Grupo controle (CN); Periodontite apical (PA); Dieta Hiperlipídica (DHLPA); Dieta Hiperlipídica com PA (DHLPA); CN com MEL (CNME); PA com MEL (PAMEL); DHL com MEL (DHLMEL); DHL com PA e MEL (DHLPAMEL). Valores expressos como média ± EPM (p<0.05) n= 10, letras diferentes indicam diferença estatística entre grupos
Figura 23 - Fotomicrografias em campo claro evidenciando a região periapical dos primeiros molares inferiores nos respectivos aumentos 50x e 100X (‘) dos grupos controle (A e A’), Dieta hiperlipídica ( B e B’), Controle tratado com melatonina ( C e C’), Dieta
hiperlipídica tratado com melatonina (D e D’), Periodontite apical tratado (E e E’), Dieta hiperlipídica com Periodontite apical (F e F’), Periodontite apical tratado com melatonina (G e G’), Dieta hiperlipídica com periodontite apical e tratado com melatonina (H e H’). PD, polpa dentária; D, dentina; OA, osso alveolar; C, cemento; LP, ligamento periodontal; RN, restos necróticos; *infiltrado inflamatório
5 DISCUSSÃO
Nossos resultados demonstraram : 1) ao final do experimento os grupos alimentados com DHL apresentaram diminuição da massa corpórea a partir da 4ª semana de avaliação; menor ingestão hídrica e alimentar da 1ª a 15 semana de avaliação em relação ao grupos com dieta padrão; todos grupos com DHL apresentaram maior ingestão energética da 1ª a 7ª semana e da 9ª a 15ª semana de avaliação quando comparados aos grupos alimentados com dieta padrão; 2) os grupos DHL e DHLPA apresentaram aumento do peso absoluto do tecido adiposo periepididimal (TAB) e o tratamento com MEL reverteu essa alteração; 3) todos os grupos com dieta hiperlipídica apresentaram diminuição do peso MG; 4) os grupos DHL e DHLPA apresentaram aumento da glicemia; o grupo DHLPA, aumento da insulinemia;
PA, DHL e DHLPA demonstraram aumento de resistência insulínica (HOMA-IR) e o tratamento com MEL reverteu todas essas alterações nos grupos apresentados anteriormente; 5) no perfil lipídico: os grupos DHL e DHLPA apresentaram aumento de LDL e diminuição de HDL, o tratamento com MEL reverteu estas alterações; 6) citocinas: os grupos PA, DHL e DHLPA mostraram aumento do TNF-α, e a MEL reverteu isso; 7) não houve alterações nos níveis de IL-6 plasmáticos; 8) houve aumento de IL-1B nos grupos DHL e DHLPA, o tratamento com MEL reverteu somente no grupos DHLMEL; 9) houve aumento de LPS nos grupos DHL e DHLPA, o tratamento com MEL reverteu isso; 10) expressão gênica e proteica: houve aumento das expressão proteica de IRF-3 nos grupos PA, DHL e DHLPA no MG, e o tratamento com MEL reverteu essa alteração somente nos grupos PAME e DHLMEL; não houve alteração da expressão proteínas TLR-4, Myd88, TRIF e NFkB; 11) não houve alterações na expressão gênica de todas proteínas avaliadas entre os grupos; 12) estresse oxidativo: a atividade da GSH diminuiu em todos os grupos experimentais, e a ME aumentou esse parâmetro apenas nos grupos CNMEL e PAMEL; a FRAP não se alterou entre os grupos, mas o tratamento com ME aumentou sua atividade nos grupos PAMEL e DHLMEL; a MEL aumentou a SOD nos grupos PAME. Não houve alterações na atividade de Gpx e CAT. A PC aumentou em todos os grupos DHL e a MEL reverteu isso; TBARS aumentou nos grupos PA e DHLPA, e a MEL reverteu apenas no grupo DHLPAMEL;
O modelo de dieta hiperlipídica (DHL) utilizado no presente estudo não resultou em aumento do peso corpóreo dos animais, quando comparados aos grupos alimentados com dieta padrão. Esses resultados estão de acordo com o estudo de Ramalho et al., (2017) que também não observou alterações no peso frente a uma DHL. Por outro lado, outras pesquisas demonstraram aumento no peso corporal dos animais utilizando-se DHL (SAMPEY et al., 2011; HOLMES et al., 2015; MARQUES et al., 2016).
Os grupos alimentados com DHL apresentaram uma menor ingestão alimentar em relação aos grupos com dieta convencional. De uma maneira geral, as gorduras afetam a saciedade e parecem regular o apetite por meio de vários mecanismos, incluindo a liberação de hormônios do apetite e a inibição do esvaziamento gástrico e do trânsito intestinal (SAMRA, 2010). A expressão de grelina, por exemplo, no estômago de ratos, diminui em resposta a uma dieta rica em gorduras, regula positivamente vários sinais de saciedade, como leptina, insulina, peptídeo semelhante ao glucagon 1; tais efeitos que podem servir para restringir a hiperfagia induzida por dietas ricas em gordura tal como utilizada no presente estudo (ERLANSON-ALBERTSSON, 2005). Além disso, estudos em animais e seres humanos mostraram que dietas com alto teor lipídico aumentam a secreção de colecistoquinina, um hormônio envolvido no processo de saciedade (GAIVA et al., 2001). Naznin et al., (2015) demonstrou que uma HFD de 12 semanas diminui a grelina plasmática e o mRNA de enzima grelina O-aciltransferase no estômago e a expressão do mRNA do secretagogo de GHSR hipotalâmico de camundongos, refletindo uma supressão do eixo neuroendócrino da grelina.
