Avaliação da expressão do RNAm e proteica do splicing alternativo do receptor de estrógeno (ERα36kDa) em carótidas isoladas de fêmeas

SAMR1 e SAMP8

As carótidas comuns das linhagens de fêmeas SAMR1 e SAMP8 apresentaram expressão proteica do ERα36kDa e de RNAm de CTERP.

Nas carótidas das fêmeas SAMR1 os tratamentos E2(E) e E2(L) reduziram os

níveis de RNAm para CTERP quando comparado com aqueles observados no grupo OVX, entretanto a expressão foi proteica foi semelhante entre os grupos (Figura 23). Nas fêmeas SAMP8, o tratamento E2I não alterou os níveis de RNAm e proteico em

comparação com os das OVX, entretanto o tratamento E2F aumento os níveis de

RNAm comparando com os dos grupos OVX e E2F e os níveis proteico em

OVX E2E E2L 0 100 200 300 E x p re s s ã o p ro te ic a ER  3 6 -k Da (% ú te ro )

ERα-36kDa

α-actina

SAMR1

SAMP8

OVX E2I E2F

0 5 10 15 20 * * ER  3 6 -kD a t ru n c a d o m R N A 2 - Ct

OVX E2I E2F

0 5 10 15 20 * * ER  3 6 -kD a t ru n c a d o m R N A 2 - Ct

OVX E2E E2L

0 100 200 300 * p= 0.09 P ro te in e x p re s s io n ER  3 6 -k Da (% u te ru s )

OVX E2E E2L

0 5 10 15 20 * * ER  3 6 -kD a t ru n c a d o m R N A 2 - Ct

Figura 23 - Expressão do RNAm e proteica do splicing alternativo do receptor de estrógeno alpha (ERα36kDa) em carótidas comuns isoladas de fêmeas resistentes à senescência (SAMR1) e fêmeas com senescências acelerada (SAMP8), utilizando as técnicas de PCR em tempo real e western blot. No experimento de PCR em tempo real os valores normalizados pela expressão do RNAm do controle interno GAPDH e no western blot o controle interno foi α-actina. OVX representa o grupo ovariectomizado por 60 dias. E2(E) grupo OVX tratado com 17β-estradiol precocemente (tratamento desde o primeiro dia da ovariectomia). E2(L) grupo OVX tratado com 17β-estradiol tardiamente (tratamento após 45 dias da ovariectomia). A concentração de 17β-estradiol para os tratamentos das fêmeas OVX foi de 5µg/kg/ aplicada por via subcutânea a cada três dias. Resultados expressos como média ± EPM. Foi utilizado o teste ANOVA de uma via seguido de Tukey- Kramer para análise. * p<0.05. n= 5-10/grupo.

6 DISCUSSÃO

Neste trabalho nós demonstramos pela primeira vez que o tempo para o início do tratamento com estrógeno, precoce (E2E) ou tardio (E2L), em camundongos

fêmeas ovariectomizadas é um parâmetro fundamental na determinação do efeito e mecanismo de ação diferenciais desse hormônio em carótidas comuns de fêmeas senescentes SAMP8, modelo de envelhecimento, e SAMR1, linhagem resistente a senescência. Isso está de acordo com a teoria da timing hypothesis que estabelece a existência de uma janela de oportunidade terapêutica associada ao envelhecimento que pode determinar os efeitos vasculares promovidos pelo tratamento com estrógeno em humanos 42.

No que se refere ao estudo do mecanismo de ação verificamos que a carótida das SAMP8-OVX tratada com E2(L) mostrou-se hiperreativa ao vasoconstritor Phe,

com aumento da produção de TXA2 via COX-1 e da expressão do RNAm e proteica

do ERα-36kDa, splicing alternativo do receptor clássico de estrógeno (ERα-66kDA). Entretanto, na carótida das SAMR1-OVX tratadas com E2(E) e E2(L) houve redução

da vasoconstrição à Phe, com aumento de PGI2 via COX-2, sem alterar a expressão

proteica do ERα-36kDa e ERα-66kDa.

