatos produzidos por D. similis em diferentes ensaios...36 Tabela 4 – Neonatos produzidos por D.similis em diferentes concentrações de cloreto de sódio...38 Tabela 5 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos por D.similis...39 Tabela 6 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de cloreto de sódio...39 Tabela 7 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos por Ceriodaphnia dubia...40 Tabela 8 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata...41 Tabela 9 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de biomassa algal por Raphidocelis subcapitata...42 Tabela 10 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio em diferentes testes de toxidade crônica...43
1 INTRODUÇÃO ... 11 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 13 2.1 Teste de Toxidade ... 13 2.2 Organismos Teste ... 15 2.2.1 Daphnia similis ... 16 2.2.2 Ceriodaphnia ... 20 2.2.3 Raphidocelis subcapitata ... 21 3 OBJETIVO GERAL ... 23 3.1 Objetivos específicos ... 23 4 METODOLOGIA ... 24 4.1 Manutenção e cultivo ... 24 4.1.1 Daphnia similis ... 24 4.1.2 Ceriodaphnia dubia ... 26 4.1.3 Raphidocelis subcapitata ... 28 4.2 Solução Teste ... 30
4.3 Daphnia similis – Ensaio de fertilidade e teste Crônico ... 30
4.4 Ceriodaphnia dubia -Teste Crônico ... 31
4.5 Raphidocelis subcapitata - Teste Crônico ... 32
4.6 Avaliação estatística dos resultados ... 33
5 RESULTADOS E DISCUSSSÃO ... 35
6 CONCLUSÃO ... 44
1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, em especial no pós-Revolução Industrial, uma imensa gama de substâncias químicas foram produzidas de forma intencional ou como subproduto de atividades produtivas. Algumas dessas substâncias são essencialmente sintéticas como pesticidas e fármacos. Já outras, apesar de terem ocorrência natural, tiveram sua concentração aumentada no meio ambiente, como ocorre com os hormônios. Nesse aspecto surge uma nova e vasta gama de micropoluentes, fonte de potenciais impactos desconhecidos (BILA; DEZOTTI, 2007).
A ecotoxicologia foi formada dada a necessidade de se conhecer os efeitos que tais poluentes, emergentes ou não, exercem quando lançados no meio ambiente, sobre populações e comunidades de organismos e como o homem pode ser afetado (FONSECA, 1991).
Para identificar os efeitos destas substâncias sobre a biota aquática, a ecotoxicologia utiliza testes de toxicidade com organismos presentes em águas continentais, estuarinas e marinhas, seja em condições laboratoriais ou de campo. Tais testes possibilitam estabelecer limites permissíveis para várias substâncias químicas, avaliando o impacto da mistura de diversos poluentes sobre os organismos aquáticos dos corpos hídricos receptores (BERTOLETTI, 1990).
Tal determinação é realizada através das concentrações em que determinado agente químico ou, em que concentrações, determinado efluente é potencialmente prejudicial ao corpo receptor. Onde, determinado poluente pode não produzir um efeito adverso se a concentração do produto for baixa, ou o tempo de contato for insuficiente. Entretanto, concentração e o tempo de exposição do microrganismo estão diretamente relacionados, de maneira que altas concentrações poderão ter efeitos prejudiciais em curtos tempos de exposição. Pequenas concentrações geralmente produzem efeitos crônicos sub-letais e, até mesmo, letais durante longos períodos de exposição. (FONSECA, 1991).
Enquanto a análise química identifica e quantifica substâncias em um efluente ou corpo hídrico, o ensaio ecotoxicológico detecta informações sobre o efeito conjunto de várias substâncias, que interagindo podem afetar a biota presente no ambiente aquático. Toda via, a grande diversidade e complexidade das substâncias existentes num mesmo efluente ou corpo hídrico torna inviável a sua completa caracterização, não só do ponto de vista analítico, como do econômico. (CETESB, 1986).
Desta maneira, os testes de toxicidade com organismos têm sido utilizados e apresentam grande importância na complementação das análises físico-químicas. Através do qual, podem ser estabelecidos padrões de emissão que permitam identificar problemas de lançamento em efluentes e contaminantes complexos, envolvendo a misturas de diferentes substâncias.
O gênero Daphnia, grupo mais antigo utilizado em ensaios de toxidade, tem sua biologia amplamente estudada e grande participação na comunidade zooplanctônica em todo o mundo. Dentre as mais utilizadas em ensaios ecotoxicológicos podemos destacar D. pulex, D. pulicaria, D. magna e D. similis (BEATRICI et al., 2006)
Diversos motivos são responsáveis por tal posição. Dentre eles, a importante posição ecológica que ocupa nas teias tróficas aquáticas e as importantes consequências em todos os níveis do sistema aquático em caso de alterações que ocorram nas suas populações. Constituem uma fonte de alimento relevante para a comunidade de peixes e são organismos relativamente fáceis de cultivar em ambiente não natural e de manusear ao longo de procedimentos experimentais (CASTRO et al., 2009).
Considerando sua relevância nos atuais modelos em estudos ecotoxicológicos aquáticos e fácil manutenção em laboratório, este trabalho visa comparar as diferentes metodologias de avaliação de toxidade crônica em Daphnia sp. existentes, aplicando a Daphnia similis e comparando a métodos já normatizados para testes crônicos. Averiguando as melhores condições para viabilidade do teste e sua padronização.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Teste de Toxidade
A ecotoxicologia permite o desenvolvimento de protocolos de testes de toxicidade a partir dos quais, é possível definir limiares de toxicidade. Gerando parâmetros fundamentais para criação de leis, fiscalização e controle da qualidade de rios. Diversos órgãos de proteção ambiental vêm se concentrando na elaboração e validação de sistemas e testes diagnósticos na busca por estratégias que visam proteger os ecossistemas (RONCO et al., 2004).
A utilização de testes padronizados tem como vantagem proporcionar sua uniformidade, facilitando a comparação dos dados de diferentes laboratórios e sua reprodutibilidade, contribuindo assim para o aumento da utilização dos dados publicados (RONCO et al., 2004).
