Influência dos tratamentos com estrógeno, iniciados precoce e tardiamente, em fêmeas com envelhecimento precoce (SAMP8) ou não (SAMR1) ovariectomizadas: estudo do mecanismo de ação em carótidas.

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(1)0. TIAGO JANUÁRIO DA COSTA. Influência dos tratamentos com estrógeno, iniciados precoce e tardiamente, em fêmeas com envelhecimento precoce (SAMP8) ou não (SAMR1) ovariectomizadas: estudo do mecanismo de ação em carótidas. Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Farmacologia Orientadora: Profa. Dra. Maria Helena Catelli de Carvalho. São Paulo 2017.

(2) 1. TIAGO JANUÁRIO DA COSTA. Influência dos tratamentos com estrógeno, iniciados precoce e tardiamente, em fêmeas com envelhecimento precoce (SAMP8) ou não (SAMR1) ovariectomizadas: estudo do mecanismo de ação em carótidas. Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Farmacologia Orientadora: Profa. Dra. Maria Helena Catelli de Carvalho Versão corrigida. A versão original eletrônica encontra-se tanto na Biblioteca do ICB quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP (BDTD).. São Paulo 2017.

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(4) 3. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS. Candidato: Tiago Januário Costa. Título da Tese: Influência dos tratamentos com estrógeno, iniciados precoce e tardiamente, em fêmeas com envelhecimento precoce (SAMP8) ou não (SAMR1) ovariectomizadas: estudo do mecanismo de ação em carótidas. Orientadora: Profa. Dra. Maria Helena Catelli de Carvalho.. A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese, em sessão pública realizada a .............../................./................., considerou ( ) Aprovado ( ) Reprovado. Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................. Nome: ....................................................................................................... Instituição: .................................................................................................. Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................. Nome: ....................................................................................................... Instituição: .................................................................................................. Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................. Nome: ....................................................................................................... Instituição: .................................................................................................. Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................. Nome: ....................................................................................................... Instituição: .................................................................................................. Presidente:. Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ..................................................................................................

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(7) 6. Dedicatória À minha família: Oripes, meu querido pai, Alaíde, minha querida mãe, e Beatriz, minha querida irmã. À Dra. Maria Helena, a quem eu posso chamar de mentora. AGRADECIMENTOS.

(8) 7. Quando eu entrei no laboratório de Hipertensão e Diabetes, ainda como iniciação científica, imaginei que aquele cenário permaneceria para sempre. Não. O tempo passou e aquele jovem rapaz cientificamente indefeso, que gostava de medir cardiomiócitos, busca hoje o título de doutor. Para isso, muitos professores fizeram parte da minha formação o qual externo meus agradecimentos. Profa Dra. Maria Helena Catelli de Carvalho, grande mentora. Agradeço pelo incentivo ao longo da pós-graduação, todos os momentos de formação bem como as longas conversas sobre a vida (política, religião e sociedade). Ser seu aluno é um orgulho que levarei para toda vida. Profa. Dra. Ana Paula Dantas e Profa. Dra. Elisabet Vila. Gracias por recibirme en sus laboratorios así como en toda la colaboración y formación. Me sentí muy acogido los meses que trabajé con vosotras. ¡De verdade, “Moltes gràcies”! Profa. Dra. Eliana Hirome Akamine, obrigado por todo ajuda para o desenvolvimento da minha tese, por acreditar no meu trabalho, me adotar como colaborador e, por inúmeras vezes, me receber em seu escritório para grandes discussões. Prof. Dr. Francesc Jiménez-Altayó. Amic! Gracias por toda ayuda científica, pero me gusta más decir que tuve grandes momentos de amistad contigo; eres un ejemplo de jefe y científico. Profa Dra. Zuleica Bruno Fortes e Profa. Dra. Graziela Scaliante Ceravolo. As raízes que vocês plantaram durante minha formação persistem até hoje. Obrigado pelas inúmeras dicas, correções e atenção com meus projetos. A pós-graduação não teria graça sem o convívio diário com os amigos. Na verdade colegas que, ao longo do tempo e da afinidade, transformam-se em grandes amigos e compartilham as dores e as delícias da vida e, claro, da pós-graduação. A vocês o meu muito obrigado. Laboratório de Biologia vascular e Hipertensão: Renee de Nazaré Oliveira da Silva, Carolina Midori Hashimoto, Cinthya Echem, Simone Marcieli Satoretto, Vanessa Oliveira, Aline Carla Inada, Maria Aparecida de Oliveira, Sônia Leite, Marta Rodrigues, Bruno Marquez, Paula Barros, Sthephen Rodrigues, Maristella Landgraf, Andrea Prisco, Vanessa Miyoshi, Antônio Soares Junior, Sandra Silva, Lucas Giglio Colli e Rosangela dos Santos-Eicheler. A vosotros muchas gracias / A vosaltres moltes gràcies IDIBAPS: Nadia Castillo, Cira Rubies, Manel Garabito y Joaquim Bobi. Departament de Farmacologia, Terapèutica i Toxicologia – Universitat Autònoma de Barcelona: Yara Onetti, Roger Cugata, Julia Relat Pardo, Cristina Marcille, Ferran Tarrés, Nuria Masip, Kontxi Gora Lantzi, Sofia Romeeva, Mayte Cordero Hernandes, Isabel Calvarro Delgado, David V. Aguillar Bernabeu y Lorena Martínez Morales . Agradecimientos especiales Yara Onetti. Gran amiga de postgrado, experimento y discusiones. Gracias por toda ayuda en mi primera estancia lejos de mi país. Me he reído mucho contigo. Cira Rubies, ejemplo de conducta científica. Gracias por me escuchar y me ayudar siempre. ¡Café, chocolate y ciencia siempre! Nadia Castillo, gran amiga y compañera de vida (viaje, cenas y dudas de la vida). Mi vida cambio contigo y te echo mucho de menos. “Eskerrik asko dena”..

(9) 8. Manel Garabito. Gran compañero de postgrado. Gracias por toda ayuda en mi estancia en Barcelona y por fiar de mi trabajo. Joaquim Bobi. Gracias por toda ayuda en el laboratorio y escuchar mis dudas. ¡Que venga más discusiones de COX-2, bueno, quizá de COX-1 también! Agradecimentos especiais Mônica Nunes e Camila Trindade que além de uma valiosa amizade foram essenciais no suporte administrativo. Obrigado! Tereza Cristina Soutto Mayor , obrigado pelo grande suporte na formatação deste trabalho. Sônia Leite e Marta Rodrigues. As mãos que me ensinaram os primeiros experimentos vasculares. Vocês foram a base do que hoje posso transmitir a outros. Grandes professoras. Obrigado por tudo. Renée de Nazaré e Carolina Midori. Valiosa amizade. Valiosas dicas. Valiosa paciência comigo. Valioso respeito. Amizade além-ciência! Cinthya Echem, obrigado pelos anos de companheirismo nos mais diversos assuntos da pós-graduação; discutimos burocracia, ciência e filosofia. Maria Aparecida de Oliveira. Companhia indispensável ao longo da pós-graduação. Obrigado pelos incentivos científicos, acreditar no meu trabalho e compartilhar grandes momentos de amizade como viagens, caronas e discussões. Simone Marcielli Satoretto. Exemplo científico, de conduta e de pessoa. Um exemplo a ser seguido. Obrigado por todos os momentos! Beatriz Felice Ponzio, obrigado por me inserir no mundo da farmacologia. Ao longo dos anos de pós-graduação grandes alunos passaram pelo laboratório. Eu tive a honra de compartilhar com eles a pós-graduação e receber suas valiosas dicas científicas. Gisele Facholi Bomfim, Fernando Filgueira, Núbia de Souza Lobato, Eveline Fonseca, Graziela Neves Hagihara, Andrea Zago Chinaglia, Luciana R. Giaquinto e André Luiz Colaço (in memorian) A família exerce um papel importante na formação. São eles que rezem, que torcem e orgulham-se de cada conquista A minha família “Januário da Costa” e “Pereira” o meu muito obrigado. A vida com os amigos é leve e as diferenças ideológicas, de crenças e de opiniões fortalecem as discussões. Por isso tenho mais que amigos, tenho conselheiros. Saúl Barreales, Richardt Landgraf, Natália Yara, Adriana Vitor Ribeiro, Natália Fontenelle, Leonardo Gonçalves, Milene Tavares Fontes, Pe. Otacílio F. de Lacerda, Pe. Antônio C. Frizzo, Pe. Paulo Afonso A. Sobrinho, Ivanildo de Lima, Bernadete Morisco e Luzia Chacin. Agradecimentos especiais Aline Vitor Ribeiro. Amiga, conselheira, companheira, professora e brava quando necessário. Os melhores momentos da minha vida nos últimos anos foram contigo. Obrigado por tudo! A PASCOM (Pastoral da Comunicação) da Paróquia Santo Antônio Gopoúva que durante muitos anos acolheu meu trabalho como um pseudojornalista e, claro, participou ativamente da minha formação. Externo o meu agradecimento a toda equipe que tive o prazer de trabalhar..

