PERMEAÇÃO CUTÂNEA DE DIFERENTES COMBINAÇÕES DOS PARABENOS

camadas viáveis da pele.

5.2.2 PERMEAÇÃO CUTÂNEA DE DIFERENTES COMBINAÇÕES DOS PARABENOS

Tendo em vista que os parabenos podem ser associados para potencializar seu efeito antimicrobiano, particularmente o MP e o PP, o estudo do efeito da interação dos mesmos na permeação, através da pele, tem grande importância. Diversas propostas de planejamentos experimentais podem ser utilizadas com este propósito, nos quais os processos são representados por modelos matemáticos e, com a construção de superfícies de resposta, as análises dos efeitos se tornam mais consistentes.

Dentre as várias propostas de planejamento, optou-se pelo delineamento fatorial, considerando sua utilização em estudos de avaliação dos efeitos da interação dos fatores sobre determinada(s) resposta(s) (OLIVIER et al., 2007). O planejamento prévio incluiu a escolha das variáveis (fatores) e das diferentes faixas de estudo (níveis – neste caso, diferentes concentrações dos parabenos) identificados como mínimo, central e máximo, e codificados como -1, 0 e +1, respectivamente. O conjunto das combinações possíveis entre os níveis de diferentes fatores é chamado de matriz de planejamento. Entende-se por efeito de um fator a variação da resposta produzida por mudanças de nível do fator, e ele pode ser aditivo ou com interação (BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2003). Para melhor compreensão destas modalidades de efeitos, é aconselhável a leitura do apêndice D, para que a discussão abaixo seja mais clara.

Existem diversos tipos de planejamento fatorial e a seleção do mais adequado foi realizada com base no objetivo do estudo e no número de ensaios envolvidos, para se conseguir extrair o máximo de informações com a realização de um mínimo de experimentos.

Desta forma, os experimentos foram realizados de acordo com quatro planejamentos fatoriais, onde cada um deles apresentou três fatores e dois níveis (delineamento fatorial 23), com triplicata no ponto central. Manteve-se constante o nível (concentração) de um dos parabenos e os outros foram variados, por exemplo, para o fatorial 1, manteve-se constante a concentração do MP (1000 µg/mL) enquanto que,

as concentrações dos demais parabenos (EP, PP e BP) variaram de acordo com o planejamento experimental. O mesmo raciocínio é válido para os fatoriais 2, 3 e 4, respectivamente. Portanto, as respostas de permeação cutânea obtidas para os fatoriais 1, 2, 3 e 4 foram em relação ao MP, EP, PP e BP, respectivamente. Os experimentos realizados no ponto central foram utilizados para calcular o erro experimental, parâmetro necessário para verificar a significância dos parâmetros em análise (valores de fluxos) e das interações. Quanto maior o número de repetições deste ponto central, maior será a confiabilidade do erro experimental estimado.

As variáveis instrumentais [voltagem, injeção, comprimento de onda de detecção, temperatura do cartucho e dimensões do capilar (comprimento e diâmetro)] foram mantidas constantes durante os experimentos para reduzir o número de interferentes no erro experimental.

A realização dos experimentos foi aleatória para evitar a distorção estatística dos resultados, isto é, impedir que erros atípicos sejam obrigatoriamente associados a determinadas combinações de níveis.

Após a realização dos experimentos e obtenção dos dados, foram utilizadas técnicas de regressão múltipla para a obtenção dos parâmetros de regressão do modelo (Betas) com o intuito de avaliar a influência de variações multivariada nos níveis dos fatores sobre as respostas (valores dos fluxos de permeação), bem como a ocorrência ou não de interação entre eles (sinergismo ou antagonismo), o que possibilita identificar quais fatores realmente influenciaram as respostas medidas para um determinado intervalo de significância.

Preliminarmente, o erro experimental foi obtido a partir das três repetições do ponto central, com avaliação simultânea da permeação dos quatro parabenos, em níveis intermediários de concentração (500 µg/mL). Os resultados (dados não mostrados) demonstraram que a sensibilidade (neste caso, vista como a capacidade de detectar diferenças) não foi suficiente para apontar quais fatores eram significativos, sendo coerentes do ponto de vista estatístico, mas sem grande importância para os estudos de permeação. Esta variação pode ser atribuída a diferenças na preparação das membranas, variações intra-espécie, realização destas repetições em dias diferentes, com soluções diferentes, entre outras causas. Desta forma, procedeu-se uma análise qualitativa das respostas obtidas, tanto quando os parabenos foram testados isoladamente, quanto combinações dos mesmos.

Quando um dos parabenos foi mantido no nível alto (1000 µg/mL) e os demais em nível baixo (0 µg/mL), a permeação através da pele de orelha de porco foi de 27,2; 26,7; 21,2 e 12,3 para o MP, EP, PP e BP, respectivamente. Cabe lembrar que nestes

experimentos utilizou-se 50% de etanol, diferentemente dos anteriores que utilizaram 20%.