No Brasil, os principais órgãos responsáveis pelo desenvolvimento de protocolos de testes de toxicidade são a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) e a Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental do Estado de São Paulo (CETESB).
Já no mundo, American Society for Testing and Materials (ASTM), Organisation for Economic Cooperationand Development (OECD), Association of Analytical Communities (AOAC) e International Organization for Standardization (ISO), são alguns dos principais órgãos de proteção ambiental.
A Quadro 1 representa as principais normas brasileiras referentes aos testes de toxicidade aquática.
Quadro 1 - Testes de toxidade padronizados pela ABNT e CETESB.
Organismo Efeito Espécie Normas brasileiras
Bactéria Agudo Vibrio fischeri CETESB, L5.227
Bactéria Agudo Spirillum volutans CETESB, L5.228
Alga Crônico Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus,
Pseudokirchneriella subcapitata
CETESB, L5.020 e ABNT, NBR12648
Microcrustáceo Agudo Daphnia similis, Daphnia magna CETESB, L5.018 e ABNT, NBR12713
Microcrustáceo Agudo Artemia salina CETESB, L5.021
Microcrustáceo Crônico Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia silvestrii
CETESB, L5.022 e ABNT, NBR13373 Peixe Agudo Danio rerio, Pimephales promelas CETESB, L5.019 e
ABNT, NBR15088 Fonte: OLIVI; COSTA, 2008
Os testes de toxicidade podem ser classificados em agudos e crônicos. E diferem-se na duração e nas respostas finais a serem medidas. Os testes de toxicidade aguda medem os efeitos de agentes tóxicos sobre espécies aquáticas durante um curto período de tempo em relação ao seu período de vida. E têm como objetivo estimar a concentração de um agente tóxico que será capaz de produzir uma resposta específica mensurável em um organismo-teste, em um período de tempo relativamente curto, geralmente de 24 a 96 h (OLIVI; COSTA, 2008).
Normalmente, o efeito medido em estudos de toxicidade aguda com organismos aquáticos é a letalidade ou alguma outra manifestação do organismo que a anteceda, por exemplo, o estado de imobilidade. Em testes crônicos, as variáveis estudadas são utilizadas, por exemplo, o crescimento e a reprodução dos animais, de modo que uma boa alimentação será crucial na garantia de um resultado confiável. Em ensaios de toxicidade aguda, os animais podem ou não ser alimentados. Cada procedimento possui suas vantagens e desvantagens (OLIVI; COSTA, 2008).
Para avaliação de testes de toxicidade crônica, utilizam-se normalmente os parâmetros CENO (Concentração do Efeito Não Observado), no qual é determinada a concentração do agente tóxico que não causa o efeito observado, ou CEO (Concentração do Efeito Observado), no qual a resposta representará a concentração que causa o efeito observado (CETESB, 1990).
2.2 Organismos Teste
Cesar et al. (1997), destaca que dentre diversas espécies de organismos empregadas internacionalmente em testes de toxicidade, os seguintes grupos de organismos são vastamente utilizados em ensaios laboratoriais: bactérias, peixes, oligoquetas, microalgas, microcrustáceos, equinoides e poliquetas.
Para Olivi e Costa (2008), tais grupos, que representam diversos ecossistemas e níveis tróficos, geram subsídios importantíssimos para a avaliação e caracterização dos efeitos agudos e crônicos em diversos agentes tóxicos e corpos receptores. E a sua escolha deve respeitar critérios como:
- Significativa representação ecológica dentro das biocenoses; - Conhecimento da biologia, fisiologia e hábitos alimentares; - Estabilidade genética e uniformidade das populações; - Baixo índice de sazonalidade;
- Sensibilidade constante e apurada.
Desta forma o conhecimento da biologia, cultivo e manutenção de organismos em laboratório, constituem aspectos fundamentais para a execução, interpretação e confiabilidade dos resultados de um teste de toxicidade. No entanto, é sabido que não existe uma única espécie de organismo-teste capaz de representar integralmente todos os efeitos causados em um determinado ecossistema. Sendo necessário empregar espécies de diferentes níveis da cadeia alimentar, a fim de se obter resultados mais precisos (PEREIRA, 2008).
Na tabela 1, são apresentadas as normas referentes aos organismos utilizados neste trabalho, assim como parâmetros avaliados e seus requisitos.
Tabela 1 – Normas referentes aos organismos utilizados.
Organismo Daphnia similis Ceriodaphnia dubia Raphidocelis subcapitata
Tipo Agudo Crônico Crônico
Norma NBR 12.713/04 NBR13.373/10 NBR 12648/05
Duração 48 horas 8 dias 96 horas
Tipo Estático Semi-estático Estático
Alimentação NÃO
SIM
*Diariamente NÃO
Nº de organismos por
réplica 5 1 105 cel/mL
Vol. de sol. Teste por
réplica 20 ml 15 ml 50 ml
Nº de replicas 4 10 3
Parâmetro avaliado Mortalidade Nº de neonatos Crescimento
Fonte: próprio autor.
2.2.1 Daphnia similis
Também conhecidas como “pulgas d’água” e pertencentes ao grupo Cladocera, as Daphnias (Figura 1) são comumente encontradas em lagos e represas de águas continentais. Possuem cerca de 0,1 a 5,0 mm de comprimento e são dotadas de uma carapaça transparente bivalve. Quando em condições naturais, alimentam-se basicamente de algas, bactérias e protozoários, além de uma grande variedade de detritos orgânicos, os quais são capturados através de seu sistema de filtragem. No qual, mecanismos complexos fazem com que as partículas alimentares coletadas sejam transferidas para um sulco alimentar meio-ventral, onde são envolvidas em muco e depois movidas para frente até as maxilas, que empurram o alimento para o interior da boca (CESAR et al.,1997).
Figura 1 – Morfologia Daphnia similis.