A alta ingestão inicial de gordura, provavelmente reflete sua palatabilidade.
No entanto, a ingestão persistentemente de gordura, mesmo quando a necessidade energética é excedida, pode ser devido a outros fatores, como por exemplo: a gordura dietética prejudica a detecção oral e intestinal de nutrientes, o que reduz a detecção de ingestão excessiva de gordura, levando à insensibilidade à insulina (MARTIRE et al., 2013).
Os grupos com dieta hiperlipídica apresentaram uma ingestão calórica (Kcal/g) maior em relação aos grupos alimentados com dieta padrão. Entretanto, isso não se traduziu em aumento de peso corpóreo, apresentando diminuição no peso do tecido muscular gastrocnêmico e aumento do tecido adiposo periepididimal. É
indiscutível que o consumo excessivo crônico de energia na ausência de atividade física leva ao ganho de peso e excesso de gordura intra-abdominal, fatores que predispõem fortemente à resistência à insulina e, consequentemente, ao desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (WEICKERT, 2012). Dietas ricas em gordura tendem a estar associadas à resistência à insulina, particularmente no que se refere à gordura saturada e aos ácidos graxos trans. A composição de ácidos graxos desempenha um papel no desenvolvimento da resistência à insulina em longo prazo, por meio da alteração na composição dos lipídios da membrana (WILCOX, 2005). A hipótese alternativa é que a resistência à insulina e a hiperinsulinemia são uma consequência do aumento da ingestão de energia e do ganho de peso. A ingestão habitualmente maior de energia pode induzir a obesidade e, portanto, a resistência à insulina, e potencialmente condicionar o pâncreas a ter uma maior capacidade secretora de insulina para manter a normoglicemia. Maior secreção de insulina, por sua vez, pode promover a deposição mediada de insulina da energia consumida na forma de tecido adiposo, o que leva ao desenvolvimento de um grau ainda maior de resistência à insulina muscular (HAN et al., 2008).
A falta de ação da insulina é caracterizada por intensa proteólise, o que pode explicar a redução no peso do músculo gastrocnêmico. Alterações na atividade de diferentes vias proteolíticas no músculo esquelético são observadas em ratos diabéticos induzidos por streptozotocina. Sabe-se que o tecido adiposo pode modular o metabolismo da glicose regulando os níveis de ácidos graxos na circulação por meio da secreção de adipocinas. A circulação aumentada de ácidos graxos livres (AGL) pode prejudicar a sensibilidade à insulina no músculo, inibindo o Substratos do Receptor de Insulina e o fosfoinositídeo 3-quinase (IRS/PI3), o que resultaria na redução da translocação de GLUT4 para a membrana plasmática. Além disso, os AGL pode aumentar a fosforilação da serina da proteína IRS e, assim, prejudicar a transdução do sinal de insulina (MAGALHÃES et al., 2019). Essas alterações metabólicas associadas aos resultados obtidos podem ser evidenciadas pela diminuição da sensibilidade à insulina e baixo peso do tecido musculo gastrocnêmico nos grupos alimentados com dieta hiperlipídica.
Interessantemente no estudo de Farias et al., (2019) observaram também que a DHL em camundongos resultou no aumento dos depósitos de gorduras na região inguinal, epididimal, retroperitoneal e no depósito adiposo marrom
interescapular. Da mesma forma, Diz-Urbina et al.,(2018) constataram que ratos Wistar alimentados com DHL apresentaram maior acúmulo de tecido adiposo nas regiões gonadais, retroabdominal e visceral sem aumento no peso corporal, quando comparados ao grupos da dieta convencional.
Conforme já mencionado, as disfunções no tecido adiposo branco são, certamente uma das principais causas de comorbidades médicas associadas à obesidade, uma vez que esse tecido é um dos primeiros a desenvolver respostas inflamatórias, desencadeando a ativação das vias pró-inflamatórias clássicas, aumento exacerbado de macrófagos, neutrófilos, linfócitos e uma indução de uma gama de secreção de mediadores pró-inflamatórios (DE FARIAS et al., 2019). Essas respostas inflamatórias podem ocasionar resistência à insulina (WONDMKUN, 2020).
O acúmulo de gordura visceral está associado à resistência à insulina devido a vários fatores: 1) aumento de secreção de adipocinas, como a resistina, ou diminuição de adiponectina que podem prejudicar a sensibilidade à insulina; 2) outra possibilidade é que o acúmulo de gordura visceral seja um indicador substituto do acúmulo lipídico ectópico e da lipotoxicidade, que ocorrem paralelamente no fígado e nos músculos, causando resistência à insulina nesses tecidos; 3) o acúmulo excessivo de lipídios no tecido adiposo visceral promove aumento de macrófagos que liberam citocinas inflamatórias, levando a lipotoxicidade nos tecidos periféricos, prejudicando a sensibilidade à insulina (HARDY et al., 2012).