Combinações binárias do PP com os demais parabenos demonstraram reduções, em cerca de 2X, das respostas (fluxos de permeação), com exceção da combinação EP e PP, na qual esta redução foi maior (JEP=3,2; 8,3X para o EP e

JPP=4,1; 5,2X para o PP), comparativamente aos testes com os parabenos isolados.

De forma geral, a associação de três parabenos provoca diminuição, em cerca de 2X, dos fluxos de permeação dos parabenos através da pele, exceto para a combinação MP, PP e BP, em que o BP mostrou taxa de permeação cerca de 2X maior em relação à condição isolada, evidenciando-se um efeito sinérgico favorável ao aumento da sua permeação, nestas condições.

Em nível elevado para os quatro parabenos (1000 µg/mL), simultaneamente, obtiveram-se baixos valores de fluxos de permeação, em comparação as condições isoladas, o que sugere a ocorrência de certo antagonismo entre os mesmos.

Resumindo, do ponto de vista da redução da permeação através da pele de orelha de porco, o experimento com altos níveis de EP e PP e baixos níveis de MP e BP (-1,1,1,-1) foi o mais efetivo, considerando-se as baixas respostas obtidas em relação aos fluxos de permeação e ao total permeado (última coleta). Contrariamente, o experimento com níveis altos de MP, PP e BP e baixo nível de EP (1,-1,1,1), os parabenos demonstraram altas taxas de permeação. Assim, com base nestes resultados, sugere-se priorizar combinações de parabenos que demonstraram baixos fluxos de permeação, até a confirmação de aspectos de segurança dos mesmos. A estratégia adotada para contornar o problema do grande erro experimental das repetições do ponto central, mencionado anteriormente, foi à normalização das quantidades permeadas dos parabenos em função da quantidade permeada final (tempo de 7,5 h), em cada situação particular, com a obtenção de novos valores de respostas (fluxos de permeação), inclusive para de fluxo para a triplicata do ponto central. A Tabela 7 ilustra a matriz de planejamento para um fatorial 23 (2 níveis e três fatores/variáveis) e as respostas dos fluxos obtidas para cada fatorial isoladamente.

Tabela 7: Delineamento fatorial 23 e respostas obtidas [valores de fluxo=J (µg/cm2)] nos estudos de permeação do MP, EP, PP e BP, através da pele de orelha suína.

Fatores 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 B -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 C -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 0 Repostas Fatorial 1 (RMP) 19,2 16,3 19,1 18,9 17,7 18,8 16,5 21,0 19,9 18,9 18,0 Repostas Fatorial 2 (REP) 15,2 15,4 11,0 17,0 14,7 16,3 16,2 18,3 16,5 16,8 15,3 Repostas Fatorial 3 (RPP) 15,1 18,1 12,2 18,0 16,1 17,1 16,3 18,3 16,6 16,8 15,1 Repostas Fatorial 4 (RBP) 16,0 16,2 15,0 16,3 16,9 17,1 16,9 18,7 15,9 17,0 15,6

- Fatorial 1: A (EP), B(PP) e C(BP); Fatorial 2: A(MP), B(PP) e C(BP); Fatorial 3: A(MP), B(EP) e C(BP); Fatorial 4: A(MP), B(EP) e C(PP). Cada delineamento fatorial foi considerando isoladamente para a análise dos efeitos.

- Níveis (µg/mL): (−) 0,000; (0) 500,0; (+) 1.000;

- RMP, REP, RPP and RBP representam as respostas pós-normalização (coeficientes angulares-

fluxos).

A análise qualitativa da Tabela 7 demonstra que o fluxo de permeação pode aumentar ou diminuir de acordo com a combinação dos parabenos, conforme descrito abaixo:

A) Fatorial do metilparabeno (concentração fixa em 1.000 µg/mL para o MP, com variação dos níveis dos demais parabenos)

- Em nível elevado de PP e BP, e variando-se o nível de EP de -1 (0) para +1 (1000 µg/mL), observou-se um aumento dos fluxos de permeação, enquanto que, para nível baixo de PP e BP, e variando-se o nível de EP de -1 para +1, notou-se um decréscimo da permeação.

- Mantendo-se nível reduzido de EP e BP, e com elevação do nível de PP, não se observou variação da taxa de permeação. Contrariamente, mantendo-se nível elevado de EP e BP, com variação do nível de PP, um aumento dos fluxos de permeação foi observado.

- Em nível reduzido de EP e PP, com variação do nível de BP, notou-se um decréscimo da taxa de permeação. Por outro lado, nível elevado de EP e PP, com variação do nível de BP, proporcionaram aumento dos fluxos de permeação.

B) Fatorial do etilparabeno (concentração fixa em 1.000 µg/mL para o EP, com variação dos níveis dos demais parabenos)

- Em nível baixo de PP e BP, com variação do nível de MP, não se observou variação da taxa de permeação. Contrariamente, nível elevado de PP e BP, com variação do nível de MP, resultaram em aumento dos fluxos de permeação.