Fonte: RUPPERT e BARNES, 1996; PPHOTOEX,
2015
Sua estratégia reprodutiva (Figura 2) pode alternar entre assexuada (partenogênese) e sexuada, o que dependerá das condições ambientais presentes. Na assexuada o crescimento e desenvolvimento de um embrião se dá sem a fertilização, levando ao aumento rápido da população, formada apenas por clones fêmeas e expandindo substancialmente o número de indivíduos. Em condições ambientais desvantajosas ocorre a fase sexuada, onde originam-se ovos de resistência, conhecidos como efípio (Figura 3), que são capazes de sobreviver em estado latente. Eclodindo apenas quando as circunstâncias voltarem a ser favoráveis e desta forma, possibilitando a conservação da população (PEREIRA, 2008).
FIGURA 2 - Representação esquemática da reprodução partenogenética de D. magna.
Fonte: PEREIRA, 2008.
Figura 3 – Ovos de resistência (efípio).
Em condições naturais, Jaconetti (2005) observou que os picos reprodutivos ocorrem entre o 7° e o 18° dia do ciclo de vida, mostrando que as fêmeas apresentam tendência a diminuir o número de filhotes produzidos a partir o 20° dia.
Tais organismos são importantes em muitas cadeias alimentares, servindo como uma importante fonte de alimento para peixes. Além disso, características como ciclo de vida relativamente curto, facilidade de seu cultivo em laboratório, sensibilidade a vários contaminantes do ambiente aquático e necessidade de menores volumes de água de diluição devido ao seu pequeno tamanho e, consequentemente, menores volumes de amostras-teste, são responsáveis pelo grande emprego do microcrustáceo como bioindicador em testes de toxidade (SHAW; CHADWICK, 1998, p. 1927, apud OLIVI; COSTA, 2008)
Embora não seja uma espécie nativa, D. similis é uma das espécies mais estudadas e utilizadas no país, assim como D. magna (ZAGATTO, 1988). Sua utilização é relatada em inúmeros trabalhos recentes, abrangendo ensaios de diversos contaminantes emergentes, como nanopartículas, cosméticos e fármacos (ZHANG, 2017; RATH et al., 2016).
Seu uso como bioindicador para avaliação da toxicidade aguda é usualmente o primeiro teste a ser aplicado, pois se trata de um teste rápido e a espécie altamente sensível a uma grande diversidade de poluentes (CETESB, 1990). Toda via, poucos estudos a utilizam D. similis em ensaios crônicos.
A Tabela 2 apresenta os principais estudos utilizados nesse trabalho para a realização dos testes crônicos utilizando D. similis.
Tabela 2 – Testes crônicos utilizando Daphnia sp.
Referência
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Test
211, ano 2012. SOTERO-SANTOS et al, 2005. PRESTES et al, 2013.
Organismo D. magna D. similis D. similis
Volume de
amostra 50 - 100 mL 20 mL 40 mL
Nº de réplica 10 10 4
Org. por réplica 1 1 6
2.2.2 Ceriodaphnia
Pertencentes à família Daphnidae, as Ceriodaphnias possuem cultivo e biologia semelhantes aos das Daphnias. Porém são menores e possuem ciclo reprodutivos mais curto, produzindo de três a quatro crias por semana em condições ótimas. Apresentam ampla distribuição, e são consideradas uma das famílias mais diversificadas nas regiões temperadas (RAND, 1995).
O gênero é o mais representativo de águas do território brasileiro (ROCHA et al, 1995). Tendo sua ocorrência relatada na maioria dos reservatórios brasileiro, em muitos trabalhos sobre a diversidade de cladóceros (SAMPAIO, 2002; GÜNTZEL, 2000; ROCHA, 2000).
Figura 4 – Ceriodaphnia dubia.
Fonte: UNH Center for Fleshwater Biology
Em espécies nativas como C. silvestrii, o tamanho varia entre 0,39 mm ao nascer, 0,73 mm na primeira reprodução e 1,06 mm do adulto. A reprodução de C. silvestrii inicia-se no 5°dia, alcançando as três primeiras posturas entre 8 e 10 dias, portanto, para ensaios crônicos a duração dos testes será entre 8 e 10 dias, sendo que o teste deverá ser finalizado quando a espécie alcançar três posturas (JACONETTI, 2005).
2.2.3 Raphidocelis subcapitata
Anteriormente conhecida como Selenastrum capricornutum e Pseudokirchneriella subcapitata, Raphidocelis subcapitata (Figura 5) é uma microalga de aparência curvada e torcida. São unicelulares e possuem comprimento entre 8 e 14 μm, e uma largura entre 2 e 3 μm. É comumente usada como bioindicadora para avaliação dos níveis de nutrientes ou substâncias tóxicas em ambientes de água doce. Esta espécie é bastante sensível à presença de substâncias tóxicas, incluindo metais e tem uma vasta distribuição (KRIENITZ et al., 2011).
FIGURA 5 - Raphidocelis subcapitata.
Fonte: Algae Resourse Database, 2006.
São componentes importantes na cadeia alimentar do ambiente aquático, sendo responsável não somente pela produção primária, mas também pelo estabelecimento de importantes relações bióticas. Sua utilização em testes de toxicidade apresenta grande importância já que qualquer alteração da composição específica da comunidade fitoplanctônica pode afetar a base e a função de todo o ecossistema (SILVA, 2012). Além disso, seu ciclo de vida curto, altas taxas de crescimento, facilidade para manter as culturas e sua capacidade de crescer em
meios sintéticos bem definidos, faz deste o organismo um dos mais importantes para avaliação da toxicidade aquática (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004)
Nos testes ecotoxicológico utilizando Raphidocelis subcapitata, o parâmetro avaliado é a inibição ou estimulo do crescimento algáceo, devido ao fator de estresse ocasionado em função da exposição às amostras, ambientais ou não, em relação ao controle laboratorial. Em testes algáceos a produção de clorofila e possíveis alterações morfológicas, entre outras respostas, também podem ser avaliadas (SILVA, 2012).
3 OBJETIVO GERAL
Utilizar Daphnia similis como bioindicador de toxidade crônica e comparar a viabilidade de diferentes métodos de avaliação.
3.1 Objetivos específicos
Adotar o organismo Daphnia similis como bioindicador de toxidade crônica;
Comparar metodologias existentes de avaliação de toxidade crônica que utilizam Daphnia sp. e aplicá-las a Daphnia similis.