Sabe-se que a ingestão de proteínas é um dos fatores determinantes para a sede (GUILMAIN et al., 1956). Os animais que receberam a dieta rica em gordura e com menor teor de proteínas apresentaram menor ingestão hídrica em relação aos grupos alimentados com dieta padrão. Esses achados corroboram os estudos de (GUILMAIN et al., 1956; RAMALHO et al., 2017), os quais evidenciaram menor ingestão hídrica em animais submetidos a ingestão de alimentos ricos em gordura.
No presente estudo, a indução da PA não ocasionou alterações na massa corpórea, na ingestão alimentar e hídrica. Esses resultados estão de acordo com os estudos de Kramer et al.,(2012) e Pereira et al., (2017), os quais também observaram inalterações nesses parâmetros entre os animais com PA e animais controle.
No presente estudo foi constatado hiperinsulinemia no grupo DHLPA e resistência à insulina nos grupos PA, DHL e DHLPA. Os mecanismos envolvidos na
ligação entre PA e resistência à insulina não estão totalmente esclarecidos. Contudo, estudos sugerem que citocinas pró-inflamatórias, como por exemplo, o TNF-α podem inibir a transdução do sinal insulínico (COLOMBO et al., 2012; ASTOLPHI et al., 2013) e diminuir a expressão do transportador de glicose GLUT4 e outras moléculas envolvidas na via da insulina (UYSAL et al., 1997; MINGRONE et al., 2002). Estudos recentes do nosso laboratório em ratos comprovaram que a periodontite apical promove aumento de TNF-α e alterações na etapa inicial do sinal insulínico e resistência à insulina, como também aumento na infiltração de macrófagos e ativação de vias inflamatórias no tecido muscular esquelético (ASTOLPHI et al., 2015;
PEREIRA et al., 2017; TSOSURA et al., 2019), evidenciando que uma inflamação local pode induzir efeitos sistêmicos.
Estudos em modelos animais vem demonstrando que a obesidade/excesso de peso pode influenciar a patogênese da doença periodontal levando a uma maior perda óssea alveolar (VERZELETTI et al., 2012; CAVAGNI et al., 2013; ZUZA et al., 2018; YU et al., 2019). Os mecanismos pelos quais a obesidade possa afetar o periodonto não estão totalmente elucidadas, mas o que se sabe é que a obesidade desencadeia diversos efeitos biológicos, como por exemplo, o aumento de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1β, IL-6 e TNF-α, adipocinas, como resistina, e espécies reativas de oxigênio que podem afetar diretamente os tecidos periodontais (DAHIYA et al., 2012; MOURA-GREC et al., 2014).
O papel fisiológico da IL-6 vem sendo estudado principalmente no contexto da resposta inflamatória de fase aguda, embora haja evidências de que a IL-6 também desempenha um papel central na patogênese de doenças crônicas (MAGGIO et al., 2006). Entretanto, em nossos estudos não observamos alterações dessa citocina entre os grupos avaliados.
Por outro lado, Becerik et al., (2012) estudando outro modelo de estudo de doença oral, como a periodontite, observaram, no fluido gengival crevicular de pacientes, aumento nos níveis de IL-1β, IL-6 e IL-11 nas formas crônicas e agressivas de periodontite quando comparados aos pacientes saudáveis. Da mesma forma, Takahashi et al.,(1994) não identificaram diferenças significativas nos níveis séricos de IL-6 entre pacientes com periodontite e indivíduos saudáveis, embora a expressão dessas citocinas estava aumentada nos tecidos gengivais dos indivíduos com
periodontite, inferindo que a IL-6 produzida no tecido gengival não reflete os níveis de IL-6 no plasma.
Atualmente, entende-se que o tecido adiposo, além de sua função de armazenar reservas de energia na forma de triglicerídeos, é um órgão endócrino capaz de produzir diversos hormônios e moléculas sinalizadoras, conhecidas como adipocinas. IL-6, IL-8 e TNF-α, secretados pelo tecido adiposo, são moléculas com função pró-inflamatória e encontradas em altas concentrações em obesos (FEITOSA et al., 2013). Feitosa et al., (2013) avaliaram os níveis plasmáticos de IL-6 e TNF-α em mulheres obesas e saudáveis entre 20 e 50 anos de idade. Em relação aos níveis de Il-6, não houve aumento significativo. Entretanto, as concentrações plasmáticas de TNF-α nas mulheres obesas foram maiores do que no grupo controle.
O TNF-α é uma proteína derivada de monócitos, que possui uma ampla gama de efeitos pró-inflamatórios e imunomoduladores em várias populações celulares diferentes. O TNF-α é uma citocina que estimula a reabsorção óssea, a síntese de prostaglandinas e a produção de proteases por muitos tipos de células, incluindo fibroblastos e osteoblastos. A superprodução ou expressão inadequada de TNF-α pode levar a uma variedade de condições patológicas. A produção local de PGE 2 , IL1-β e TNF-α foi demonstrada em lesões periapicais (PEZELJ-RIBARIĆ et al., 2007). Nesse estudo foi constatado aumento de TNF-α plasmático nos grupos com PA ou DHL (PA, DHL e DHLPA). Corroborando esses dados, Wu et al., (2016) evidenciaram aumento nos níveis séricos do TNF-α em ratos com obesidade e resistentes à obesidade. Além disso, Pezelj-Ribarić et al., (2007) avaliaram os níveis de TNF-α em exsudatos de tecido peripical de dentes com PA e demonstraram concentrações mais altas desta citocina em lesões periapicais com grandes áreas radiolúcidas, enquanto esses níveis foram significativamente menores nas lesões periapicais com áreas radiolúcidas menores.