(10) 9. Ao longo da minha formação tive a honra de receber conhecimento de grandes professores. Aos senhores (as) o meu respeito e admiração Kátia de Angelis, Luciana Rossoni, Elisa Mitiko Kawamoto, Lucia Rosseti Lopes, Rita Tostes, Antônio Carlos de Oliveira, Silvia Lacchini, Szulim Ber Zinguer, Luiz Roberto G. de Brito e Cristoforo Scavone..

(11) 10. O aluno Tiago Januário da Costa e a orientadora Profa. Dra. Maria Helena Catelli de Carvalho agradecem a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), a Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal. de. Nível. Superior. (Capes). e. ao. Conselho. Nacional. de. Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro para desenvolvimento desta pesquisa. Bolsa FAPESP Doutorado (2013/19423-9); Bolsa FAPESP BEPE (2015/26690-9); Convênio CAPES-DGU (269/12); Projeto Regular FAPESP (2014/03758-4); Bolsa CNPq [PQ-2014 (308357/2014-0)]..

(12) 11. “Eu faço parte dos que pensam que a Ciência é belíssima. Um cientista em um laboratório não é apenas um técnico, ele é também uma criança diante de fenômenos naturais que o impressionam como um conto de fada. Não podemos acreditar que todo progresso científico se reduz a mecanismos, máquinas engrenagens, mesmo que essas máquinas tenham sua própria beleza”. (Maria Curie) Sem arriscar não vivemos a esperança. (Dom Helder Câmara).

(13) 12. RESUMO Costa, T.J. Influência dos tratamentos com estrógeno, iniciados precoce e tardiamente, em fêmeas com envelhecimento precoce (SAMP8) ou não (SAMR1) ovariectomizadas: estudo do mecanismo de ação em carótidas. 2017.104f. Tese (Doutorado em Farmacologia). São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.. Ensaios clínicos observacionais e em animais demonstraram que o estrógeno exerce proteção cardiovascular, entretanto existem controvérsias mesmo após estudos clínicos randomizados e multicêntricos. Tem sido sugerido que exista uma janela de oportunidade terapêutica, teoria timing hypothesis, que analisa os tratamentos com estrógeno, iniciados precoce ou tardiamente, em mulheres na pósmenopausa. Baseados nisso avaliamos a função de carótidas de camundongos fêmeas com senescência acelerada (SAMP8) ou resistentes à senescência (SAMR1) ovariectomizadas e tratadas com estrógeno precoce ou tardiamente na dose de 5 µg/Kg, aplicada por via subcutânea a cada três dias. Em SAMR1 os tratamentos com estrógeno promoveram vasculoproteção, reduzindo vasoconstrição à fenilefrina e aumentando a produção de prostaciclina (PGI2) e nas carótidas das SAMP8 o tratamento com início precoce não alterou o efeito da ovariectomia, porém o tratamento com início tardio aumentou a vasoconstrição à fenilefrina, a produção de tromboxano (TXA2) e a expressão proteica do ERα-36kDa, splicing alternativo do receptor clássico ERα-66kDa. Portanto, os efeitos do estrógeno não foram benéficos no envelhecimento, provavelmente podendo contribuir para o desenvolvimento de doenças cerebrovasculares decorrentes de alteração na circulação cerebral.. Palavras-chave: Estrógeno. Pós-menopausa. Doenças cardiovasculares. Receptor de estrógeno. Splicing alternativo. Artéria carótida..

(14) 13. ABSTRACT Costa, T.J. Influence of early and late estrogen treatments in ovariectomized senescence accelerated (SAMP8) and resistant (SAMR1) female mice: a study of the mechanism of action in the carotid. 2017. 104p. Thesis (Doutorado em Farmacologia) – São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.. Observational clinical trials and animal studies demonstrated that estrogen promote cardiovascular protection. However, there are controversies after randomized and multicenter clinical trials. It has been suggested that there is a therapeutic window of opportunity – timing hypothesis theory –, which analyzes the early and late estrogen treatment in postmenopausal women. Based on this, we evaluated the carotid function in ovariectomized senescence (SAMP8) or senescence-resistant (SAMR1) female mice, treated with estrogen in mineral oil solution dose of 5 μg/kg by subcutaneous injection every three days. In SAMR1 estrogen treatments promoted vasculoprotection, reducing the vasoconstriction to phenylephrine and increasing the prostacyclin (PGI2) production. In carotid of SAMP8 early-onset estrogen treatment did not change the effect observed in the ovariectomy, however late-onset estrogen treatment increased the vasoconstriction to phenylephrine, the thromboxane production (TXA2) and the protein expression of ERα-36kDa, alternative splicing of the classical receptor ERα-66kDa. Therefore, the effects of estrogen were not beneficial in aging, contributing to the development of cardio and cerebrovascular diseases due to alteration cerebral circulation. Keywords: Estrogen. Postmenopause. Cardiovascular disease. Estrogen receptor. Alternative splicing. Carotid artery..

(15) 14. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACh. Acetilcolina. ANOVA. Análise de variância. AUC. Área under the curve (em português: área sob da curva). CEE. Conjugado estrogênio equino. DHEA. Desidroepiandrosterona. E2. Estrógeno. ERE. Elemento responsivo ao estrógeno. ERα. Receptor de estrógeno alpha. ERβ. Receptor de estrógeno beta. eNOS. Óxido Nítrico Sintase Endotelial. EROs. Espécies Reativas de Oxigênio. NPS. Nitroprussiato de sódio. OVX. Ovariectomia. PHE. Fenilefrina. TH. Terapia Hormonal.

(16) 15. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Esquema representativo das terminologias menopausa, perimenopausa, pósmenopausa e climatério. ........................................................................................................................ 19 Figura 2 – Estudos clínicos e experimentais ao longo dos anos sobre o tratamento hormonal com estrógeno no sistema cardiovascular. ............................................................................................ 25 Figura 3 – Esquema representativo dos domínios funcionais dos receptores clássicos de estrógeno alfa (ERα-66kDa) e beta (ERβ). ............................................................................................ 26 Figura 4 – Esquema representativo da estrutura gênica do receptor de estrógeno alfa (ERS1 – ERα). ...................................................................................................................................................... 27 Figura 5 - Esquema representativo da biossíntese de prostanóides ................................................... 31 Figura 6 – Imagens ilustrativas de camundongos da linhagem SAMP. ................................................ 34 Figura 7 - Esquema representativo dos domínios funcionais do receptor clássico de estrógeno (ERα-66kDa) e dos splicing alternativos (ERα-36kDa e ERα-46kDa). .................................................. 36 Figura 8 - Esquema representativo do delineamento experimental..................................................... 39 Figura 9 – Peso uterino úmido e seco de fêmeas ................................................................................. 49 Figura 10 - Curvas concentração-efeito cumulativas à acetilcolina (ACh) e ao nitroprussiato de sódio (NPS). ........................................................................................................................................... 52 Figura 11 - Curvas concentração-efeito cumulativas à fenilefrina (Phe) ............................................. 54 Figura 12 - Curvas concentração-efeito cumulativas à fenilefrina (Phe) com L-NAME.. ...................... 56 Figura 13 – Níveis de RNAm da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) ............................................ 57 Figura 14 – Curvas concentração-efeito cumulativas à fenilefrina (Phe) com Tempol ........................ 59 Figura 15 - Curvas concentração-efeito cumulativas à fenilefrina (Phe) com Indometacina . .............. 61 Figura 16 – Produção de PGI2 e de TXA2 . ............................................................................................ 63 Figura 17 – Níveis de RNAm e expressão proteica da COX-1 e da COX-2. ....................................... 65 Figura 18 – Níveis de RNAm da PGI2 sintase e da TXA2 sintase ....................................................... 66 Figura 19 – Curvas concentração-efeito cumulativa à fenilefrina (Phe) com SC 560. . ....................... 68 Figura 20 – Curvas concentração-efeito cumulativa à fenilefrina (Phe) com NS 398. ......................... 70 Figura 21 - Produção de PGI2 e de TXA2 na presença de inibidores específicos para COX1 (SC560) e COX2 (NS398). ..................................................................................................................... 72 Figura 23 - Níveis de RNAm e protéico do receptor de estrógeno alfa (ERα66kDa) .......................... 73 Figura 24 – Níveis de RNAm e expressão proteica do ERα36kDa, splicing alternativo do receptor alfa clássico de estrógeno ...................................................................................................................... 75.