A linhagem de envelhecimento precoce, SAMP8, tem sido utilizada para estudos de mecanismos moleculares envolvidos no déficit cognitivo 99 e no controle vasomotor 98 relacionado ao envelhecimento. Nós utilizamos as fêmeas SAMP8 com seis meses de idade uma vez que alterações cognitivas e vasculares, como a disfunção endotelial, em SAMP8 iniciam-se a partir do sexto mês de idade 98; 99; 100.

Apesar das fêmeas SAMP8 apresentarem senescência, esta linhagem de camundongo, como em todos os roedores, não apresenta redução dos níveis endógenos de estrógeno 98; 119 e por isso foram submetidas ao procedimento de

remoção cirúrgica dos ovários, ovariectomia, que é uma estratégia experimental muito utilizada 120; 121 para simulação dos baixos níveis estrogênicos observados na pós-menopausa e também após histerectomia de mulheres na idade fértil 122.

No plasma de fêmeas SAMR1 e SAMP8 após a ovariectomia de 60 dias, demonstramos redução de 75% e 81%, respectivamente, na concentração de 17β- estradiol bem como a do peso uterino, o que está de acordo com o observado em outros modelos animais como ratas SHR, Wistar e Sprague-Dawley 26; 27; 28; 30; 123.

É importante salientar que apesar dos níveis endógenos de estrógeno permanecerem semelhantes durante todo a vida da linhagem SAMP8, os níveis de LH e FSH aumentam durante o processo de envelhecimento 119. De fato, a pós- menopausa está associada a duas importantes alterações fisiológicas: redução dos níveis endógenos de estrógeno e aumento do FSH e LH 5. Sendo assim, as SAMP8 ovariectomizadas possuem características que se assemelham às observadas na clínica.

O hormônio que utilizamos para o tratamento de fêmeas ovariectomizadas foi o 17β-estradiol na dose 5 µg/kg aplicado via subcutânea a cada três dias. Esse regime de tratamento foi baseado nos estudos de NOVENSÀ et al. (2011) 115 que observaram ser esta a dose mínima para manter os níveis plasmáticos fisiológicos de estrógeno em camundongos fêmeas ovariectomizadas. De fato, observamos que após os tratamentos E2(E) e E2(L) os níveis plasmáticos desse hormônio bem como

o peso uterino de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8 foram semelhantes aos das fêmeas intactas. Ao penetrar nas células por difusão passiva, o estrógeno une- se ao ERα-66kDa, aumentando o fluxo sanguíneo, a absorção de água e a proliferação celular, assim o endométrio torna-se mais espesso e o peso do órgão

aumenta. Por causa disso, o peso uterino tem sido considerado um parâmetro de eficácia do tratamento hormonal 124.

O 17β-estradiol isolado tem sido utilizado em grande escala mundialmente como terapia hormonal para mulheres na pós-menopausa, conforme publicação da Sociedade Norte-Americana de Menopausa em parceria com diversas outras sociedades, incluindo a Associação Brasileira de Climatério (SOBRAC) 125. A principal recomendação clínica do uso de hormônios para mulheres menopáusicas é para amenizar os sintomas vasomotores, a atrofia vaginal e prevenir a osteoporose

125; 126; 127; 128; 129; 130; 131_.

Nos últimos anos, principalmente após a publicação dos resultados negativos dos estudos clínicos desenvolvidos em mulheres na pós-menopausa tratadas com CEE, o tratamento isolado com 17β-estradiol em dose fisiológica voltou a ser a primeira escolha 132; 133.

Em relação à função vascular, as carótidas são os principais vasos sanguíneos da circulação cefálica que irrigam o cérebro, sendo que alterações funcionais e morfológicas nessas artérias podem contribuir para o desenvolvimento de aterosclerose e AVE, além de reduzir o fluxo sanguíneo cerebral, o que pode gerar déficit cognitivo; (20% dos casos de AVE ocorrem devido a alterações nas carótidas) 134. Conforme estatísticas publicadas em 2016, 12; 135 nos EUA dos 795.000 mil casos de AVE reportados, 53,3% ocorreram em mulheres e destas 58,4% foram a óbito. A cada ano, o índice de AVE torna-se maior em mulheres a partir dos 55 anos, ou seja, nos primeiros anos da pós-menopausa 12; 135.