Além do TNF-α, a IL-1β também participa da inflamação, regulação imunológica e reabsorção óssea na periodontite. Os achados clínicos fornecem fortes evidências sobre seu significado. Os efeitos biológicos da IL-1β dependem de sua concentração tecidual, que é elevada na periodontite. Níveis aumentados de IL-1β são frequentemente detectados na saliva e fluido crevicular gengival (GCF) de pacientes com periodontite em comparação com controles saudáveis (CHENG et al., 2020).
Trøseid et al.,(2013) têm sugerido que o tipo de dieta consumida, especialmente dietas ricas em gordura, pode contribuir para a endotoxemia, que é causada por níveis elevados de LPS no plasma sanguíneo. Nossos resultados demonstraram aumento de LPS em grupos alimentados com dieta rica em gordura (grupos DHL e DHLPA). O LPS é detectado em baixas concentrações no plasma de pessoas saudáveis (entre 1 e 55 pg/ml) (TRØSEID et al., 2013). A relevância biológica de baixos níveis circulantes de LPS podem estar relacionados à modulação imune.
Os níveis de mediadores produzidos pelas células ativadas determinam diversos efeitos benéficos, como resistência a infecções, ou efeitos negativos, como aumento da inflamação (MOREIRA et al., 2012).
Por outro lado, a exposição crônica e sistêmica a níveis levemente aumentados de LPS é relevante para a manifestação de muitas doenças porque induz uma resposta imune e ativa, vias de sinalização, que culminam com um estado inflamatório subclínico, inibindo sinalização insulínica e levando à resistência à insulina. A administração crônica de doses muito baixas de LPS em camundongos do tipo selvagem resulta no desenvolvimento de inflamação subclínica, que é seguida por aumento no peso corporal e hepático, aumento no tecido adiposo subcutâneo e visceral e aumento nos níveis de glicose no sangue em jejum e pós-prandial. Em seres humanos, a administração aguda de LPS perturba a sensibilidade à insulina (MOREIRA et al., 2012).
Estudos indicam que bactérias patogênicas periodontais, como Porphyromonas gingivalis desencadeiam o início e a duração da periodontite crônica.
P. gingivalis é uma bactéria anaeróbica gram-negativa pertencente ao complexo vermelho socransky mais comum na periodontite crônica e apical (GÖLZ et al., 2014;
LEE et al., 2017). O LPS, localizado na membrana externa de bactérias Gram-negativas, é o principal fator patogênico de P. gingivalis pode estimular continuamente células imunes do hospedeiro, especificamente monócitos e macrófagos. A estimulação contínua resulta na liberação de um grande número de substâncias bioativas, como enzimas lisossômicas, espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico, ocasionando danos celulares, apoptose e, finalmente, inflamação (ZHANG et al., 2018). Além disso, o LPS pode estimular a secreção de citocinas, incluindo IL-1β e o TNF-α (WU et al., 2021). Esses resultados também foram evidenciados no presente estudo.
A maior inflamação observada em indivíduos com doenças metabólicas pode ser consequência da produção excessiva de mediadores por células imunes estimuladas por LPS. De uma maneira geral, a resposta do hospedeiro frente ao LPS é o seu reconhecimento pelo Toll-like receptor-4 (TLR4), o que leva à ativação de vias de sinalização, como a oligomerização do interferon-β indutor do adaptador (TRIF) e do gene de resposta primária de diferenciação mieloide 88 (MyD88), promovendo, pois, a ativação de vias de sinalização a jusante, como NF-kB e a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), que estão relacionadas à inflamação. A translocação de NF-kB para o núcleo promove a ativação de genes que codificam proteínas envolvidos na resposta inflamatória, como TNF-α e IL-6 (MOREIRA et al., 2012).
De fato, o TLR4, que é ativado por LPS bacteriano, está ligado a vias dependentes e independentes de MyD88. A primeira via é essencial para a ativação do NF-κB, enquanto a última está envolvida na ativação do IRF-3 e na indução do gene do interferon (IFN)-β (SAKAGUCHI et al., 2003). Nos resultados do presente estudo, não foram observadas alterações na expressão proteica de TLR4 e sua via de sinalização analisadas (MyD88, TRIF e NFkB), com exceção do IRF-3 que apresentou aumento na expressão proteica nos grupos com PA, DHL e DHLPA.
O IRF-3 encontra-se no citoplasma, pode ser ativado via sinalização TLR3 ou TLR4 ou outros TLRs que recrutam TRIF/TICAM-1, ativando kinases quinase-1 de ligação a TANK (TBK1) e kinase-ε IκB (IKKε) que fosforilam e ativam IRF-3, em resíduos de serina/treonina dentro da sequência autoinibitória carboxil-terminal, e isso promove a translocação IRF-3 para o núcleo (SAKAGUCHI et al., 2003). O IRF-3 é um importante fator de resposta celular à infecção viral, mediando a indução transcricional de IFNs, bem como de outras quimiocinas e citocinas. Da mesma forma, a ativação de IRF3 está envolvida na mediação de respostas transcricionais adequadas para componentes bacterianos. A ativação transcricional mediada por LPS via IRF3 requer o p38 (proteína quinase ativada por estresse) e envolve a fosforilação de resíduos de serina, localizados em dois agrupamentos no terminal C da proteína IRF-3 (DANG et al., 2004).