(17) 16. SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO _________________________________________________________________ 18 1.1 Terapia hormonal com estrógeno em mulheres na pós-menopausa: do efeito benéfico ao novo conceito de tratamento precoce e tardio_________________________________ 18 1.2 Estrógeno: efeitos no sistema cardiovascular ________________________________ 26 1.3 Envelhecimento e pós-menopausa: associação com as doenças cardiovasculares _ 32 1.3.1 Splicing alternativo ___________________________________________________ 35 2. OBJETIVO ___________________________________________________________________ 37 3. MATERIAL E MÉTODOS ________________________________________________________ 38 3.1 Animais ________________________________________________________________ 38 3.2 Procedimento cirúrgico de remoção dos ovários (ovariectomia) ________________ 38 3.3 Tratamentos com estrógeno iniciados precoce e tardiamente ___________________ 39 3.4 Grupos experimentais ____________________________________________________ 40 3.5 Avaliação da eficácia da ovariectomia _______________________________________ 40 3.5.1 Peso do útero _______________________________________________________ 41 3.5.2 Dosagem hormonal ___________________________________________________ 41 3.6 Reatividade vascular _____________________________________________________ 41 3.7 Expressão do RNAm por reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real _ 43 3.8 Imunofluorescência ______________________________________________________ 45 3.9 Método de Elisa para dosagens de PGI2 e TXA2 _______________________________ 45 3.10 Expressão proteica por Western Blot_______________________________________ 46 3.10.1 Immunoblotting ______________________________________________________ 47 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA ________________________________________________________ 48 5 RESULTADOS ________________________________________________________________ 49 5.1 Eficácia do procedimento de ovariectomia ___________________________________ 49 5.1.1 Peso uterino ________________________________________________________ 49 5.1.2 Dosagem hormonal ___________________________________________________ 50 5.2 Avaliação das respostas vasodilatadoras a ACh e ao NPS obtidas em anéis de carótidas comuns isolados de fêmeas SAMP8 e SAMR1 ___________________________ 51 5.3 Avaliação da resposta vasoconstritora à Phe obtida em anéis de carótidas comuns isolados de fêmeas SAMP8 e SAMR1. __________________________________________ 53 5.4 Avaliação da resposta vasoconstritora à Phe na presença e ausência de L-NAME obtidas em anéis de carótidas comuns isoladas de fêmeas SAMP8 e SAMR1. _________ 55 5.5 Avaliação da expressão do RNAm da eNOS em carótidas comuns isoladas de fêmeas SAMP8 e SAMR1____________________________________________________________ 57 5.6 Avaliação da resposta vasoconstritora à Phe na presença e ausência de tempol obtidas em anéis de carótidas comuns isolados de fêmeas SAMP8 e SAMR1 _________ 58.

(18) 17. 5.7 Avaliação da resposta vasoconstritora à Phe na presença e ausência de indometacina obtidas em anéis de carótidas comuns isoladas de fêmeas SAMP8 e SAMR1 _________ 60 5.8 Avaliação da produção de prostanóides em carótidas comuns isoladas de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8 ___________________________________________________ 62 5.9 Avaliação dos níveis de RNAm e expressão proteica das isoformas da COX (COX-1 e COX-2) em carótidas comuns isoladas de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8. ____ 64 5.10 Avaliação dos níveis de RNAm da PGI2 sintase e TXA2 sintase em carótidas comuns isoladas de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8 ______________________________ 66 5.11 Avaliação da resposta vasoconstritora à Phe na presença e ausência do inibidor seletivo da COX1, SC560, obtidas em anéis de carótidas comuns isolados de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8. __________________________________________________ 67 5.12 Avaliação da resposta vasoconstritora à Phe na presença e ausência de NS398, inibidor seletivo da COX2, em anéis de carótidas comuns isoladas de fêmeas SAMP8 e SAMR1 ____________________________________________________________________ 69 5.13 Avaliação da produção de prostanóides na presença dos inibidores específico para COX-1 (SC560) e COX-2 (NS398) em carótidas comuns isoladas de fêmeas das linhagens SAMR1 e SAMP8. ___________________________________________________________ 71 5.14 Avaliação da expressão do RNAm e proteica do receptor alfa clássico de estrógeno (ERα66kDa) em carótidas isoladas de fêmeas SAMR1 e SAMP8 ____________________ 73 5.15 Avaliação da expressão do RNAm e proteica do splicing alternativo do receptor de estrógeno (ERα36kDa) em carótidas isoladas de fêmeas SAMR1 e SAMP8 ___________ 74 6 DISCUSSÃO __________________________________________________________________ 76 7 CONCLUSÃO _________________________________________________________________ 87 8 PERSPECTIVA ________________________________________________________________ 87.

(19) 18. 1.INTRODUÇÃO 1.1 Terapia hormonal com estrógeno em mulheres na pós-menopausa: do efeito benéfico ao novo conceito de tratamento precoce e tardio A terapia hormonal com estrógeno ou conjugados estrogênios equinos (CEE), associados ou não a progesterona, com objetivo de proteção cardio e cerebrovascular é, ainda, um assunto de extrema controvérsia. Em 1942, a Food and Drug Administraton (FDA) liberou o uso do Premarin®, o primeiro CEE, com a indicação de amenizar os sintomas vasomotores da pósmenopausa 2. Obviamente, por uma questão de expectativa de vida, que na época era de aproximadamente 50 anos, o hormônio era pouco utilizado. Nos últimos anos com o avanço científico, tecnológico e em programas de saúde pública, o aumento da expectativa de vida feminina cresceu, alcançando a marca de 74,8. 3. anos no Brasil, 87 e 85. 4. anos em países como Japão e Espanha,. respectivamente. Com isso, podemos concluir que atualmente o número de mulheres que adentram na pós-menopausa e permanecem nesta fase por pelo menos um terço de suas vidas cresceu exponencialmente. Segundo a Sociedade Norte Americana de Menopausa, estima-se que no ano de 2025 aproximadamente 1,1 bilhão de mulheres estarão no período da pós-menopausa. A palavra menopausa é derivada do grego “emmenopausis”, junção de duas palavras “mês” e “pausa/cessar” e é definida quando há cessação espontânea da menstruação pelo período de 12 meses correntes. Após esse período inicia-se a pós-menopausa, denominação que perdura até a morte 5 (Figura 1)..

(20) 19. 40. 49-52. 65. 70. +80. Figura 1 – Esquema representativo das terminologias menopausa, pré-menopausa, perimenopausa, pós-menopausa e climatério.. A transição menopausa/pós-menopausa é um processo fisiológico que se inicia entre 49 e 52 anos, com poucas variações entres os países e ao longo dos anos 6. O início dessa transição ocorre quando há redução drástica do número de oócitos e queda da produção de inibina B, uma glicoproteína produzida nas células granulosas do corpo lúteo ovariano. 5 A inibina B é importante na fisiologia do ciclo menstrual por regular a liberação do hormônio folículo estimulantes (FSH) e hormônio luteinizante (LH) logo após a menstruação. Com a redução da inibina B e consequentemente do feedback negativo no eixo hipotalâmico-hipófisário-ovariano há o aumento crônico do FSH e com isso a cessação da função folicular ovariana, levando à redução da produção de estrógeno 5. Apesar de atualmente o conceito e a fisiologia de pós-menopausa serem conhecidos, na década de 1966, por interesses financeiros de diversas indústrias farmacêuticas, a pós-menopausa foi conceituada como “uma fase de decadência de vida”. Esse errôneo conceito foi inserido na sociedade por meio do livro Femine Forever, escrito pelo médico Robert Wilson. No livro consta que:.