Comparar a sensibilidade dos resultados dos testes de toxicidade crônica com Daphnia similis com a dos resultados obtidos a partir dos organismos Ceriodaphnia dubia e Raphidocelis subcapitata.
4 METODOLOGIA
4.1 Manutenção e cultivo
4.1.1 Daphnia similis
Os organismos foram mantidos em cristalizadores (Figura 6), com capacidade de 1,8 litros, onde foram alocados aproximadamente 50 organismos em 1,6 litros de água reconstituída. A água reconstituída teve sua dureza, pH e condutividade previamente testados e aprovados. Os parâmetros de pH devem estar entre 7,0 e 7,6 e a dureza total deve ser em torno de 40 a 48 mg/L de CaCO3.
Figura 6 – Cristalizadores utilizados no cultivo de D. similis.
Fonte: Próprio autor.
O meio MS, proposto por Keating (1985), foi preparado a partir das soluções descridas no Quadro 2. Das quais, foram utilizadas cerca de 5 mL das soluções 1 e 2; 1,0 mL de cada umas das soluções 3, 4, 5, 6, e 7; e 4,0 mL da solução estoque para cada litro de água reconstituída preparada.
Quadro 2: Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição – Meio MS.
Solução Reagente Qnt (g) Preparo
1
NaNO2 10
Dissolver e diluir com água destilada em balão volumétrico de 1000 mL Na2SiO3 1,718 KH2PO4 1,8125 K2HPO4 2 2 KCl 2
Dissolver e diluir com água destilada em balão volumétrico de 1000 mL MgSO4.7H2O 5,1455
3 CaCl Dissolver e diluir com água destilada em
balão volumétrico de 500 mL
4
EDTA 1,25
Dissolver e diluir com água destilada em balão volumétrico de 1000 mL H3BO3 1,4 FeCl3.6H2O 0,483 MnCl2.4H2O 0,18 LiCl 0,1517 RbCl 0,0355 SrCl2.6H2O 0,0758 NaBr 0,016 Na2MoO4.2H2O 0,0315 CuCl2.2H2O 0,0168 ZnCl2 0,013 CoCl2.6H2O 0,005 KI 0,00165 5 SeO2 0,0014
Dissolver e diluir com água destilada em balão volumétrico de 1000 mL
6 NH4VO3 0,0011
Dissolver e diluir com água destilada em balão volumétrico de 1000 mL 7 Vitamina B12 0,0010 Dissolver e diluir com água destilada em
balão volumétrico de 1000 mL
Em casos onde a dureza da água apresentou valores inferiores a 40 mg CaCO3/L, o volume de solução a ser acrescentada para cada miligrama de dureza a
ser aumentado foi de 0,5 mL da solução 1 e 0,25 mL da solução 2 por litro de água reconstituída.
As culturas foram mantidas em câmaras de germinação (SOLAB - Mod. DAKO 340), com a temperatura controlada em 20 +/- 2°C e fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, a uma intensidade luminosa de, aproximadamente, 1000 lux.
A sala de manutenção das culturas foi mantida limpa, isenta de poeira e vapores tóxicos. Apesar da importância da manutenção da temperatura para sobrevivência destes organismos, não foi possível controlar a temperatura do ambiente durante as trocas do cultivo.
Os organismos foram alimentados diariamente com 1,5 mL de alimento composto e 2,5 mL da alga Raphidocelis subcapitata e sua água de cultivo trocada duas vezes por semana. A cada troca foi realizado o controle do tempo de vida dos organismos em semanas. E os neonatos provenientes dos organismos com faixa etária entre uma a duas semanas foram utilizados para realização de testes e abertura de novas culturas. Neonatos remanescentes e organismos com mais de três semanas de vida foram descartados.
Mensalmente, foram feitos testes para a avaliação da sensibilidade do organismo teste. No qual os organismos foram expostos a substância referência, cloreto de sódio, conforme as condições do ensaio definitivo para toxidade aguda descritas na NBR 12713/04.
4.1.2 Ceriodaphnia dubia
O cultivo foi realizado em cubas com capacidade de 4 litros (Figura 7), onde se adicionam aproximadamente de 50 organismos em 3 litros de água natural de boa qualidade, corrigida e isenta de contaminação. A água utilizada era proveniente de fonte natural, coletada na divisa do estado de São Paulo com Minas Gerais, no município de Delfim Moreira – MG, no Km 0 da BR459 e a 1700 m de altitude. Antes de sua utilização, a água coletada foi filtrada em rede de plâncton com malha de 30 a 45 mm e sua teve sua dureza testada e corrigida para valores em torno de 40 a 48 mg/L de CaCO3.
Figura 7 – Cubas utilizadas no cultivo de Ceriodaphnia dubia.
Fonte: Próprio autor.
Sua correção foi realizada a partir das soluções descridas no Quadro 3. Onde, foram utilizadas cerca de 20 mL da solução 1 e 10 mL da solução 2 para cada litro de água reconstituída preparada.
Quadro 3 - Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição.
Solução Reagente Qnt (mg) Preparo
1 CaSO4.2H2O 1500
Dissolver e diluir com água destilada em balão volumétrico de 1000 Ml
2
KCl 200
Dissolver e diluir com água destilada em balão volumétrico de 1000 mL
NaHCO3 4800
MgSO4.7H2O 6100
Fonte: ABNT NBR 13373, 2010.
Em casos onde a dureza da água apresentou valores inferiores a 40 mg CaCO3/L, o volume de solução a ser acrescentada para cada miligrama de dureza a
ser aumentado foi de 0,5 mL da solução 1 e 0,25 mL da solução 2 por litro de água reconstituída.
Após a correção, os parâmetros de pH foram novamente medidos. Devendo estar entre 7,0 e 7,6.
Os organismos foram alimentados diariamente com 1,5 mL de alimento composto e 1,5 mL da alga Raphidocelis subcapitata e sua água de cultivo trocada duas vezes por semana. A cada troca foi realizado o controle do tempo de vida dos organismos em semanas.