Sakaguchi et al., (2003), utilizando camundongos deficientes para IRF-3, demonstraram que esta proteína é realmente essencial para a indução do gene IFN- β mediado por LPS e que a perda de IRF-3 também afetou a expressão do perfil de
outros genes de citocinas (TNF-α, IL1-β, IL-6 e 15 e IP-10). Além disso, camundongos deficientes em IRF-3 mostram resistência ao choque de endotoxina induzido por LPS.
Apesar da extensa análise da via de sinalização do TLR e ativação do IRF-3, o papel do IRF-3 para as respostas do LPS in vitro e in vivo não está totalmente elucidada, mas parece que o IRF-3 participa como uma molécula central para a sinalização LPS/TLR4 (SAKAGUCHI et al., 2003).
Embora estudos anteriores tenham mostrado que o DHL pode alterar a expressão do gene TLR4 (SAKAGUCHI et al., 2003; KUMARI et al., 2016), o modelo experimental de DHL utilizado neste estudo não afetou a expressão do gene do TLR4 e sua via de sinalização.
O efeito da deficiência de TLR4 na proteção da resistência à insulina induzida por HFD em 16 semanas de experimentação foi relatado por (SHI et al., 2006;
SABERI et al., 2009) como sendo devido à redução da expressão gênica inflamatória no fígado e na gordura. Por outro lado, em estudo conduzido por Lee et al., (2015) em camundongos “knockout” de Toll-like receptor 4 (TLR4KO) alimentados com DHL, demonstraram que a falta de TLR4 pode proteger os camundongos da resistência à insulina, mas eventualmente o peso excessivo dos camundongos TLR4KO induz distúrbios metabólicos sistêmicos comointolerância à glicose e resistência à insulina por meio de outras vias de sinalização, como RAGE e TLR2.
O consumo de dietas hipercalóricas em conjunto ao sedentarismo tem sido associado à geração de um excesso de ROS, particularmente ânion superóxido através da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, e ao desenvolvimento de múltiplos distúrbios metabólicos como obesidade, hipertensão hiperglicemia, hiperinsulinemia (MÉNDEZ et al., 2014).
Com relação aos parâmetros de estresse oxidativo, observamos que os grupos PA, DHL e DHLPA apresentaram diminuição na defesa antioxidante não enzimática evidenciados pelos baixos níveis de GSH. A FRAP não se alterou entre os grupos. Já a defesa antioxidante enzimática, avaliada pela SOD, CAT e Gpx, não apresentou diferenças entre os grupos avaliados. Constatou-se elevação dos marcadores de dano oxidativo, tais como: aumento da carbonilação de proteínas nos grupos DHL e DHLPA, e aumento das concentrações de TBARS nos grupos PA e DHLPA.
As dietas ricas em gorduras estão intimamente ligadas ao aumento do estresse oxidativo, peroxidação lipídica, proteica e inflamação (TAN;NORHAIZAN, 2019). A peroxidação lipídica é o processo no qual radicais livres (ROS, RNS) atacam as ligações duplas carbono-carbono nos lipídeos, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio de um carbono e a inserção de uma molécula de oxigênio.
Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo radicais peroxil lipídico e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal como produtos secundários predominantes (DE-LEON;BORGES, 2020).
Na literatura existem diversos modelos experimentais de dieta hiperlipídica que reforçam seus efeitos deletérios como, por exemplo, o aumento da peroxidação lipídica em: plasma, (SRIPRADHA et al., 2021), fígado (DEMORI et al., 2006), músculo (AMER et al., 2020), tecido adiposo (KAHRAMAN et al., 2018). Da mesma forma, estudos clínicos na área de odontologia vêm demonstrando que pacientes com periodontite crônica apresentaram níveis de peroxidação lipídica aumentadas (BALTACIOĞLU et al., 2008; AMBATI et al., 2017). Foi confirmado que a periodontite está associada a uma hiperatividade dos neutrófilos do sangue periférico, que deveriam ser a fonte predominante de ROS. Estudos recentes sugerem que a hiperatividade dos neutrófilos é, provavelmente uma reação imune do hospedeiro à inflamação da periodontite (WANG et al., 2017). Nossos resultados estão de acordo com esses trabalhos, e constatamos aumento das concentrações de TBARS nos grupos PA e DHLPA no tecido muscular gastrocnêmico.
Da mesma forma que a peroxidação lipídica, a carbonilação das proteínas (PC) é um biomarcador mais comum de dano oxidativo às proteínas que pode ser induzida pelas ERO’s (BARREIRO;HUSSAIN, 2010; MÉNDEZ et al., 2014). A associação entre o estado periodontal e os níveis de PC foi investigada na saliva (SCULLEY;LANGLEY-EVANS, 2003), fluido gengival crevicular e soro (BALTACIOĞLU et al., 2008), demonstrando que níveis mais elevados de PC estão associados a um pior estado periodontal. Nossos resultados estão de acordo com esses trabalhos citados e constatamos aumento da carbonilação das proteínas nos grupos DHL e DHLPA.