(21) 20. As demais consequências físicas da castração são tão variadas, obscuras e caprichosas que a maioria dos médicos fica perplexamente perdida diante da narração dos sintomas pelas suas pacientes menopausadas. Por exemplo, o que pode fazer um pobre médico para uma mulher que se queixa de nervosismo, irritabilidade, ansiedade, apreensão, fogachos, suores noturnos, dores nas juntas, melancolia, palpitações, crises de choro, fraqueza, vertigens, enxaquecas, distração, perda da memória, indigestão crônica, insônia, micções frequentes, coceira na pele, vista seca, nariz seco, boca seca e dores nas costas? 7.. A solução sugerida na época para todas essas alterações promovidas pela menopausa era a terapia hormonal com estrógeno e com isso esse hormônio passou de um simples tratamento farmacológico para a nova pílula do rejuvenescimento. Foi o ano em que a indústria farmacêutica mais lucrou com a venda de hormônios sintéticos. A partir de então diversos estudos na área básica e clínica deram início à busca do entendimento do efeito do estrógeno sobre a biologia humana 8; 9. Mulheres no período fértil são hemodinamicamente mais protegidas contra diversas doenças, dentre elas as do sistema cardiovascular, do que homens na mesma faixa etária10;. 11. . Essa constatação se dá pelo fato de que o índice de. doenças cardiovasculares é maior em homens do que em mulheres até a menopausa, sendo que, após esse período, esse índice pode tornar-se semelhante ou maior do que aqueles observados em homens 12; 13. Dentre as doenças cardiovasculares, o acidente vascular encefálico (AVE) representa 16,4% dos casos, sendo considerada mundialmente uma das principais causas de morte e a principal causa de déficit cognitivo. 11; 12. . É importante ressaltar. que a prevalência de AVE em mulheres tem sido maior do que em homens, aproximadamente 55 mil casos a mais por ano. 12. .. Sabendo-se que na pós-menopausa há redução drástica dos níveis endógenos de estrógeno, é valido propor que este hormônio exerça efeito protetor sobre. os. vasos. sanguíneos. e. coração. de. mulheres. no. período. fértil..

(22) 21. Interessantemente, alterações cardiovasculares também são observadas em mulheres jovens que foram submetidas ao procedimento de remoção cirúrgica dos ovários e/ou útero (pós-menopausa precoce) 14; 15; 16. O uso de hormônios esteróides, como o 17β-estradiol ou CEE, como terapia hormonal(*1) para mulheres na pós-menopausa é considerado uma alternativa eficaz para reduzir o risco de osteoporose, sintomas vasomotores como os fogachos, além da melhora nos quadros de sudorese noturna e secura vaginal 2. Entretanto, do ponto de vista cardio e cerebrovascular os resultados ainda são controversos. Em 1985 foi desenvolvido um dos maiores estudos observacionais sobre os efeitos da terapia hormonal com 17β-estradiol no sistema cardiovascular de enfermeiras do hospital de Framingham (Nurses` Health Study), no qual foi demonstrado efeito cardioprotetor desse hormônio. 19 20. . Durante o período de 10. anos, aproximadamente 48.000 mulheres na menopausa, natural ou cirúrgica, que faziam o uso de terapia hormonal foram acompanhadas e estabeleceu-se que neste grupo. o. índice. de. doença. cardiovasculares foram menor. coronária 19;. 21. aguda. e. morte. por. complicações. . A posteriori, estudos epidemiológicos. demonstraram redução de 35-50% do risco de eventos cardiovasculares em mulheres na pós-menopausa que utilizavam terapia hormonal 22; 23; 24; 25 Os estudos em modelos animais de pós-menopausa (retirada dos ovários) foram. ao. encontro. observacionais.. dos. Fêmeas. resultados. demonstrados. ovariectomizadas,. nos. estudos. consequentemente. com. clínicos redução. drástica dos níveis endógenos de estrógeno, apresentaram disfunção endotelial quando comparadas com fêmeas intactas. (*1). 26; 27; 28; 29; 30. . Neste grupo de fêmeas. O termo terapia de reposição hormonal está em desuso e, atualmente, é considerado errôneo, porém ainda pode ser encontrado na literatura. O termo adotado na última declaração global sobre a terapia hormonal na menopausa foi: menopausal hormone therapy 17; 18..

(23) 22. ovariectomizadas os tratamentos com 17β-estradiol isolado ou com CEE restauraram a disfunção endotelial. 27;. 28;. 29. . Entretanto, estudos clínicos. randomizados multicêntricos como o Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study (HERS I e II) e o Women´s Health Initiative (WHI) levantaram dúvidas sobre os efeitos protetores do estrógeno no sistema cardiovascular. O estudo HERS foi um ensaio clínico randomizado e duplo-cego, iniciado na década de 1990, que testou a eficácia da terapia hormonal com CEE (Premarin® 0,625mg) e acetato de medroxiprogesterona (2,5mg) em mulheres entre 44 e 79 anos(*2) com doença coronária diagnosticada, sendo, por isso, um estudo de prevenção secundária. O estudo perdurou 4,1 anos, acompanhou 2.763 mulheres e os primeiros resultados apontavam que os eventos coronarianos, tromboembólicos venosos e mortes por doenças cardiovasculares foram semelhantes nas usuárias de terapia hormonal e no grupo tratado com placebo. 31; 32; 33. . Todavia, as complicações. cardiovasculares observadas nas mulheres que estavam em tratamento hormonal ocorreram no primeiro ano do estudo e, por isso, foi aventada a hipótese que o tratamento prolongado com estrógeno poderia reduzir o risco cardiovascular, prorrogando, assim, o estudo. 31 Em virtude do exposto acima, esse estudo foi estendido por mais 2,7 anos, nomeado HERS II, completando o total de 6,8 anos. Nesta fase, quando comparadas mulheres que faziam uso de terapia hormonal com as que não faziam, nenhuma diferença foi encontrada em relação à ocorrência de infarto agudo do miocárdio, mortes por doença coronariana ou outros eventos cardiovasculares, exceto para arritmia ventricular não fatal que foi maior no grupo tratado. (*2). A média de idade das mulheres alocadas para o estudo era de 66,7 anos.. 34. . Em 2002,.

(24) 23. deu-se início a outro estudo clínico com o objetivo de suprir críticas e lacunas existentes no HERS I e II. O WHI (Women’s Health Initiative) foi um estudo multicêntrico, randomizado e duplo-cego que avaliou em mulheres de 50-79 anos o efeito da terapia hormonal na prevenção primária da doença cardiovascular, sendo esse o primeiro ponto contrapondo-se ao HERS, o qual avaliou a prevenção secundária 34; 35. No estudo WHI as mulheres foram divididas em dois grupos. O primeiro grupo foi composto por mulheres na pós-menopausa natural que recebeu o mesmo esquema. de. tratamento. utilizado. no. HERS. (associação. de. CEE. com. medroxiprogesterona) e foi observado aumento de 29% no índice de eventos cardiovasculares, determinando a finalização do ensaio clínico neste grupo. Entretanto, no segundo grupo as mulheres estavam na pós-menopausa induzida por histerectomia e essas foram tratadas com CEE sem progesterona,. 34. suprindo umas. das críticas feitas ao ensaio HERS; ausência do uso isolado de estrógeno. Neste segundo grupo, o estudo estendeu-se até 2004 e foi demonstrado que o uso isolado de CEE aumentava o risco de AVE 34. Posteriormente, outros ensaios, incluindo meta-análises,. 36. confirmaram o. aumento de AVE e doença coronária em mulheres que faziam terapia hormonal. 36; 37. sugerindo, portanto, que o estrógeno quando administrado em forma de terapia hormonal exercia efeito maléfico no sistema encéfalo-cardiovascular. Todos os estudos realizados a respeito da terapia hormonal foram considerados de excelente qualidade, no entanto, são alvos de diversas críticas. GRODSTEIN et al. (2006). 38. sugeriram que os resultados negativos quanto à. proteção cardiovascular podem estar relacionados com a média de idade das mulheres selecionadas para o estudo, que era de 66,7 anos, ou seja, uma década.