Não temos conhecimento até o momento de estudos sobre o efeito do tratamento com estrógeno na função de carótidas, isto é, na reatividade vascular desse vaso sanguíneo em mulheres na pós-menopausa. No presente estudo foi

demonstrado, pela primeira vez, efeitos diferenciais dos tratamentos iniciados precoce e tardiamente com estrógeno em anéis de carótidas comuns isolados de fêmeas SAMR1 e SAMP8 ovariectomizadas.

No estudo clínico ELITE, que foi planejado para demonstrar o efeito do tratamento com estrógeno iniciado precoce e tardiamente após a menopausa, foi demonstrado que o tratamento estrogênico precoce estabilizou o desenvolvimento da placa de ateroma, entretanto houve aumento no tamanho da placa quando o início do tratamento foi tardio 46. A progressão no desenvolvimento da placa de ateroma em macacas Cynomolgus foi proporcional ao tempo de privação estrogênica após ovariectomia 136. Esses estudos indicam a existência de uma “janela de oportunidade terapêutica” para o início do tratamento hormonal.

No nosso trabalho, os resultados obtidos após os tratamentos com estrógeno iniciados precoce e tardiamente em fêmeas SAMP8 ovariectomizadas muito se assemelham àqueles verificados em humanos e macacas descritos acima. Além do mais, o trabalho contribui para o entendimento dos mecanismos de ação do estrógeno envolvidos nos riscos e benefícios vasculares segundo a janela de oportunidade terapêutica, a qual sugere a existência de um tempo ideal para o início do tratamento com estrógeno na pós-menopausa.

Nas fêmeas SAMR1, ambos os tratamentos reduziram a resposta vasoconstritora à Phe, entretanto, nas fêmeas SAMP8, apesar do tratamento com início precoce não ter alterado a vasoconstrição induzida por Phe, o tratamento iniciado tardiamente aumentou esse parâmetro.

O estrógeno atua sobre o tônus vascular por diferentes mecanismos, dentre os quais pode ser citado o efeito sobre os fatores relaxantes derivados do endotélio,

tais como o NO e a PGI2, e os fatores contráteis, como as EROs e o TXA2 27; 28; 29; 30; 66; 67; 137; 138; 139

.

Demonstramos que a magnitude de contração à Phe na presença de L-NAME foi maior nos anéis de carótidas isolados de fêmeas resistentes a senescência dos grupos SAMR1-E2(E) e SAMR1-E2(L) do que no grupo SAMR1-OVX, sugerindo que

independente do tempo de início do tratamento, o estrógeno pode atuar sobre a geração de NO nessa linhagem. Por outro lado, nos anéis de carótidas isolados de fêmeas SAMP8, foi observado que a magnitude da contração à Phe na presença de L-NAME foi menor, principalmente no grupo SAMP8-E2(L).

De fato, foi aventada a hipótese de que na senescência associada a pós- menopausa a redução da vasodilatação endotélio-dependente ocorre devido à redução na produção de NO e por isso neste período há aumento do risco de doenças cardiovasculares 140; 141; 142. Estudos em modelos animais confirmam o observado na clínica, uma vez que a ovariectomia reduz a produção de NO e o tratamento com estrógeno restaura essa produção. Esse fenômeno foi observado em diversos leitos vasculares como artéria uterina 143, arteríolas do músculo gracilis

144

e em aorta 145.

É importante mencionar que nos modelos acima descritos as fêmeas ovariectomizadas eram jovens e o tratamento hormonal era iniciado após um determinado período de privação estrogênica (geralmente 1 mês), o que pode ser caracterizado como um tratamento tardio em animais jovens. Por se tratar de um assunto recente, a literatura ainda não discutia a questão do tempo de início do tratamento e por isso os fatores precoce e/ou tardio eram desconhecidos.