A redução da atividade sérica de SOD é bem característico da síndrome metabólica. O estudo de Yokota et al., (2013) demonstrou que pacientes com
síndrome metabólica apresentaram os produtos de peroxidação lipídica sistêmica significativamente mais elevadas e a capacidade de defesa antioxidante diminuída, incluindo tióis totais séricos e atividade SOD em comparação com indivíduos saudáveis com idade, sexo e atividade correspondentes, indicando aumento do estresse oxidativo sistêmico. Por outro lado, Furukawa et al., (2004) observaram que, embora a expressão e a atividade de Cu/ZnSOD (umas das duas isoformas da SOD) estava reduzida no tecido adiposo branco de camundongos com obesidade grave, nenhuma alteração foi encontrada no músculo esquelético; além disso a peroxidação lipídica estava acentuadamente elevada no tecido adiposo branco (avaliada pelas concentrações de TBARS), nos camundongos de 7 e 13 semanas de idade em comparação com camundongos C57BL. Em contraste, os níveis de peroxidação lipídica no fígado e músculo esquelético foram semelhantes entre camundongos KKAy e C57BL / 6 com 7 e 13 semanas de idade.
Um dos principais antioxidantes endógenos no corpo humano é a glutationa, que é considerada o antioxidante endógeno mais abundante. A GSH tem muitas funções, incluindo a proteção das células contra danos oxidativos e a eliminação de radicais livres e peróxidos produzidos durante a respiração celular regular (SILVA et al., 2018). Sripradha et al., (2021) demonstraram que animais alimentados com DHL apresentaram níveis plasmáticos de GSH diminuídos. Andrich et al., (2019) identificaram uma diminuição nos níveis de GSH no músculo sóleo e um aumento na expressão gênica de IL-6 em ratos alimentados com DHL. Os autores sugerem que a DHL promove um aumento da expressão de IL-6, que é estimulada por um aumento na atividade de C/EBPβ e PPARγ, que regula positivamente as proteínas pró-inflamatórias ANGPTL4, CIDEA e FATP1. Por sua vez, a IL-6 aumenta a expressão de PTX3 e promove o catabolismo da cisteína, o que reduz os níveis de GSH. Em contraste, no presente estudo, não foi observada diferença na concentração plasmática de IL-6 entre os grupos. Neste estudo foi constatado diminuição dos níveis de GSH no MG nos grupos PA, DHL e DHLPA. Embora a literatura aponte a IL-6 como possível modulador dos níveis de GSH, neste estudo não foi observada alterações na concentração de IL-6 avaliadas no plasma.
Embora os dados desta pesquisa não tenham apresentado alterações nos níveis circulantes de IL-6, as ações desta citocina nos processos inflamatórios são contraditórias. Em modelos experimentais de inflamação crônica, como artrite
induzida por colágeno (ALONZI et al., 1998) e colite murina (YAMAMOTO et al., 2000), a IL-6 atua como agente pró-inflamatório, enquanto em modelos de inflamação aguda a IL-6 exibe um papel anti-inflamatório (XING et al., 1998). Por outro lado, níveis elevados de IL-6 são frequentemente observados em pacientes com doenças inflamatórias crônicas, como por exemplo a artrite reumatoide (CHUNG et al., 2011).
Diferentes estudos observacionais em humanos sugerem que a ingestão de gordura saturada aumenta o risco doença periodontal (GOLPASAND et al., 2014;
VARELA-LÓPEZ et al., 2015; VARELA-LÓPEZ et al., 2016). No campo da endodontia, modelos em animais também vêm demonstrando alterações na lipidemia: Conti et al., (2020) demonstraram que a indução de periodontite apical em animais ateroscleróticos induzidos por HFD elevou os níveis de triglicérides, mesmo na ausência de aterosclerose. De conformidade, Brasil et al., (2021) evidenciaram também o aumento dos níveis de Triglicérides nos animais alimentados com DHL e com exposição do canal pupar no total de 40 dias. Entretanto no presente estudo foi demonstrado apenas alterações nas lipoproteínas HDL e LDL apenas no grupo DHL, mesmo estando associada a PA (grupo DHLPA), demonstrando que a variável PA não influencia esses resultados. Portanto, é possível que a hiperlipidemia decorrente desse tipo de dieta aumente a suscetibilidade a certas doenças bucais, principalmente se levarmos em consideração que a inflamação que ocorre durante a periodontite pode contribuir para a dislipidemia (ABRAHAM et al., 2019).
A cronicidade do processo em questão tem relevantes implicações sobre o processo etiológico de numerosas enfermidades crônicas não transmissíveis, entre elas a aterosclerose, diabetes, obesidade (BARBOSA et al., 2010). Sendo assim, o estresse oxidativo ativa uma resposta específica frente ao estresse por meio de um mecanismo adaptativo que visa proteger as células contra a toxicidade mediada por espécies reativas de oxigênio (ROS) a fim de manter o equilíbrio redox dos tecidos (KURHALUK et al., 2018)
Os hábitos alimentares têm sido drasticamente modificados na maioria dos países, com expressivo aumento do consumo de dietas hipercalóricas, preferencialmente ricas em gordura e com baixo valor nutricional. O consumo crônico desses tipos de dietas pode gerar muitos problemas de saúde, principalmente por serem fatores de risco para uma série de comorbidades, incluindo diabetes tipo 2 e doenças cardiovasculares. Além disso, o consumo de DHL pode comprometer a
cicatrização óssea, com diminuição do conteúdo mineral ósseo e da densidade (TIBÚRCIO-MACHADO et al., 2021).