(25) 24. acima do início da pós-menopausa. Essa crítica vai ao encontro do observado em estudos com macacas Cynomolgus, uma vez que os efeitos benéficos do tratamento hormonal na prevenção da aterosclerose somente ocorriam nas fêmeas com menor tempo de privação do estrógeno, ou seja, as ovariectomizadas que ficaram menor tempo sem receber tratamento hormonal 39. De fato, uma revisão do WHI demonstrou que o maior índice de AVE nas mulheres que faziam uso de terapia hormonal ocorria naquelas acima de 60 anos, ou seja, nas que estavam pelo menos 10 anos na pós-menopausa. 40. . Com isso,. aventou-se a timing hypothesis, ou seja, a existência de uma possível janela de oportunidade terapêutica para o tratamento hormonal na pós-menopausa, onde o estrógeno poderia causar vasculoproteção. 41; 42. .. Com a nova percepção sobre os possíveis efeitos do tratamento hormonal de acordo com o tempo de início e a idade, outros estudos clínicos foram desenhados. O estudo KEEP (Kronos Early Estrogen Prevention Study) demonstrou em 466 mulheres com idade média de 52,7 anos que o tratamento com 17β-estradiol ou CEE iniciado precocemente, ou seja, no início da pós-menopausa, estabilizou a calcificação nas placas de ateroma em relação ao grupo placebo. 43; 44; 45. . Mais. recentemente, o estudo ELITE (Early versus Late Intervention Trial with Estradiol) avaliou a progressão de aterosclerose em mulheres que iniciaram a terapia hormonal antes de completarem 6 anos na pós-menopausa e em mulheres que já estavam nesta condição por pelo menos 10 anos. Em 2016 foi publicado o primeiro resultado desse estudo realizado com 643 mulheres. Foi demonstrado que a progressão da placa de ateroma estabilizou nas mulheres que faziam uso de terapia hormonal e estavam até 6 anos na pós-menopausa. Estas foram comparadas com.

(26) 25. mulheres que estavam sob tratamento hormonal há mais de 10 anos na pósmenopausa e com aquelas tratadas com placebo 46. Portanto, é possível considerar a existência de uma janela de oportunidade terapêutica onde o tempo de início do tratamento com estrógeno pode conferir ou não cardioproteção. Entretanto, os mecanismos pelo qual o hormônio tem esse distinto efeito são até o momento ainda desconhecidos. A figura 2 traz um histórico dos ensaios clínicos com estrógeno em mulheres na pós-menopausa e a contribuição dos estudos em modelos animais para a complementação dos novos ensaios e o entendimento do mecanismo de ação.. Figura 2 – Estudos clínicos e experimentais ao longo dos anos sobre o tratamento hormonal com estrógeno no sistema cardiovascular. Adaptado de GARCIA et al. (2016) 47.

(27) 26. 1.2 Estrógeno: efeitos no sistema cardiovascular Os estrógenos são hormônios sexuais com diversas ações fisiológicas e em diferentes tecidos como vagina, endométrio, ovários, ossos, sistema nervoso central e sistema cardiovascular. Assim, a ausência desse hormônio no organismo pode ocasionar diferentes efeitos em diversos tecidos-alvo 48. As ações clássicas do estrógeno ocorrem por meio de receptores nucleares denominados alfa (ERα, NR3A1; gene ERS1) ERS2). 51. 49; 50. e beta (ERβ, NR3A2: gene. e pelo receptor de membrana acoplado a proteína G denominado GPER. (do inglês, G-protein coupled receptor 30) 52. Os receptores nucleares, ERα e ERβ, são constituídos por quatro domínios funcionais similares denominados da seguinte maneira: região amino (NH2)-terminal (NTD, do inglês N-Terminal Domain); domínio de ligação ao DNA (DBD, do inglês DNA Binding Domain), alça Hinge (ou dobradiça); e domínio de ligação ao agonista, localizado na porção carboxi(COOH)-terminal,. (LDB, do inglês, Ligand Binding. Domain) (Figuras 3 e 4).. Figura 3 – Esquema representativo dos domínios funcionais dos receptores clássicos de Fonte: livro do grupo!! Acrescentar ref no programa. estrógeno alfa (ERα-66kDa) e beta (ERβ). Fonte: Costa et al. (2016) 1.

(28) 27. Estrutura gênica do ERα clássico DNA. RNAm. Proteína. ERα-66kDa Figura 4 – Esquema representativo da estrutura gênica do receptor de estrógeno alfa (ERS1 – ERα). Adaptado de ARNAL et al. (2017) 53. O NTD contém uma região autônoma de ativação transcricional, denominada AF-1, que modula positivamente ou negativamente a transcrição de diversos genes de forma específica em cada célula. Este domínio de regulação é consideravelmente diferente entre o ERα e o ERβ, pois possuem apenas 16-20% de homologia (Figura 3) 54. O domínio DBD é o mais conservado entre ERα e ERβ com 95% de homologia e está estruturado na forma de dois dedos de zinco capazes de reconhecer sequências específicas de DNA em genes-alvo; é denominado de elemento responsivo ao estrógeno – ERE. O domínio Hinge é essencial para a dimerização do receptor e é também um local de rotação (por isso a designação de Hinge, em português "dobradiça") que é essencial para que o receptor alcance diferentes conformações necessárias para a ligação ao DNA (Figura 3). Na porção carboxi-terminal do receptor está o domínio LBD que contém o sitio de ligação ao hormônio e é responsável pela maior parte das funções ativadas pelo agonista como dimerização do receptor e sua translocação para o núcleo, além da atração de moléculas co-reguladoras da transcrição gênica via região autônoma de ativação. Essa região é denominada de AF-2. 55. . Em contraste com a grande.

(29) 28. homologia do DBD entre os dois receptores, os domínios LBD de ERα e ERβ exibem muito. menos. homologia,. 59%,. sugerindo. que. as. afinidades. dos. agonistas/antagonistas para os subtipos de receptores podem diferir (Figura 3). Ambos os receptores nucleares ERα e ERβ foram descritos no sistema cardiovascular sendo observada expressão no músculo liso. 56. e no endotélio. vascular 57. A proteção do estrógeno endógeno no sistema cardiovascular foi observada em diversos modelos animais fêmeas como em ratas espontaneamente hipertensas (SHR). 58; 59. , DOCA-sal. 60; 61. , Dahl sal-sensível. 62. New Zealand. 63. Sprague-Dawley. 26. e Wistar 30. Para atuar em seus receptores intracelulares, o estrógeno penetra nas células por difusão passiva e no citoplasma celular ligam-se aos receptores desencadeando ações transcricionais (genômica clássica) e não transcricionais (não clássica)(*3). Os efeitos não transcricionais ocorrem de maneira rápida (de segundos a minutos) e, como o próprio nome diz, independentemente de transcrição gênica e síntese proteica. 64. . Na vasculatura esses efeitos estão associados principalmente à. vasodilatação e proteção vascular via a produção de prostaciclina. 65. , ativação de. quinases, fosfatases e de canais iônicos presentes na membrana, levando à mobilização de cálcio, ativação de segundos mensageiros e à produção de óxido nítrico (NO)66. Nos efeitos transcricionais, após a formação do complexo estrógeno-receptor, há a translocação deste complexo para o núcleo onde ocore a ligação ao elemento responsivo ao estrógeno e a regulação da expressão de diferentes genes-alvo 67. Na vasculatura, a ação estrogênica afeta a expressão de genes envolvidos na síntese (*3). Atualmente pode ser encontrado o termo canônico e não canônico.