A sala de manutenção das culturas foi mantida limpa, isenta de poeira e vapores tóxicos. As culturas foram mantidas em câmaras de germinação (SOLAB - Mod. DAKO 340), com a temperatura controlada em 20 +/- 2°C e fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, a uma intensidade luminosa de, aproximadamente, 1000 lux.
Mensalmente, foram feitos testes para a avaliação da sensibilidade do organismo teste. No qual os organismos foram expostos à substância referência, cloreto de sódio, conforme as condições do ensaio definitivo descritos na seção Ceriodaphnia dubia – Teste Crônico.
4.1.3 Raphidocelis subcapitata
Para o preparo do meio de cultura L. C. Oligo (Quadro 4), foram dispostos em um erlenmeyer de 2 L, 2 mL das soluções 1,2,3,4 e 7 e 1 mL das soluções 5 e 6 e o volume completado para 2 L com água destilada.
Quadro 4 - Meio de cultivo L. C. Oligo
Meio L. C. Oligo Qnt (mg) Preparo
Solução
1 (Ca(NO3)2.4H2O 4000
Dissolver e completar para 100 mL de água destilada.
Solução
2 (KNO3) 10000
Dissolver e completar para 100 mL de água destilada.
Solução
3 (MgSO4.7H2O) 3000
Dissolver e completar para 100 mL de água destilada.
Solução
4 (K2HPO4) 4000
Dissolver e completar para 100 mL de água destilada.
Solução 5
CuSO4.5H2O 30
Dissolver e completar para 1000 mL de água destilada. (NH4)6Mo7O2.4H2O 60 ZnSO4.7H2O 60 CoCl2.6H2O 60 Mn(NO3)2.4H2O 60 C6H8O2.H2O 60 H3BO3 60 Solução 6 C6H5FeO7.5H2O 1625
Dissolver e completar para 1000 mL de água destilada.
FeCl3.6H2O 625
FeSO4.7H2O 625
Solução
7 NaHCO3 15000
Dissolver e completar para 1000 mL de água destilada.
FONTE: ABNT NBR 12648, 2005
O meio permaneceu sob agitação por uma hora e após sua homogeneização, 100 mL da solução meio foram distribuídos em três erlenmeyers de 125 mL, o restante da solução foi mantido em erlenmeyers de um ou dois litros. Cada erlenmeyer foi tampado com rolha de algodão e coberto com papel alumínio, a fim de evitar a umidade da autoclave entre em contato com o interior da vidraria.
Após sua preparação, os erlenmeyers foram esterilizados em autoclave, permanecendo na mesma durante 15 minutos a partir do momento em que a pressão alcança o valor de 1kgf/cm2.
Após a esterilização do meio, a “semente” da alga, previamente reservada em incubadora, foi levada, juntamente com os materiais esterilizados, para a câmara de fluxo laminar (visando evitar contaminação do material manipulado) onde foi realizada a semeadura da alga nos erlenmeyers esterilizados.
Após a semeadura, foi acoplado uma das pontas do cabo de aeração no erlenmeyer de dois litros e outra em uma bomba de aquário, garantindo a aeração do meio. Os três erlenmeyers pequenos foram acomodados no shaker sob agitação de cerca de 150 rpm e temperatura máxima de 28ºC durante de 5 a 7 dias e expostas a luz artificial.
Após seu cultivo, os erlenmeyers de 125 mL serviram como novas “sementes” e a alga produzida no erlenmeyer de dois litros, levada para centrifugação e lavagem e posteriormente utilizada como alimento de outros organismos.
Mensamente, foram feitos testes para a avaliação da sensibilidade do organismo teste. No qual os organismos foram expostos a substância referência, dicromato de potássio, conforme as condições do ensaio definitivo descrito na seção Raphidocelis subcapitata – Teste crônico.
4.2 Solução Teste
Para cada um dos testes propostos foram preparadas soluções de cloreto de sódio nas seguintes concentrações 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/L.
Em cada teste, a solubilização do cloreto de sódio foi realizada com a água de cultivo utilizada para manutenção de cada um dos organismos teste. Visando assim, oferecer todos os nutrientes necessários para o desenvolvimento do organismo e garantir que o composto padrão utilizado nos testes seja o único agente inibidor possível.
Os parâmetros para a preparação de cada meio de cultivo estão apresentados na seção manutenção e cultivo.
4.3 Daphnia similis – Ensaio de fertilidade e teste Crônico
Neonatos, entre 6 e 24 horas de vida, foram alocados em béquers de 100 mL contendo diferentes volumes de solução teste e alimentados com 70 µg de Alimento Composto e 100 µg da alga Raphidocelis subcapitata.
A troca da solução teste, assim como a contagem dos organismos vivos e neonatos e sua alimentação, foi realizada a cada três dias sempre que possível. Aos finais de semana a troca da solução não era realizada e para tanto a alimentação do meio na sexta-feira correspondeu ao dobro da originalmente proposta.
Para o Ensaio A, cinco neonatos foram dispostos em 50 mL de solução teste quatro réplicas foram utilizadas. Nos ensaios B e C, foram utilizadas dez réplicas, contendo um neonato cada. O volume de solução teste utilizado foi respectivamente de 20 mL e 40 mL.
Os resultados foram considerados validos quando, ao final do ensaio, a mortalidade dos organismos adultos no controle não excedeu 20% e o número médio de organismos jovens produzidos por fêmea no controle foi igual ou maior que 40 (USEPA, 2002).
Em todos os diferentes ensaios de toxicidade crônica propostos para Daphnia similis, os béqueres foram dispostos em bandejas e levados à incubadora durante 21 dias e fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, a uma intensidade luminosa de, aproximadamente, 1000 lux.
4.4 Ceriodaphnia dubia -Teste Crônico
No teste foram utilizadas Ceriodaphnias jovens, de no máximo 24 horas de idade, tendo todas nascidas dentro de um período de 8 horas e obtidas a partir de culturas mantidas em condições laboratoriais padronizadas.
Cada organismo jovem foi adicionado em béquer contendo 20 mL das respectivas soluções teste e alimento. Os organismos foram mantidos à temperatura de 20 ± 2 ºC, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 de escuridão. E alimentados diariamente com o mesmo tipo de alimento e com a mesma quantidade empregada na manutenção das culturas.