Os tratamentos E2E e E2L aumentaram os níveis de RNAm para eNOS em

diferença desse parâmetro nas fêmeas SAMP8-OVX. O aumento da eNOS pelo estrógeno já foi demonstrado na artéria uterina de cobaias jovens ovariectomizadas

146; 147

, aorta de fêmeas Wistar 148, aorta de SHR ovariectomizadas 28 e coronárias de macacas Cynomolgus 149. O mesmo fenômeno foi observado em cultura de células coronarianas humanas 150 e pulmonar de cordeiro 151. Além disso, nos estudos desenvolvidos em cultura de células endoteliais humanas tratadas com estrógeno foi demonstrado que a ativação da eNOS é dependente de MAPK 152 e/ou Akt 153. Com isso, sugerimos que no envelhecimento o estrógeno perde a capacidade de modular a eNOS e consequentemente a produção de NO.

Outro fator a ser considerado nas alterações vasculares mediadas por estrógeno é a sua ação sobre a geração de EROs. Está bem descrito na literatura que o aumento na produção de EROs contribui para a disfunção vascular e, dentre as EROs, o ânion superóxido ganhou destaque por sua capacidade de reduzir a biodisponibilidade de NO, porque transforma-o em peroxinitrito 154; 155. Portanto, aventamos a hipótese que o tratamento hormonal E2(L) nas fêmeas SAMP8 poderia

ser o mediador da hiperreatividade observada nos anéis de carótidas isolados desse grupo animais.

Sabe-se que a superóxido dismutase (SOD) é uma enzima antioxidante, pois dismuta superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio 156. Em nosso trabalho demonstramos que o tempol, mimético da SOD, reduziu a vasoconstrição à Phe em anéis de carótidas comuns isolados de fêmeas SAMR1-OVX, mas não naquelas tratadas com E2E e E2L, sugerindo que nos vasos sanguíneos desses grupos o

estrógeno reduziu a produção de EROs.

Na circulação periférica de diversos outros modelos experimentais de fêmeas jovens ovariectomizadas, a hiperreatividade a diferentes agonistas vasoconstritores

estavam associados com o aumento da geração de EROs. A geração de EROs bem como a hiperreatividade a agonistas vasoconstritores foram diminuídas pelo tratamento com 17β-estradiol ou CEE 26; 27; 28; 59; 74

.

Por outro lado, demonstramos que o tempol não alterou a reatividade à Phe das carótidas isoladas de fêmeas SAMP8-OVX, SAMP8-E2(E) e SAMP8-E2(L), sugerindo que no envelhecimento a vasoconstrição a esse agonista não esteja relacionada diretamente com a geração EROs.

Outra hipótese aventada para explicar o efeito do estrógeno na reatividade de carótidas durante o envelhecimento seria a produção de prostanóides vasodilatadores, como a PGI2, e/ou vasoconstritores, como o TXA2, PGF2α e PGH2,

derivados da COX-1 ou COX-2.

De fato, os tratamentos E2(E) e E2(L) em fêmeas SAMR1-OVX aumentaram a

produção de PGI2 em perfusato de anéis de carótidas comuns isolados de fêmeas

SAMR1 estimulados com Phe. Além disso, apenas o tratamento E2(E) reduziu a

produção de TXA2,sugerindo que a produção de tromboxano pode ser dependente

do tempo de tratamento com estrógeno. No que se refere às fêmeas SAMP8, os tratamentos E2(E) e E2(L) não alteraram a produção de PGI2 no perfusato de anéis

de carótida isolados, entretanto o tratamento E2(L) aumentou a produção de TXA2.

Em concordância com os nossos resultados, são vários os trabalhos que também demonstraram que o estrógeno interfere na produção de PGI2 em diversos

leitos vasculares como artérias uterinas de ovelhas, mesentéricas e cerebrais de ratas e aorta de macacas Cynomolgus ovariectomizadas, conforme revisão de HERMENEGILDO et al. (2006) 78. Além dos leitos vasculares, em cultura de células endoteliais humanas 65; 157 e plaquetas humanas 158 o estrógeno também aumentou a produção de PGI2.