(30) 29. de proteínas que alteram o tônus vascular e que participam da resposta a injúria vascular e aterosclerose. Dentre estes genes, o da eNOS e 2 (COX-1 e COX-2). 70. 68; 69. , da prostaciclina sintase (PGI2S). modulada positivamente, enquanto os genes da endotelina. 60. , da ciclooxigenase-1. 71. têm sua expressão. , das MAPKs (mitogen-. activated protein kinase) 72 e da NADPH oxidase 27; 28 são regulados negativamente. O NO, além de um potente vasodilatador, é anti-agregante plaquetário e inibe a proliferação das células do músculo liso vascular, sendo que a redução deste componente em carótidas pode ser o fator determinante para a disfunção vascular neste vaso. O NO é produzido a partir da transformação da L-arginina em L-citrulina pela NO sintase (NOS). Três isoformas da NOS foram descritas: nNOS (NOS I – neuronal), iNOS (NOS II – induzível) e eNOS (NOS III – endotelial) 73.73. Além das isoformas da NOS, distintos mecanismos podem estar envolvidos na produção/biodisponibilidade do NO, tais como: a geração de principalmente o ânion superóxido. 59; 74. EROs,. , o aumento do cálcio intracelular ([Ca2+]i). ativação não genômica da via PI3K/fosfoquinase B (PKB/AKT). 76. 75. ,. e diminuição da. ADMA, inibidor endógeno da eNOS 77. O outro fator que pode ser modulado pelo estrógeno são eicosanóides, compostos biologicamente ativos de origem lipídica e derivados do ácido araquidônico e, neste grupo, estão incluídas(os) as prostaglandinas, o tromboxano, os leucotrinenos, as lipoxinas e os HETEs. A prostaciclina (PGI2) e o tromboxano (TXA2) são prostanóides essenciais para o sistema cardiovascular, pois atuam na manutenção do tônus de micro e macrovasos. A PGI2 é um importante vasodilatador e inibidor da agregação plaquetária, enquanto o TXA2 promove vasoconstrição e induz a agregação plaquetária, ou seja, possuem efeitos opostos. O desequilíbrio entre a produção.

(31) 30. desses prostanóides (vasoconstritor versus vasodilatador) está relacionado ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares 78. A formação desses prostanóides ocorre por meio da enzima ciclooxigenase (COX) que converte, por meio de uma reação de ciclooxigenação, o ácido araquidônico no metabólito instável PGG2 e posteriormente por meio da reação de peroxidação converte o PGG2 em PGH2, metabólito mais estável. 79. . Duas isoformas. da COX são conhecidas e denominadas COX-1 e COX-2. A COX-1 é uma enzima considerada constitutiva e está expressa em todo o organismo. 80; 81. e no sistema. cardiovascular está relacionada com a produção de prostanóides que promovem proteção. 82. . A COX-2 é considerada enzima induzível, pois sua expressão é. aumentada em áreas de inflamação e lesões ateroscleróticas. 80; 81. , entretanto já foi. observada sua expressão constitutivamente 80. Os metabólitos PGG2 e PGH2 são ainda metabolizados enzimaticamente para que haja a formação de prostanóides ativos. As prostaglandinas são metabolizadas pelas prostaciclina sintase (PGI2S) e tromboxano sintase (TXA2S), gerando assim os metabólitos PGI2 e TXA2, respectivamente (Figura 5) 78; 81..

(32) 31. Fosfolipídios de membrana FosfolipaseA2 Àcido araquidônico COX-1 COX-2 PGG2 peroxidação PGH2 PGI2S Prostaciclina (PGI2). TXA2S Tromboxano (TXA2). Figura 5- Esquema representativo da biossíntese de prostanóides. Adaptado de Hermenegildo et al. (2006) 78. Portanto, alterações em um ou mais desses componentes moleculares vasculares podem responder pelo aumento do índice de doenças cardiovasculares em mulheres na pós-menopausa e o tratamento com estrógeno pode ser ter efeitos positivos e/ou negativos por interferir com esses parâmetros..

(33) 32. 1.3. Envelhecimento. e. pós-menopausa:. associação. com. as. doenças. cardiovasculares O envelhecimento per se é considerado um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares por promover alterações estruturais e funcionais que levam à disfunção endotelial, rigidez e remodelamento arterial 83; 84. A senescência como um processo celular geneticamente programado foi descrito pela primeira vez por HAYFLICK et al. (1961). 85. em culturas de fibroblastos.. Os autores observaram que as células estudadas deixavam de se dividir após um número finito de duplicações populacionais, propondo assim a replicative senescence theory of ageing. De acordo com essa teoria, as células envelhecem perdendo sua capacidade de divisão e se acumulam nos tecidos durante todo o período de vida do organismo. Apesar dessa perda da capacidade de divisão, a célula continua biologicamente ativa e devido ao seu fenótipo alterado modifica sua função tecido-específico, podendo promover doenças associadas ao envelhecimento 86; 87. . A parada da divisão celular pode ocorrer por diferentes mecanismos e dentre. eles podemos citar o aumento na expressão de fatores que inibem a entrada na fase S (síntese) da divisão mitótica, momento em que ocorre a duplicação do DNA 86. Nas células vasculares, o aumento da geração de ânion superóxido é um dos principais. fatores. discutidos. que. promovem. a. disfunção. endotelial. no. envelhecimento, principalmente pela capacidade dessa espécie reativa de oxigênio em reduzir a biodisponibilidade de NO. 88; 89; 90. . Entretanto, vem sendo descrito. também que o desequilíbrio na produção de prostanóides pode ser outro fator para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares no envelhecimento. 78; 91; 92; 93. .. Durante anos os experimentos em modelos animais de pós-menopausa - fêmeas ovariectomizadas - foram realizados em animais jovens e com isso os resultados do.

(34) 33. efeito e as vias de sinalização do estrógeno na vasculatura podem ser distintos comparando-os com modelos de envelhecimento. O envelhecimento cronológico promove disfunção endotelial em modelos animais. 94; 95. e em humanos. 96. , entretanto atualmente o modelo murino de. senescência acelerada (SAMP) vem sendo associado às alterações vasculares similares ao envelhecimento cronológico, porém com características específicas de acordo a linhagem. Machos e fêmeas intactas SAMP apresentam disfunção endotelial em comparação com os animais resistentes à senescência-acelerada (SAMR)97;. 98. Em 1981 TAKEDA et al. (1981). 99. desenvolveram a linhagem de. camundongos SAMP (do inglês, senescence-accelerated mice prone – figura 6), considerado modelo de envelhecimento precoce, a partir do cruzamento da linhagem AKR/J, modelo murino para estudos de leucemia. A partir de observações apenas visuais, os autores constataram que dentro do mesmo grupo de AKR/J havia padrões diferentes de envelhecimento. Por isso, para confirmar a hipótese, os autores realizaram um score de envelhecimento que avaliava características como falta de brilho na pelagem, rugosidade da pele, lesões oftalmológicas e tempo de vida. A partir deste score, foi realizado o cruzamento entre machos e fêmeas que obtiveram score mais elevado e após cinco cruzamentos as características avaliadas mantiveram-se e passaram a se desenvolver mais precocemente, surgindo assim a linhagem SAMP. Dentre esses havia os animais que com a mesma faixa etária não desenvolviam envelhecimento precoce, score baixo, e por isso foram denominados “resistentes a senescência” (SAMR). Atualmente. foram. descritas. nove. linhagens. de. SAMP. (SAMP1/2/3/6/7/8/9/10/11) e três de SAMR (SAMR1/4/5). As linhagens foram.

(35) 34. caracterizadas de acordo com determinadas características em comum. Por exemplo, a linhagem SAMP8 é considerada modelo de déficit cognitivo, devido a alterações cerebrais semelhantes ao do Alzheimer. 100. , por isso é uma das linhagens. mais utilizadas neste tipo de estudo. Além disso, foi caracterizada também como modelo de envelhecimento vascular por apresentar aumento na vasoconstrição induzida por fenilefrina e U46619 e, além disso, redução na vasodilatação induzida por ACh 98; 101. As alterações vasculares observadas no envelhecimento, no modelo murino SAMP8, aparecem mais precocemente (6 meses), quando comparadas com aquelas em ratas SHR (16 meses). 102. e Wistar (20 meses). SAMP8 varia entre 10 e 18 meses. 104. 103. . A média de vida dos animais. , enquanto a dos SAMR1 entre 19-21 meses. (Ver Figura 6).. SAMP8 (8 meses). SAMR1 (8 meses) Figura 6 – Imagens ilustrativas de camundongos da linhagem SAMP. Esquerda: machos e fêmeas SAMP com 6, 11 e 18 meses; fonte: TAKEDA et al. (1981) 99. Direita: fêmeas SAMP8 e SAMR1 ovariectomizadas na idade de 8 meses..