No final do período de exposição, determinou-se o número médio de jovens produzidos e o número de fêmeas adultas sobreviventes.
Os resultados foram considerados validos, quando ao final do ensaio, a mortalidade dos organismos adultos no controle não excedeu 20% e o número médio de organismos jovens produzidos por fêmea no controle foi igual ou maior que 15 (ABNT NBR 12648, 2005).
4.5 Raphidocelis subcapitata - Teste Crônico
O teste com a alga foi realizado ao longo de 96 horas, em triplicata, analisando-se cinco concentrações distintas mais o controle.
As soluções-teste foram constituídas do meio de cultura, do inoculo, dos volumes definidos de solução estoque e de água destilada para se obter as concentrações necessárias.
A preparação do teste é semelhante à da produção e cultivo da alga. Sendo cultivada no meio L.C.Oligo, e preparada conforme descrito na seção Manutenção e Cultivo. Ao final das 96 horas foi realizada a contagem dos organismos e amostras resultantes, levadas para análise em microscópio em Câmara de Contagem de Neubauer.
Após o ajuste do microscópio, a contagem das células foi feita de acordo com a sequência A, B, C, D e E ilustradas na Figura 6. O número de células contadas em A, B, C, D e E para cada uma das malhas (a Câmara de Neubauer apresenta duas malhas) foi somado e feito uma média desses valores.
Figura 8 - Visualização Microscópica da Câmara de Neubauer.
Fonte: ALGAE RESOURSE DATABASE, 2017.
Os resultados foram considerados validos, quando ao final do ensaio, o crescimento da biomassa algácea média do controle for superior a 100 vezes a biomassa inicial em 96 h de exposição e o coeficiente de variação da biomassa algácea das replicatas do controle menor ou igual a 20% (NBR 12648, 2005).
4.6 Avaliação estatística dos resultados
Diferentes níveis de efeito tóxico podem ser obtidos em função das diferentes diluições do agente químico ou condição, empregada nos experimentos de toxicidade. Desta forma, é necessário dispor de métodos estatísticos para determinar um único valor, que represente o conjunto dos dados gerados. Para os testes de toxicidade crônica e crônica de curta duração, determinam-se a Concentração de Efeito Não Observado (CENO), a qual representa a maior concentração onde não se observa efeito e a Concentração de Efeito Observado (CEO), responsável por apresentar a menor concentração onde observou-se efeito. Pode-se determinar também o valor crônico (VC), que é a média geométrica da CENO e da CEO e mais recentemente a ICp, que é a concentração percentual de inibição (CESAR, 1997).
Para cada experimento, deve-se adotar um método estatístico apropriado. Hoje no mercado tecnológico, é possível encontrar disponíveis, gratuitamente, diversos softwares estatísticos. Porém, é necessário verificar a qualidade destes programas no seguimento educacional (DA SILVA et al., 2014).
O software BioEstat foi desenvolvido especialmente para estudantes de graduação e pós-graduação das áreas médicas e biológicas. Possui métodos paramétrico e não-paramétricos disponíveis, que devem ser empregados de acordo com os dados obtidos no experimento. Possui como objetivo propiciar aos acadêmicos de diversas áreas do conhecimento um instrumento de grande praticidade e de fácil manuseio na avaliação de informações originadas através de pesquisa (AYRES et al., 2007, apud DA SILVA et al. 2014).
O software também apresenta grande potencial de uso devido à facilidade de aquisição, por meio gratuito e virtual, além de apresentar fácil instalação e possuir um manual autoexplicativo.
Para o uso de dados paramétricos, é importante utilizar métodos para verificar se a distribuição dos dados utilizados se ajusta a uma distribuição normal. Metodologias como Shapiro-Wilks, Qui-quadrado e a análise visual de alguns gráficos são alguns dos testes existentes para verificação da hipótese de normalidade (TORMAN et al., 2012).
Todavia, Torman et al. (2012) salienta que o desempenho dos testes é, em geral, muito ruim em pequenos tamanhos amostrais. Os autores, recomendam não
proceder ao teste de normalidade e partir diretamente para uma estratégia não-paramétrica de análise para amostras de tamanho menor ou igual a 10.
Neste trabalho, utilizou-se o programa estatístico BioEstat 5.3. Os resultados foram submetidos ao teste Kruskal-Wallis, e posteriormente submetido ao método Student Newman Keuls, responsável por realizar a comparação de médias dos postos duas a duas. Avaliou-se se houve diferença significativa (p<0,05) entre o controle laboratorial e as demais amostras. As amostras que apresentaram diferença estatística significativa, em relação ao controle, foram consideradas tóxicas (ABNT, 2005).
O teste de Kruskal-Wallis ou teste H consiste na versão, não paramétrica, análoga do teste F (análise paramétrica), o qual tem por objetivo comparar somente as variações entre os tratamentos, cujo resultado é traduzido no valor do F-teste. No teste não paramétrico, quando o teste H for significativo, o BioEstat disponibiliza dois métodos de comparações de médias dos postos: Dunn e Student-Newman Keuls. A fertilidade de Daphnia similis em cada um dos diferentes ensaios foi avaliada através da comparação do número médio de neonatas produzida por fêmea viva por réplica em cada um dos ensaios. Os dados foram analisados estatisticamente pelo programa BioEstat 5.3, no qual utilizou-se do teste Kruskal-Wallis, comparando as diferenças médias dos postos pelo método Student-Newman Keuls.
Nos demais testes crônicos foi avaliada a existência de diferença significativa (p<0,05) entre o controle laboratorial e as demais amostras, utilizando-se dos métodos acima citados. Os dados utilizados para D. similis e C. dubia correspondem ao número médio de neonatas produzidas por fêmea viva em cada réplica.
Para o teste crônico em Raphidocelis subcapitata, os dados utilizados correspondem a biomassa algal produzida por réplica. Considerou-se tóxicas as concentrações que apresentaram diferença estatística significativa, correspondendo à Concentração de Efeito Observado (CEO) (ABNT, 2005).