A modulação da produção PGI2 e TXA2 são reguladas por meio da alteração

das isoformas da COX 159. Os tratamento E2E e E2L não promoveram alteração nos

níveis de RNAm e na expressão proteica da COX-1 e COX-2 em carótidas isoladas de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8. Apesar desse resultado, a presença da indometacina, inibidor não seletivo da COX, reduziu a resposta vasoconstritora à Phe nos anéis de carótidas comuns isoladas das fêmeas do grupo SAMR1-OVX e nos três grupos experimentais de fêmeas SAMP8, sugerindo possível aumento da atividade dessa(s) enzima(s).

Em cultura de células umbilicais humanas, o estímulo com estrógeno ao longo de 48 horas aumentou a produção PGI2, entretanto não alterou a expressão das

isoformas da COX 157, sugerindo efeito não clássico do hormônio sobre esse parâmetro. Baseados nessa premissa, decidimos avaliar a participação da COX na geração de prostanóides bem como na curva concentração-resposta à Phe.

Detectamos que os tratamentos E2E e E2L aumentaram a produção de PGI2

via COX-2 no perfusato de anéis de carótidas isolados de fêmeas da linhagem SAMR1, enquanto na linhagem SAMP8 o tratamento E2L aumentou TXA2, porém

proveniente COX-1. De fato, CALKIN et al.(2002) 181demonstraram que a rápida vasodilatação em arteríolas subcutâneas após administração sublingual de estrógeno foi reduzida após o tratamento com celecoxib, inibidor específico da COX- 2. Vale a pena ressaltar que a proibição da venda de inibidores seletivos da COX-2 se deu devido ao aumento de doenças cardiovasculares em pacientes que faziam o uso desses fármacos 160; 161. Apesar de não haver estudos separando o risco entre os sexos, nas mulheres inibir a via pela qual o estrógeno gera prostanóide vasodilatador e anti-agregante plaquetário.

O processo de conversão de ácido araquidônico para TXA2 e PGI2 envolve

três enzimas, a cPLA2, COX-1/2 e TXA2S ou PGI2S 78. Apesar de não termos

observado alteração na expressão proteica e nos níveis de RNAm das isoformas da COX em carótidas de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8, nas SAMP8 os tratamentos E2(E) e E2(L) aumentaram os níveis de mRNA para TXA2S, o que pode

ter contribuído para o aumento do TXA2. DEER et al. (2014)162 demonstraram em

artérias cerebrais de fêmeas Sprague-Dawley jovens que o aumento da produção PGI2 ocorreu concomitantemente com o aumento dos níveis RNAm de PGI2S e sem

alterar a expressão das isoformas da COX.

Os efeitos do estrógeno sobre a via das COXs podem ser mediados pelos dois receptores intracelulares de estrógeno. Detectamos a expressão do RNAm e proteica do ERα-66kDa, receptor clássico de estrógeno, nas carótidas isoladas de SAMR1 e SAMP8, entretanto nas carótidas das SAMR1 as expressões foram semelhantes entre os grupos. No que se refere a linhagem SAMP8, apesar dos

tratamentos E2(E) e E2(L) não alterarem a expressão proteica foi observado redução

dos níveis de RNAm.

Está bem estabelecido na literatura que o ERα-66kDa quando ativado pelo estrógeno medeia os principais efeitos benéficos na vasculatura, como o aumento

da produção de NO, observado em aortas de camundongos fêmeas C57Bl/6 163, a

contribuição para a re-endotelização após injúria tecidual 164 e o aumento na produção de PGI2, via COX-2 165. Esses efeitos benéficos do ERα-66kDa podem

ocorrer independentemente da alteração na expressão do receptor 115.

Com o desenvolvimento de animais Knockout e CreLoxP foi possível entender o papel específico de cada receptor estrogênico na vasculatura. Por exemplo, em animais Knockout para o ERα, o tratamento com estrogênio não foi eficaz em

promover a re-endotelização após injúria tecidual 166. O mesmo fenômeno foi observado em camundongos CreLoxP para ERα (ERαflox/flox

) na formação de placa aterômica 167, sugerindo que o ERα-66kDa atua na proteção contra o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Entretanto, produtos do splicing alternativo do ERα-66kDa vem sendo apontado como um dos novos interferentes do estrógeno em diferentes tecidos.