(36) 35. 1.3.1 Splicing alternativo e a formação de novas proteínas funcionais do receptor de estrógeno Splicing é um processo pós-transcricional fisiológico em eucariotos no qual introns são removidos e os éxons são unidos em única determinada sequência, fazendo com que o pré-RNAm seja transcrito em RNAm maduro. 105; 106. . Por outro. lado, o processo de splicing alternativo é definido como um procedimento no qual moléculas idênticas de pré-RNAm são transcritas de distintas formas, gerando RNAm alternativos maduros e com isso a tradução de uma grande diversidade de proteínas. 107; 108; 109. que possuem estrutura, localização e função diferentes. 110. .. Como resultado final, pode ser observada alteração da atividade celular que desencadeariam anormalidades associadas a doenças como o câncer e do sistema cardiovascular. 106 Diversos splicing alternativos foram identificados para os receptores de estrógeno, principalmente do ERα-66kDa, sendo esses produzidos principalmente pela eliminação de determinados éxons ou uso alternativo de éxons terminais. 111. .O. ERα-36kDa é um splicing alternativo do receptor clássico de estrógeno, o ERα66kDa, identificado em células MCF-7, linhagem celular epitelial derivada de câncer mamário 112. O ERα-36kDa contém 283 aminoácidos e sua transcrição ocorre do éxon 2 ao 7 mais 27 aminoácidos residuais do último éxon (Figura 7), assim este splicing alternativo perde os domínios funcionais AF1 e AF2. 112. . A expressão desse receptor. foi descrita em diversos tipos de câncer e associado à ativação de vias de proliferação, invasão e migração celular, principalmente por via não transcricional 113; 114. ..

(37) C. ERα-46kDa Splicing alternativo. 528 552 595. 463. D. D. F. 457 484. 302. E. E. F 27aa específicos. C. D. 463 528 552 595. 302. 263. A/B. 174 180. ERα-36kDa Splicing alternativo. 302. 263. C. A/B. 174 180. ERα-66kDa Clássico. 263. 1. 180. 36. E. F. A/B Figura 7 - Esquema representativo dos domínios funcionais do receptor clássico de estrógeno, ERα66kDa, e os splicing alternativos ERα-36kDa e ERα-46kDa . Adaptado SOŁTYSIK et al. (2016) 113.. Tendo em vista que o tempo em que o tratamento com estrógeno é instaurado pode influenciar no resultado final do seu efeito sobre as alterações vasculares, a diferença de resultados quando modelos animais de pós-menopausa jovens ou velhos são utilizados e a ausência de mecanismos descritos na literatura que expliquem a ação do tratamento com estrógenos em modelo animal velho de pós-menopausa, se fazem necessário estudos que reúnam tais critérios, a fim de se elucidar com clareza o efeito do tratamento com estrógeno na pós-menopausa..

(38) 37. 2. OBJETIVO Avaliar os efeitos dos tratamentos com estrógeno iniciado precoce e tardiamente sobre a função de artérias carótidas e os respectivos mecanismos moleculares em camundongos fêmeas ovariectomizadas com senescênciaacelerada (SAMP8) e resistente à senescência-acelerada (SAMR1)..

(39) 38. 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais Foram utilizados camundongos fêmeas com senescência acelerada (SAMP8 – do inglês senescence-accelerated mice prone - 8) e a linhagem resistente à senescência acelerada (SAMR1 -. do inglês senescence-accelerated mouse. resistant - 1). Os animais foram criados e mantidos nos biotérios pertencentes à Faculdade. de Farmácia da. Universidade de. Barcelona. (Espanha). e do. Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da Universidade de São Paulo (USP). Em ambos, os animais foram mantidos em caixa de polipropileno em ambiente com temperatura controlada (~ 22 ºC), ciclo claro e escuro (12 h/12 h), umidade controlada (~ 60%) e acesso livre à alimentação e água. Os procedimentos experimentais realizados estão de acordo com os princípios éticos de experimentação animal e foram aprovados pelo “Comitè Ètic DÉxperimentacó Animal (CEEA), Universitat de Barcelona” (272/12) e pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do ICB-USP (nº 64; fls 20; livro 3; 27.05.2014). 3.2 Procedimento cirúrgico de remoção dos ovários (ovariectomia) Camundongos fêmeas com 24 semanas de idade (6 meses) foram anestesiadas com isoflurano (4% para indução e 1,5-2% para manutenção). Os pelos da região abdominal foram removidos e uma incisão de aproximadamente dois centímetros foi realizada no local. A partir desta incisão o útero foi exposto e os dois ovários removidos (ovariectomia). A incisão foi suturada e higienizada com álcool iodado 4%. As fêmeas ovariectomizadas foram denominadas OVX e permaneceram nesta condição por dois meses..

(40) 39. 3.3 Tratamentos com estrógeno iniciados precoce e tardiamente Fêmeas OVX foram tratadas com 17β-estradiol (Sigma-Aldrich) (dissolvido em óleo mineral) e injetado na dose de 5 µg/Kg por via subcutânea na região dorsal a cada três dias. A dose e o procedimento do tratamento foram obtidos a partir de estudos prévios realizados por NOVENSA et al. (2010)115. As fêmeas OVX foram divididas em três grupos experimentais, conforme descrito no item 3.4. Dos grupos experimentais, dois receberam o tratamento com 17β-estradiol iniciado em diferentes tempos. No primeiro grupo, o hormônio 17β-estradiol foi administrado imediatamente após o procedimento de ovariectomia e mantido durante 60 dias (grupo OVX-E2E). No segundo grupo, o tratamento foi iniciado 45 dias após o procedimento de ovariectomia e mantido durante 15 dias (grupo OVX-E2L) (Figura 8).. 6 mês. 8 mês. Grupos OVX OVX Dia 1. Submetidos à morte Dia 60 Submetidos à morte. OVX + tratamento precoce E2(E). E2(E). Dia 1. Dia 60. OVX. Tratamento tardio. Dia 1. Dia 45. Figura 8 - Esquema representativo do delineamento experimental. Submetidos à morte Dia 60.

(41) 40. 3.4 Grupos experimentais Os grupos foram constituídos conforme descrição abaixo: SAMR1-OVX - camundongos fêmeas resistentes à senescência-acelerada ovariectomizadas; SAMR1-OVX-E2(E) - camundongos fêmeas resistentes à senescênciaacelerada ovariectomizadas tratadas com estrógeno desde o primeiro dia de ovariectomia (tratamento precoce); SAMR1-OVX-E2(L) - camundongos fêmeas resistentes à senescênciaacelerada ovariectomizadas tratadas com estrógeno após 45 dias de ovariectomia (tratamento tardio); SAMP8-OVX. -. camundongos. fêmeas. com. senescência-acelerada. ovariectomizadas; SAMP8-OVX-E2(E) - camundongos fêmeas com senescência-acelerada ovariectomizadas tratadas com estrógeno desde o primeiro dia de ovariectomia (tratamento precoce); SAMP8-OVX-E2(L) - camundongos fêmeas com senescência-acelerada ovariectomizadas tratadas com estrógeno após 45 dias de ovariectomia (tratamento tardio).. 3.5 Avaliação da eficácia da ovariectomia. A eficácia da ovariectomia foi avaliada pela medida do peso do útero e da dosagem hormonal, parâmetros esses descritos em detalhes a seguir..

