4.3.1 OBTENÇÃO DA PELE DE ORELHA SUÍNA
As condições de transporte das orelhas suínas foram as mesmas utilizadas no transporte das mucosas (item 4.2.1). Inicialmente, as orelhas foram lavadas com água destilada, os pêlos foram cortados com tesoura, e selecionou-se as partes íntegras, livres de lesões ou manchas. Com auxílio de pinça anatômica, bisturi e tesoura, procedeu-se à dissecação extraindo conjuntamente derme e epiderme, e descartando a hipoderme (tecidos subcutâneos e gordurosos subjacente à derme) (Figura 10).
Figura 10: Dissecação da pele de orelha suína (à esquerda) e tecido pronto para os experimentos, após descarte da hipoderme (à direita).
Após fragmentação, as amostras dissecadas de pele foram acondicionadas em papel alumínio e armazenadas a -80oC, imersas em solução tampão de Krebs, até o momento da utilização. O período de armazenamento variou entre um e dois meses.
O descongelamento foi realizado à temperatura ambiente (25oC), com adição da solução tampão de Krebs.
4.3.2 EXPERIMENTOS DE PERMEAÇÃO CUTÂNEA
As câmaras de Franz foram alocadas no banho termostatizado (37oC) com agitação multiponto (Dist). O compartimento receptor foi preenchido com tampão PBS: etanol (10 mL). A proporção de etanol foi de 20% (V/V) nos experimentos com os parabenos isolados, e de 50% (V/V) nos experimentos de interação dos parabenos. Optou-se por utilizar tais concentrações de etanol, considerando-se o estudo de Sznitowska (1996), no qual o efeito promotor do etanol na permeação cutânea foi otimizado quando se utilizou 25 e 50% de etanol. Além disto, segundo recomendação do FDA (U.S. FDA/CDER, 1997), misturas hidroalcóolicas podem ser utilizadas como meio receptor em estudos de permeação ex vivo, quando a amostra for muito pouco solúvel em água.
O tecido foi disposto na câmara de Franz, evitando-se a formação de bolhas de ar, com a epiderme voltada para o compartimento doador e a derme para o compartimento receptor. Os parabenos (metil, etil, propil e butilparabeno) foram solubilizados na mesma mistura utilizada no compartimento receptor.
Para a definição das concentrações dos parabenos a serem testadas, levou-se em consideração que quando os mesmos fossem associados, a concentração total
máxima não poderia exceder o limite de 0,4%, conforme estabelecido pela Resolução nº 79, de 28 de agosto de 2000 (BRASIL, 2000). Desta forma, os quatro parabenos testados isoladamente foram preparados na concentração de 0,1% (p/V) de forma que, quando combinados, este limite fosse respeitado. As diferentes soluções das combinações dos parabenos foram preparadas de acordo com delineamento fatorial 23, com triplicata no ponto central para a estimativa do erro experimental (BARROS NETO; SCARMINIO e BRUNS, 2003). Manteve-se constante o nível (concentração) de um dos parabenos e os demais foram alternados, representando os três fatores do delineamento. Dois níveis de concentração (mínimo → 0 e máximo → 1000 µg/mL) foram considerados nos experimentos para a avaliação da interação entre os mesmos, e um nível central adicional (500 µg/mL) foi utilizado para a estimativa do erro experimental.
Após a disposição do tecido na câmara de Franz, o sistema de agitação foi acionado e 2 mL das soluções do(s) parabeno(s) foram depositadas sobre a superfície da epiderme, com auxílio de pipeta automática. O sistema foi coberto com papel alumínio para evitar a evaporação. A agitação foi acionada e alíquotas de 400 µL da solução receptora foram retiradas pela cânula de amostragem (com reposição da solução) e imediatamente armazenadas a -20oC, até o momento de quantificação por EC, em condições pré-estabelecidas. As alíquotas foram retiradas em intervalos regulares de 1h nos experimentos com os parabenos isolados (duração total de 6 h) e de 1,5h nos experimentos com os parabenos associados entre si (duração total de 7,5h).
A análise final da permeação cutânea dos parabenos incluiu os cálculos dos tempos de latência (LT), dos fluxos constantes (J) e dos coeficientes de
permeabilidade (P), através de equações, fundamentadas nas Leis de Fick, e a plotagem gráfica das quantidades permeadas dos parabenos (µg/cm2) em função do tempo. As massas das amostras acumuladas no compartimento receptor, em cada intervalo de tempo, foram calculadas considerando-se o volume total da câmara, as concentrações dos parabenos nas alíquotas retiradas, bem como a área efetiva de permeação (AKOMEAH; MARTIN; BROWN, 2007).
O perfil de permeação, bem como a influência dos coeficientes de difusão e de partição na permeação podem ser melhor compreendidos com a utilização de modelos matemáticos para representá-los, incluindo diferentes variáveis independentes. Com este propósito, utilizou-se o modelo equacional de Moser et al. (2001b) para o cálculo destes parâmetros.
(equação 4)
Onde: Q = quantidade acumulada da amostra por unidade de área em determinado tempo CV = concentração da amostra no compartimento superior
K = coeficiente de partição D = coeficiente de difusão H = espessura da membrana
4.3.3 AVALIAÇÃO DA RETENÇÃO CUTÂNEA DOS PARABENOS
A análise da retenção cutânea dos parabenos foi realizada após o término dos estudos de permeação cutânea.
Anteriormente à retirada da pele, as soluções doadoras contendo os parabenos foram homogeneizadas, com auxílio de pipeta e transferiu-se 200 µL destas soluções para tubos tipo Eppendorf®, para análise posterior da quantidade retida e balanço da massa final. Neste caso específico, a quantificação por EC foi realizada após diluição 1:200 das soluções doadoras.
Na sequência, as amostras de pele foram retiradas do equipamento e lavadas com solução tampão PBS:etanol para remover o excesso dos parabenos na superfície da epiderme. Com auxílio de bisturi e pinça anatômica, separou-se a epiderme da derme. Apenas a região central, equivalente à área de permeação, foi delimitada, recortada e picoteada. Os fragmentos de derme e epiderme gerados foram pesados em tubos de 15 mL.
Os procedimentos utilizados para a extração dos parabenos da pele foram equivalentes àqueles da extração da CBZ em mucosas (ver item 4.2.3).
Para evitar interferências na mobilidade efetiva dos analitos em questão, bem como assimetria dos picos, durante as análises por EC, optou-se por evaporar o metanol (60oC) e ressuspender os analitos no mesmo meio do compartimento receptor, utilizado nos experimentos de permeação.