Estudos com diferentes modelos de animais em fase de crescimento, tais como ratos (ZERNICKE et al., 1995) e aves (ATTEH;LEESON, 1984) demonstraram que a ingestão de dieta rica em gordura saturada (ou rica em gordura saturada e sacarose) afeta negativamente a absorção de cálcio dietético e, consequentemente, afeta negativamente a mineralização óssea. Atteh et al.,(1984) observaram em galos alimentados com dietas suplementadas com 8% de ácido palmítico, durante 3 semanas, e encontraram uma redução significativa na massa de cinzas ósseas e no teor de cálcio ósseo, mesmo quando mais cálcio foi adicionado à dieta rica em gordura, ele não foi absorvido, e o cálcio extra da dieta foi excretado. Zernicke et al.,(1995) relataram uma redução significativa nas propriedades materiais e estruturais do osso cortical para ratos em crescimento alimentados com uma DHL e sacarose, (DHLS) em comparação com ratos alimentados dieta padrão. Tais alterações ósseas relacionadas à dieta hiperlipídica supracitada estão: a hipercalciúria resultante da hiperinsulemia e a redução da absorção intestinal de cálcio (WOHL et al., 1998)
Brasil et al., (2021) investigaram a influência de uma HFD na progressão da periodontite apical e observaram que lesões apicais foram significativamente maiores no grupo HFD em comparação com o grupo controle. A análise histológica confirmou que as lesões apicais eram maiores e revelaram um infiltrado inflamatório mais grave no grupo HFD. A densidade mineral óssea foi reduzida no grupo HFD em comparação com os grupos controles. Entretanto o presente estudo não evidenciou alterações significativas no infiltrado inflamatório. De igual modo, o estudo de Tiburcio-Machado et al.,(2021) demonstrou que embora os ratos alimentados com DHL apresentaram maior PA do que aqueles alimentados com dieta padrão, o infiltrado inflamatório local foi semelhante em ambos os grupos.
Inicialmente, a melatonina esteve associada, sobretudo, à organização dos ritmos circadianos, indução natura do sono, regulação dos ciclos reprodutivos sazonais (CIPOLLA-NETO;AMARAL, 2018). Estudos já demonstraram que a MEL é uma molécula versátil que apresenta um papel neuroprotetor, antienvelhecimento e anticancerígeno, além de antioxidante e anti-inflamatórios (SANTOS et al., 2018).
Com relação a essas duas últimas características, estudos científicos vêm demonstrando que a MEL exerce efeitos anti-inflamatórios ao interferir com a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1, e IL-6 (YU et al., 2017).
Considerando tais propriedades biológicas, é de extrema relevância avaliar os potenciais efeitos desta molécula, principalmente no campo da endodontia.
A primeira indicação de que MEL poderia ser um sequestrador direto de radicais livres foi relatada por Ianas et al. (1991) e Tan et al. (1993), que forneceram fortes evidências de que a ME é altamente eficaz na desintoxicação do radical hidroxila (•OH), desintoxicando uma variedade de radicais livres, como peróxido de hidrogênio (H2O2), radicais peroxil (LOO•), ânion peroxinitrito (ONOO-), oxigênio singlete (1O2), óxido nítrico (NO•), ânion superóxido (O2 •- •) e peroxidação lipídica.
A ME é considerado um poderoso antioxidante, capaz de reprimir o estresse oxidativo por eliminação direta de radicais livres, estimulação de enzimas antioxidantes e quelação de metais de transição, ou seja, também atenua patologias relacionadas ao estresse oxidativo, reduz a apoptose celular e preserva a função celular (GOC et al., 2017).
Outro aspecto importante para ressaltar é o fato do tratamento com MEL levou a diminuição nos depósitos de gordura na região periepididimal, redução das concentrações plasmáticas de TNFα, redução da insulinemia e melhora na resistência insulínica. A MEL participa na regulação do metabolismo e balanço energético no nosso organismo (SZEWCZYK-GOLEC et al., 2017). Muitos processos metabólicos no tecido adiposo, incluindo a expressão e secreção de algumas adipocinas, estão sob controle circadiano. Essa regulação pode ser mediada, pelo menos em parte, pela MEL, que pode ter ações sobre o tecido adiposo branco por meio de seus receptores de membrana ou ação sobre o sistema nervoso simpático ou pela expressão circadiana de inúmeros genes envolvidos no metabolismo lipídico (DE FARIAS TDA et al., 2015; SZEWCZYK-GOLEC et al., 2017). Além disso, a MEL também promove a melhora no perfil lipídico em diferentes modelos animais de obesidade induzidos por dieta hiperlipídica (PRUNET-MARCASSUS et al., 2003; HUSSAIN, 2007; AGIL et al., 2011; XUE-DONG WAN, 2013).