(42) 41. 3.5.1 Peso do útero Os animais foram anestesiados com pentobartibal sódico (50 mg/kg, intraperitonial) e submetidos à laparotomia. O útero foi removido e pesado imediatamente (peso úmido). Após a primeira pesagem, o útero foi colocado em estufa a 37 ºC por 24 horas e, ao término do período, pesado novamente (peso seco). Os resultados foram expressos em miligramas de útero por centímetro de tíbia (mg/cm). 3.5.2 Dosagem hormonal A concentração de 17β-estradiol foi determinada no plasma das fêmeas SAMR1 e SAMP8 dos três grupos experimentais utilizando-se o método de ELISA, seguindo instruções do fabricante do kit (Estradiol ELISA Kit, Cayman Chemical). Para isso, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg, i.p.), o sangue foi coletado pela veia cava inferior e colocado em tubos eppendorf® para centrifugação a 3000 g, 15 ºC, durante 15 minutos. O plasma foi separado e armazenado em freezer a -80 ºC. 3.6 Reatividade vascular As fêmeas foram anestesiadas com pentobarbital sódico (50 mg/Kg, i.p) e as artérias carótidas(*4) comuns esquerda e direita foram expostas, limpas in situ dos tecidos conectivos (adventícia e adiposo perivascular), removidas e mantidas em solução nutriente de Krebs-Henseleit gelado (composição em mM: NaCl 130; KCl 4,7; NaHCO3 14,9; CaCl2.2H2O 1,6; KH2PO4 1,18; MgSO4.7H2O 1,17; EDTA 0,026 e glicose 5,5). As carótidas foram então cortadas em segmentos de 2 mm e dois fios (*4) Foram utilizadas as carótidas comuns esquerda e direita, intercalando-as ao longo dos experimentos. Não foi observado diferença na vasoconstricção induzida por fenilefrina entre as carótidas esquerda e direita..

(43) 42. de tungstênio (40 μm de diâmetro) foram inseridos no lúmen das artérias e fixados em um miógrafo para vasos sanguíneos para o estudo de tensão isométrica. O miógrafo foi conectado a um sistema de aquisição de dados (PowerLab / 7SP, ADinstruments, Austrália). Com as carótidas montadas no sistema, iniciaram-se os procedimentos padrões para o estudo de reatividade vascular que consistiram em: período de estabilização, normalização da tensão basal e avaliação da integridade funcional do músculo liso e do endotélio. A avaliação da integridade do músculo liso consistiu na verificação da contração induzida por KCl 50 mM pelo período de 15 minutos (repetida três vezes); entre as aplicações de KCl foram realizadas lavagens até a tensão do vaso voltar ao basal. A concentração de KCl foi definida por meio de estudos prévios de padronização utilizando carótida comum. A avaliação do endotélio consistiu na verificação do relaxamento induzido por acetilcolina (ACh) 10-6 M a partir da pré-contração com fenilefrina (Phe) 10-5 M. Para a normalização as carótidas comuns foram distendidas gradativamente e a leitura do micrômetro e da força aplicada foram registradas a cada ponto. Estes dados foram convertidos em valores de circunferência interna (µm) e da tensão na parede vascular (mN). A plotagem da tensão na parede do vaso versus a circunferência interna gera uma curva exponencial e aplica-se a curva isobárica correspondente a 100 mmHg, sendo o ponto de intersecção denominado IC100. A partir da fórmula: IC1= 0,90 x IC100, encontra-se o valor de IC1, que corresponde à circunferência interna. O diâmetro interno normalizado foi calculado dividindo-se IC1 por π (3,14),. 116. . Após o controle da integridade funcional do vaso sanguíneo foram. realizadas curvas concentração-resposta cumulativas para agentes vasodilatadores e vasoconstritores. Foram utilizados U46619 (análogo do tromboxano TXA2) e Phe.

(44) 43. (agonista α-1 adrenérgico) como vasoconstritores, ACh (agonista muscarínico) como vasodilatador dependente do endotélio e nitroprussiato de sódio. (NPS) como. doador de NO. As concentrações foram aplicadas de maneira crescente (10-9 M a 3 x 10-5 M). Os resultados para as curvas concentração-resposta cumulativas aos agentes vasoconstritores foram expressos em porcentagem em relação à contração induzida pelo. KCl 50 mM. Para as curvas concentração-resposta aos agentes. vasodilatadores, os anéis de carótidas comuns foram pré-contraídos com U46619 na concentração capaz de induzir 50% da resposta máxima e os resultados foram expressos em porcentagem de relaxamento a partir da contração obtida com U46619 183. As curvas concentração-resposta cumulativas à Phe foram realizadas na ausência ou na presença de: L-NAME (10-4 M), inibidor da NO sintase (NOS); indometacina (10-5 M), inibidor não seletivo da COX; tempol (10-4 M), mimético da superóxido dismutase (SOD); SC560, inibidor seletivo da COX-1 (10-6 M); NS398, inibidor seletivo da COX-2 (10-5 M). Todos os inibidores/miméticos foram adicionados às cubas 30 minutos antes do início das curvas concentração-resposta e mantidos durante todo o protocolo experimental.. Para comparação entre os grupos foi. utilizado área sob a curva (AUC) como método de análise. O Log2 foi utilizado para comparar os efeitos dos inibidores/mimético sobre a contração à Phe. 3.7 Expressão do RNAm por reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real As carótidas comuns utilizadas para o experimento foram limpas dos tecidos conectivos (adventícia e adiposo perivascular) in situ, removidas, congeladas imediatamente em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer a -80 ºC..

(45) 44. Para extração do RNA foi adicionado aproximadamente 20 mg de tecido (carótidas comuns esquerda e direita) a 500 µL de Trizol (Invitrogen, CO.,EUA). As amostras foram pulverizados em Bullet Blender (Next Advance, Barcelona, Espanha) na velocidade de 8 rpm pelo período de 4 minutos (quando necessário esse período foi ajustado para 8 minutos). A seguir, foi adicionado ao macerado de tecido 200 µL de clorofórmico e a solução foi centrifugada a 12000 g por 15 minutos para separação do conteúdo em três partes: RNA, DNA e proteína.. O RNA total. encontrado no sobrenadante após a centrifugação foi submetido à digestão do DNA remanescente. A síntese da fita simples de DNA complementar (cDNA) (reação de transcrição reversa - RT) foi realizada utilizando-se a enzima MMLV (MultiScribeTM, Applied Biosystems) a partir de 500 ng de RNA total e, durante esse processo, adicionou-se inibidores de RNAse para proteger o RNA. A reação de PCR em tempo real foi realizada num volume final de 10 µL, contendo os oligonucleotídeos específicos conforme descrito abaixo(*5), utilizando o reagente Platinum SYBR green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) e o sistema ViiA7 (Applied Biosystems). A reação de PCR foi realizada nas seguintes condições: 2 minutos a 95 oC, seguidos por 45 ciclos a 95 oC por 15 segundos, 60 oC por 15 segundos e 72 oC por 1 minuto. A especificidade da reação com SYBR green foi confirmada pela análise da curva de dissociação utilizando a temperatura de dissociação - melting point. A expressão do RNAm foi normalizada pela expressão do RNAm de GAPDH e quantificada utilizando o cálculo do 2-Ct (Ct: cycle threshold) 117. (*5) eNOS (NM_008713.4) F: 5´TGTCACTATGGCAACCAGCGT3´ R: GCGCAATGTGAGTCCGAAAA COX1 (NM_008969.3) F: 5` GAGCCGTGAGATGGGTGGGAGGG3′ R: TGGATGTGCAATGCCAACGGCT COX2 (NM_011198.3) F: 5´ GTCAGGACTCTGCTCACGAAGGAAC3` R: ACAGCTCGGAAGAGCATCGCAG PGI2S ( NM_008968.3) F:5ĆGGCTACCTGACCCTATATGGA3´ R: GCCTGGCCCACAATTTCAAT TXA2S (NM_011539.3) F: 5ÁAAGGAACCACCCCAAAGGT3´ R: ACACGATCTTGGGCCTGACT ERα (NM_007956.4) F: 5`TGCCTGGCTGGAGATTCTG3´ R: CTTCCCCGGGTGTTCCAT ERα36kDa (AB560752.1) F: 5´ TGCCTGGCTGGAGATTCTG3´R: CTTCCCCGGGTGTTCCAT.