Sabe-se que o splicing alternativo é um processo pós-transcricional comum em eucariotos que podem gerar novas proteínas funcionais. Pela primeira vez demonstramos em carótidas comuns de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8 a expressão proteica, bem como os níveis de RNAm, do ERα36kDa. Nas SAMR1 a expressão do ERα36kDa é semelhante entre os grupos experimentais, entretanto nas carótidas das fêmeas SAMP8-OVX tratadas com E2(L) houve aumento.

O ERα-36kDa foi descrito pela primeira vez em células MCF-7, linhagem de célula epitelial derivada de adenocarcinoma mamário 112, entretanto sua expressão foi descrita também nas glândulas mamárias, nos ovários, no útero 113, no sistema nervoso central 168 e diversos em tipos de câncer, como o de mama 169, endométrio, estômago 170; 171 e osso 172.

As ações vasculares do ERα-36kDa ainda são pouco conhecidas. Foi observado em artéria cerebral de machos Sprague-Dawley que a aplicação do anticorpo anti-ERα-36kDa, na cuba para órgãos isolados, reduziu a vasodilatação induzida por estrógeno 173. Além disso, fêmeas Sprague-Dawley submetidas à isquemia cerebral apresentaram aumento da expressão do ERα-36kDa no cérebro

168

; entretanto, o motivo desse aumento após a isquemia cerebral não foi elucidado. Em culturas de células PC-12 submetidas à privação de glicose, similar ao

observado após isquemia, o tratamento com estrógeno aumentou a viabilidade da célula via ERα-36kDa 168

.

Os hormônios sexuais podem alterar a expressão de splicing alternativos. O estrógeno, o DHEA e a testosterona aumentaram a expressão do ERα-36kDa em células tumorais humanas 174; 175, contudo é importante ressaltar que conforme a observação de SOŁTYSIK et al. (2015) 113 não se sabe ao certo se a testosterona aumentou diretamente a expressão de ERα36kDa ou se é um efeito da conversão de testosterona em estrógeno pela aromatização.

Nas células tumorais o ERα-36kDa ativa vias de proliferação celular (Sołtysik

113

e Czekaj, 2015), porém não se pode descartar que a redução da expressão do ERα-66kDa pode ser o fator chave para o aumento do splicing alternativo. Observamos redução nos níveis de RNAm para o ERα-66kDa nos tratamento E2(E)

e E2(L), justamente nessa linhagem houve aumento do ERα-36kDa. Em células

tumorais foi demonstrado por Wallacides et al., (2012) e Fu et al., (2013) que o aumento na expressão proteica do ERα36-kDa reduziu a do ERα66kDa.

A proliferação celular promovida pelo ERα-36kDa em células tumorais está relacionada com a via MAPK/ERK 114. Portanto, atualmente, diferentes autores estão caracterizando a expressão do ERα-36kDa em diversos tecidos, entretanto as vias de sinalização do ERα-36kDa ainda não são claras e muitas vezes opostas de acordo com o tecido.

Resumindo, nesse trabalho demonstramos que os efeitos do estrógeno não foram benéficos em SAMP8, mas sim em SAMR1. Assim, ficou evidente que o envelhecimento e o tempo de início do tratamento com estrógeno são dois fatores importantes no mecanismo de ação desse hormônio em carótidas comuns.

7 CONCLUSÃO

Os dados apresentados permitem concluir que o estrógeno promove efeitos

distintos nas carótidas comuns de fêmeas SAMR1 e SAMP8 ovariectomizadas, sendo benéficos em SAMR1 e maléficos em SAMP8, dependo do tempo de início do tratamento. Esse efeito distinto confirma a existência da janela de oportunidade terapêutica durante o tempo de privação do estrógeno.

8 PERSPECTIVA

O tratamento com estrógeno na pós-menopausa deve ser revisto e, quando