Agil et al., (2012) investigaram os efeitos da ingestão de MEL sobre a homeostase da glicose em ratos diabéticos obesos, e também observaram que a administração oral de MEL desempenhou um efeito anti-hiperglicêmico devido à
melhora na função das células β pancreáticas. Um estudo randomizado duplo-cego controlado realizado por HUSSAIN et al. (2006) demonstrou que pacientes diabéticos tratados com doses orais diárias de MEL mostraram uma melhora no controle glicêmico pós-prandial e diminuição do nível de hemoglobina glicada.
O presente estudo demonstrou que o tratamento com MEL diminuiu os níveis de TNF-α nos grupos PAMEL, DHLMEL e DHLPAME, além de redução dos níveis de IL-1β nos grupos PAMEL e DHLMEL, com exceção do grupo DHLPAMEL.
Além disso, o tratamento com MEL diminuiu a concentração plasmática de LPS apenas no grupo DHLMEL. Nosso dados corroboram com estudo de Tavares et al., (2021) que demonstrou que a MEL reduziu os níveis de IL-1β em animais com PA.
Outros modelos experimentais também demonstraram os benefícios da MEL na redução do TNF-α em patologias orais. Li et al., (2015) observaram que ratos com pulpite aguda, tratados com ME, apresentaram redução significativa das concentrações plasmáticas de TNF-α. Corroborando com esses achados, o estudo de Santos et al., (2018), desenvolvido em nosso laboratório, evidenciou que ratos com doença periodontal tratados com melatonina também obtiveram redução das concentrações plasmáticas de TNF-α.
A redução na expressão da proteína IRF-3 foi observada nos grupos PAMEL e DHLMEL. No entanto, no grupo DHLPAMEL não foi observada a redução na expressão de IRF-3. No entanto, Wie et al.,(2020) observaram que em camundongos db/db com nefropatia diabética tipo II, os níveis de expressão de TLR4, MyD88, TRIF e p-IRF-3 foram significativamente maiores em db/db, e o tratamento com ME diminuiu os níveis de expressão dessas proteínas.
Embora este estudo não tenha evidenciado a redução dos níveis de mRNA da via do TLR-4 e sua via de sinalização, o modelo experimental proposto por Xia et al., (2012), analisou os efeitos na modulação das vias de sinalização dependentes de MyD88 em linhagem de células de macrófagos (células RAW264.7) e demonstraram que : 1) O LPS não teve efeito na expressão de mRNA de TLR4, porém a melatonina aumentou ligeiramente a expressão de mRNA de TLR4 às 6 horas após o tratamento com LPS; 2) a melatonina teve pouco efeito na elevação induzida por LPS da proteína MyD88 2 horas após o tratamento com LPS, entretanto, a melatonina aliviou significativamente a elevação de MyD88 após 6 horas do tratamento com LPS; 3) o LPS regulou positivamente a expressão de mRNA de IRF7 e o tratamento com
melatonina reduziu esses níveis 6 horas após o tratamento com LPS, por outro lado o nível de mRNA de IRF3 não aumentou significativamente 6 horas após o tratamento com ME.
Deve-se notar que o fator de transcrição NF-κB modula por meio de uma relação bi-direcional entre a glândula pineal e o sistema imunológico. Na glândula pineal, o NF-κB reduz a transcrição de arilalquilamina N-acetiltransferase (AANAT) em pinealócitos reduzindo a produção de ME. Curiosamente, a MEL também é produzida endogenamente por células imunocompetentes de maneira dependente do NF-κB promovendo um aumento na atividade da AANAT. Assim, a ME produzida por macrófagos desempenha um papel duplo. Em concentrações mais baixas (pM a nM gama), aumenta a sua capacidade fagocitária, enquanto em altas concentrações, contribui para o retorno das células ao estado quiescente, prejudicando assim a atividade do NF-κB e evitando a síntese excessiva de mediadores inflamatórios (MARKUS et al., 2013; MARKUS et al., 2018).
Com relação aos efeitos da MEL no perfil lipídico, o presente estudo demonstrou que a melatonina reduziu os níveis de LDL e promoveu aumento de HDL nos grupos DHLMEL e DHLPAMEL. Hussain et al., (2007) demonstrou que a administração de MEL em ratos alimentados com uma dieta rica em colesterol levou a uma redução significativa no CT devido a uma redução acentuada no VLDL. Os autores argumentaram que essa redução significativa no VLDL após o tratamento com MEL pode ser devido à redução na síntese e secreção de VLDL pelo fígado ou devido à diminuição da secreção de VLDL do intestino (HUSSAIN, 2007). Santos et al., (2018) utilizou animais pinealectomizados para mostrar que as alterações no perfil lipídico, como aumento dos níveis de LDL, VLDL, TG e a diminuição de HDL, foram revertidas com o tratamento com MEL.
Qual é a evidência molecular que pode ser encontrada atualmente para apoiar a hipótese de que a ME afeta o metabolismo do colesterol? Em um extensa revisão de literatura realizada por Karolczak e Watala (2019) foi relatado que experimentos realizados em células HepG2 incubadas com ácido oleico e tratadas com ME mostraram que a expressão de 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA redutase e proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 2 (SREBP-2) permaneceu inalterado na presença de ME. No entanto, a ME aumentou a expressão do receptor α ativado por proliferador de peroxissoma (PPARα) e seu gene alvo, carnitina