5 RESULTADOS E DISCUSSSÃO
Os resultados obtidos nos diferentes ensaios de fertilidade para D. similis estão apresentados na Tabela 3 e Figuras 9 e 10. Para verificar os dados observados, foi utilizado o programa BioEstat, através do qual não foram constatadas diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes ensaios. Entretanto, os resultados apresentados no Ensaio C, foram utilizados apenas como indicativos da natalidade de D. similis, pois, a sua alta mortalidade (Figura 11) no início do teste (superior a 20%) inviabiliza a validação deste resultado.
Para avaliação do número de neonatos produzidos, descartaram-se as réplicas onde houve mortalidade maternal antes do 19º dia de seu ciclo de vida. Medida tomada tendo em vista que os picos reprodutivos ocorreram entre o 7° e o 18° dia do ciclo de vida, assim como previsto em Jaconetti (2005).
Figura 9 – Neonatos produzidos por D. similis em cada troca nos diferentes ensaios.
Fonte: Próprio autor. 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 3 º 5 º 8 º 1 0 º 1 2 º 1 5 º 1 7 º 1 9 º 2 1 º N º N EO N A TOS PO R A D UTOS DIA Ensaio A: 5 neonatos; 4 réplicas; 50 mL sol. teste
Ensaio B: 1 neonatos; 10 réplicas; 40 mL sol. teste
Figura 10 – Média de neonatos produzidos por D.similis em diferentes ensaios.
Fonte: Próprio autor.
Tabela 3 – Média de neonatos produzidos por D. similis em diferentes ensaios.
Réplicas Ensaio A Ensaio B Ensaio C 1 74,8 70,0 76,0 2 92,2 69,0 85,0 3 89,5 78,0 53,0 4 94,7 75,0 78,0 5 - 70,0 65,0 6 - 80,0 * 7 - 98 * 8 - 81 * 9 - 81 * 10 - * * Média 87,8 78,0 71,4 Mediana 90,9 78,0 76,0
* Descartado (morte maternal anterior ao 17º dia) - Não existente
Fonte: Próprio autor. 87,8 78,0 71,4 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Ensaio A: 5 neonatos; 4 réplicas; 50 mL sol. teste
Ensaio B: 1 neonatos; 10 réplicas; 40 mL sol. teste
Ensaio C: 1 neonatos; 10 réplicas; 20 mL sol. teste
N º DE N EO N A TOS PRODUZIDOS
Figura 11 – Mortalidade em diferentes cultivos de D. similis.
Fonte: Próprio autor.
Ademais, todos os ensaios apresentaram valores semelhantes e condizentes a USEPA (2002). O qual estipulou para validação do teste, o mínimo de 40 neonatos produzidos por fêmea no período de 21 dias nos controles dos ensaios de toxicidade crônica com D. magna. Indicando, portanto, a viabilidade do uso de metodologias feitas para Daphnia magna em testes utilizando Daphnia similis (Ensaio A) e o uso de pequenos volumes de solução teste (Ensaio C).
Além dos ensaios de fertilidade em diferentes cultivos, testes de toxidade crônica utilizando D. similis, nas condições do ensaio A (Tabela 4 e 10 e Figura 12), foram realizados cg e comparados aos testes de toxidade crônica realizados utilizando R. subcapitata e C. dubia. Soluções de cloreto de sódio foram utilizadas nos testes crônicos visando proporcionar uma comparação entre a sensibilidade dos testes já normatizados e do teste proposto.
A escolha deste ensaio como referência para comparação com os demais testes citados, foi feita com base em seu melhor rendimento, mesmo que não significativamente estatístico, frente aos ensaios de fertilidade B e C e sua menor necessidade de réplicas. Implicando assim em menores volumes de solução-teste necessários para a realização do teste e facilitando sua realização.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 1 º 3 º 5 º 8 º 1 0 º 1 2 º 1 5 º 1 7 º 1 9 º 2 1 º % M ORTAL ID A D E DIA Ensaio A: 5 neonatos; 4 réplicas; 50 mL sol. teste Ensaio B: 1 neonatos; 10 réplicas; 40 mL sol. teste Ensaio C: 1 neonatos; 10 réplicas; 20 mL sol. teste
Tabela 4 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto de sódio. Réplicas Controle 0,5 g/L 1,0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 2,5 g/L 1 74,8 70,4 86,1 88,0 16,5 - 2 92,2 74,2 70,2 41,3 0,0 - 3 89,5 73,4 87,6 29,8 2,0 - 4 94,7 77,1 65,4 39,7 0,0 - Média 87,8 73,8 77,3 49,7 9,3 - Mediana 90,9 73,8 78,1 40,5 9,3 -
- Não avaliado (mortalidade maternal)
Fonte: Próprio autor.
No ensaio crônico utilizando Daphnia similis, podemos observar o decaimento do desempenho reprodutivo (Figura 12) em concentrações de cloreto de sódio superiores a 1,5 g/L. Tal diferença pode ser afirmada ao avaliarmos a existência de diferença estatisticamente significativa entre as médias dos tratamentos (Tabela 5). Confirmando a existência de toxidade a 1,5 g/L de NaCl.
Figura 12 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto de
sódio.
Fonte: Próprio autor. 87,8 73,8 77,3 49,7 9,3 0,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 N º DE N EO N A TOS PRODUZIDOS Concentração de NaCl (g/L)
Tabela 5 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos
por D.similis.
Tratamento Posto
Médio
Dif.
Postos p-valor Dif. Sig. Efeito
Controle 15,5 0,5 g/L 9,75 5,75 0,1277 1,0 g/L 10 5,5 0,1451 CENO 1,5 g/L 6,75 8,75 0,0205 * CEO 2,0 g/L 1,5 14 0,0025 * 2,5 g/L - - - - - Não avaliado
* Diferença estatisticamente significativa (p<0,05) CENO Concentração de Efeito Não Observado CEO Concentração de Efeito Observado
Fonte: Próprio autor.
Quanto aos ensaios utilizando Ceriodaphnia dubia (Tabelas 6 e 7 e Figuras 13), foi observada uma maior sensibilidade ao cloreto de sódio. Apresentando CEO em 1,0 g/L de NaCl.