- Mantendo-se nível reduzido de MP e BP, com variação do nível de PP, notou-se diminuição do fluxo de permeação. Por outro lado, em nível elevado de MP e BP, com variação do nível de PP, observou-se aumento das taxas de permeação.

- Nível baixo de MP e PP e variação do nível de BP, resultaram em diminuição na taxa de permeação. Contrariamente, mantendo-se nível alto de MP e PP e variação do nível de BP promoveram aumento do fluxo de permeação.

C) Fatorial do propilparabeno (concentração fixa em 1.000 µg/mL para o PP, com variação dos níveis dos demais parabenos)

- Mantendo-se, simultaneamente, o nível elevado ou reduzido de EP e de BP com variação do nível de MP, observou-se aumento da taxa de permeação.

- Em nível baixo de MP e BP, com variação do nível de EP, notou-se diminuição da taxa de permeação. Inversamente, em nível elevado de MP e BP, com variação do nível de EP, um aumento dos fluxos de permeação foi registrado.

- Em nível reduzido de MP e EP, e variação do nível de BP, resultaram em aumento do fluxo de permeação. Por outro lado, em nível elevado de MP e EP, com variação do nível de BP, não se observou variação significativa da taxa de permeação.

D) Fatorial do butilparabeno (concentração fixa em 1.000 µg/mL para o BP, com variação dos níveis dos demais parabenos)

- Em nível reduzido de EP e PP, com variação do nível de MP, não se observou variação significativa na taxa de permeação. Inversamente, níveis altos de EP e PP, com variação do nível de MP, resultaram em aumento do fluxo de permeação.

- Mantendo-se o nível baixo de MP e de PP, com variação do nível de EP, notou-se diminuição do fluxo de permeação. Contrariamente, nível elevado de MP e PP, com variação do nível de EP, demonstraram aumento da taxa de permeação.

- Mantendo-se, simultaneamente, o nível baixo ou alto de MP e de EP, com variação do nível de PP, observou-se aumento do fluxo de permeação.

Quando estes dados normalizados foram submetidos a tratamento estatístico, (Tabela 8), observou-se que o MP foi o único fator que apresentou efeito positivo significativo na permeação, através da pele de orelha suína (fatoriais 2 e 3). Para os fatoriais 1 e 4, nenhum dos efeitos foi considerado significativo para o nível de significância selecionado (95%).

Na revisão bibliográfica, foi comentado que a redução da permeação dos parabenos na pele inclui diferentes estratégias, entre elas, a adição de retardadores de permeação que, em geral, desconsidera a associação dos parabenos entre si e destes com outros adjuvantes da formulação, durante a realização dos experimentos ex vivo. Assim, deveriam ser realizados experimentos, não apenas com a combinação binária parabeno e retardador de permeação, geralmente soluções dos mesmos, mas também incluindo a avaliação da permeação do produto final. Isto evitaria que, após a formulação de um produto cosmético, o efeito retardador seja perdido através de interações indesejadas ou pela presença de componentes da formulação que demonstrem potencial reforçador de permeação.

Os resultados mais interessantes, após a normalização dos dados, foram os das combinações MP e EP, e para MP e PP, tendo em vista os efeitos Tabela 8: Tratamento estatístico dos resultados do delineamento fatorial 23 para estudos de permeação do MP, EP, PP e BP, através da pele de orelha suína.

Fatorial 1 a EfeitoMP Fatorial 2 b EfeitoEP Fatorial 3 c EfeitoPP Fatorial 4 d EfeitoBP

Média 18.58 Média 15.70 Média 16.34 Média 16.50

EP 0.66 MP 2.49* MP 2.95* MP 0.86

PP 0.89 PP 0.25 EP -0.38 EP 0.22

BP 0.14 BP 1.72 BP 1.13 PP 1.52

EP*PP 1.52 MP*PP 1.57 MP*EP 0.96 MP*EP 0.68

EP*BP 2.14 MP*BP -0.64 MP*BP -1.46 MP*PP 0.15 PP*BP -0.36 PP*BP 1.53 EP*BP 1.08 EP*PP 0.64 EP*PP* BP 0.19 MP*PP* BP -1.30 MP*EP* BP -0.46 MP*EP* PP 0.13

*Efeitos significativos para α de 0,05%.

a,b,c,d

valores de efeitos maiores que 2,91; 2,39; 2,88; 2,13 são considerados significativos para as colunas efeitoMP, efeitoEP, efeitoPP e efeitoBP, respectivamente.

estatisticamente significativos (p<0,05) e a redução das taxas de permeação dos parabenos através da pele de orelha de porco, nestas condições. Coincidentemente, análises recentes confirmaram a presença de MP e PP na maioria dos produtos cosméticos (SHEN et al., 2007). Nestes casos, em que a interação entre os parabenos resulta na queda dos fluxos de permeação dos mesmos, a adição de retardadores de permeação poderia tornar a redução deste parâmetro de permeação ainda mais significativa, tornando os produtos cosméticos mais seguros, considerando que grande parte dos efeitos adversos estudados, até o momento, exigem uma absorção sistêmica dos mesmos.