Tabela 6 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de
cloreto de sódio. Réplicas Controle 0,5 g/L 1,0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 2,5 g/L 1 9 17 9 1 - - 2 19 15 13 3 - - 3 15 11 10 7 - - 4 15 13 4 5 - - 5 16 10 15 5 - - 6 17 17 7 3 - - 7 13 15 14 - - - 8 19 9 14 - - - 9 - 11 13 - - - 10 - - 6 - - - Média 15,4 13,1 10,5 4 Mediana 15,5 13 11,5 4
- Descartado (morte maternal)
Figura 13 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de
cloreto de sódio.
Fonte: Próprio autor.
Tabela 7 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos
por Ceriodaphnia dubia.
Tratamento Posto Médio Dif. Postos p-valor Dif. Sig. Efeito Controle 25,3125 0,5 g/L 20,4444 4,8681 0,3002 CENO 1,0 g/L 14,9 10,4125 0,0232 * CEO 1,5 g/L 4,25 21,0625 < 0,0001 * 2,0 g/L - - - - 2,5 g/L - - - - - Não avaliado
* Diferença estatisticamente significativa (p<0,05) CENO Concentração de Efeito Observado CEO Concentração de Efeito Não Observado
Fonte: Próprio autor.
Nos ensaios utilizando Raphidocelis subcapitata (Tabela 8 e Figuras 14 e 15), as concentrações onde ocorreram diferenças estatisticamente significativas foram maiores que as anteriormente apresentadas nos testes crônicos utilizando D. similis e C. dubia. 15,4 13,1 10,5 4,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 N º DE N EO N A TOS PRODUZIDOS Concentração de NaCl (g/L)
Tabela 8 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes
concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.
Réplicas Controle 0,5 g/L 1,0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 2,5 g/L
1 7,33E+06 5,81E+06 4,66E+06 4,73E+06 3,76E+06 3,26E+06 2 7,11E+06 4,13E+06 4,26E+06 4,51E+06 3,96E+06 3,76E+06 3 6,16E+06 5,08E+06 5,63E+06 5,73E+06 4,38E+06 2,91E+06
Média 6,87E+06 5,01E+06 4,85E+06 4,99E+06 4,03E+06 3,31E+06
Mediana 7,11E+06 5,08E+06 4,66E+06 4,73E+06 3,96E+06 3,26E+06 Fonte: Próprio autor.
Figura 14 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes
concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.
Fonte: Próprio autor. 6,87E+06
5,01E+06 4,85E+06 4,99E+06
4,03E+06 3,31E+06 0,00E+00 1,00E+06 2,00E+06 3,00E+06 4,00E+06 5,00E+06 6,00E+06 7,00E+06 8,00E+06 Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 BIOM A SS A PRODUZIDA ( C ÉL /mL ) Concentração de NaCl (g/L)
Figura 15 – Inibição do crescimento algal em diferentes concentrações da solução de NaCl
comparadas ao controle – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.
Fonte: Próprio autor.
A tabela 9 apresenta os resultados do teste Kruskall-Wallis nos dados de biomassa algal produzida (figura 14).
Tabela 9 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de biomassa
algal por Raphidocelis subcapitata.
Tratamento Posto
Médio
Dif.
Postos p-valor Dif. Sig. Efeito
Controle 17 0,5 g/L 11 6 0,1687 1,0 g/L 10 7 0,1083 1,5 g/L 11,3333 5,6667 0,1936 CENO 2,0 g/L 5,5 11,5 0,0083 * CEO 2,5 g/L 2,1667 14,8333 0,0007 *
* Diferença estatisticamente significativa (p<0,05) CENO Concentração de Efeito Observado CEO Concentração de Efeito Não Observado
Fonte: Próprio autor.
Desta maneira, pode-se observar uma maior sensibilidade do organismo Ceriodaphnia dubia à solução de cloreto de sódio (Tabela 10). Enquanto Raphidocelis subcapitata apresentou toxidade apenas em concentração maiores, mostrando-se menos sensível ao teste em questão. Toda via, apesar da necessidade de maior
27% 29% 27% 41% 52% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 IN IBIÇÃ O DO C R ES C IM EN TO Concentração de NaCl (g/L)
aprofundamento sobre o tema, D. similis mostrou-se adequada para a avaliação de toxidade crônica, apresentando sensibilidade à solução-teste utilizada, condizente com a encontrada em ensaios crônicos normatizados e vastamente empregados no pais.
Tabela 10 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio em diferentes testes de
toxidade crônica. Tratamento D. similis C. dubia R. subcapitata Controle 0,5 g/L 1,0 g/L * 1,5 g/L * * 2,0 g/L * - * 2,5 g/L - - * - Não avaliado * Efeito observado (p<0,05)
CENO Concentração de Efeito Observado CEO Concentração de Efeito Não Observado
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que os diferentes volumes de solução teste utilizados e o número de organismos por réplica, aparentemente, não influiu na reprodução de D. similis. Assim, a viabilidade da aplicação de metodologias existentes para ensaio com Daphnia magna em ensaio com Daphnia similis e o uso de pequenos volumes de solução-teste (20 mL), não possui quaisquer empecilhos para seu uso como metodologias para ensaios crônicos. Entretanto, o ensaio A utiliza de metodologia mais simplificada, facilitando sua montagem e replicação.
Quanto a sensibilidade do organismo Daphnia similis no ensaio crônico, o mesmo apresentou sensibilidade na faixa intermediaria às encontradas nos organismos Ceriodaphnia dubia e Raphidocelis subcapitata. Indicando assim, mais uma vez, sua aplicabilidade na avaliação de toxicidade, com grande potencial para ensaios crônicos.
Entretanto, ainda é necessário estudos futuros com diferentes organismos pertencentes a diversos níveis tróficos, os quais podem apresentar diferentes respostas aos poluentes.
REFERÊNCIAS
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ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS (ABNT). NBR 12373. Ecotoxicologia aquática - Toxicidade crônica - Método de ensaio com Daphnia spp (Crustacea, Cladocera). Rio de Janeiro, 2004.
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